WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 11 |

«гематология Под общей редакцией доктора медицинских наук, профессора К. М. Абдулкадырова.Г о с у д а р с т в е н ны й научная би^б^ C Университет ...»

-- [ Страница 1 ] --

гематология

Под общей редакцией

доктора медицинских наук,

профессора К. М. Абдулкадырова

.Г о с у д а р с т в е н ны й

научная би^б^

C

Университет

http://www.bestmedbook.com/

Москва эксмо)

Санкт-Петербург «Сова»

, Vi

О

УДК 616

ББК 54.11

Г 33

Оформление художника Е. Брынчик

Гематология: Новейший справочник / Под общ. ред.

Г 33

К. М. Абдулкадырова. — М.: Иза-во Эксмо; СПб.: Изд-во

Сова, 2004. - 928 с, илл.

ISBN 5-699-05074-4

В справочнике изложены современные аспекты теоретической и клинической гематологии, приведены самые последние данные о кроветворении, морфологии и функциях клеток крови и костного мозга, гемопоэтического микроокружения, а также сведения о цитогенетике, иммуногематологии, иммуногистохимии и системе гемостаза. Представлены современные методы диагностики и лечения заболеваний системы крови, рассмотрены вопросы их этиопатогенеза.

Издание предназначено для врачей гематологов, терапевтов, онколо гов, лаборантов, а также студентов медицинских учебных заведений.

УДК 616 ББК 54.11 © К. М. Абдулкадыров, Т. А. Андреева, B. А. Балашова, С. С. Бессмельцев, Л. Н. Бубнова, Т. В. Глазанова, C. В. Грицаев, Ю. Л. Кацадзе, Ю. А. Криволапое, М. С. Мартынкевич, С. И. Моисеев, Н. А. Романенко, В. И. Ругаль, И. Г. Самускевич, В. Ю. Удальева, Е. Р. Шилова, А. В. Шмидт, 2004 © Оригинал-макет. ООО «Сова», 2004 ISBN 5-699-05074-4 © ООО «Издательство «Эксмо», 2004 http://www.bestmedbook.com/ ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие 7 Часть 1



ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ

Глава 1. Кроветворение. Номенклатура клеток костного мозга и крови.

К. М. Абдулкадыров, В. А. Балашова Глава 2. Пункция костного мозга. Методика его исследования.

Миелограмма. К. М. Абдулкадыров, В. А. Балашова 34 Глава 3.Морфология и функции клеток костного мозга и крови.

В. А. Балашова

Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга. Стромальное микроокружение:

структурная организация и участие в гемопоэзе. К. М. Абдулкадыров, В.И.Ругалъ Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга. В. А. Балашова 75 Глава 6. Клеточные культуры в гематологии. В. А. Балашова 100 Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах.

К. М. Абдулкадыров, И. С. Мартынкевич Глава 8. Клиническая иммуногематология. Л. Н. Бубнова 145 Глава 9. Иммуногистохимия. Ю.А. Криволапое 164 Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз). Т. В. Глаэанова 221 Глава 11. Современное представление о системе гемостаза. Ю. Л. Кацадзе 231

–  –  –

КРОВЕТВОРЕНИЕ.

НОМЕНКЛАТУРА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И КРОВИ

Кроветворение, или гемопоэз — это сложный многоэтапный процесс образования в специализированных органах клеток крови.

Как образуются первые кроветворные клетки?

В результате дробления оплодотворенной яйцеклетки формируется бластоциста, затем бластула и гаструла. Внутренняя клеточная масса бластоцисты (ВКМ) содержит 30-150 эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Это поистине стволовые клетки, клетки-прародительницы, обладающие тотипотентностью, т. е. способностью давать начало как собственно эмбриону, так и всем без исключения клеткам и тканям организма. На стадии гаструлы в результате сложных перемещений клеток образуется 3 зародышевых листка — экто-, мезо- и эндодерма. Мезодерма — средний зародышевый листок — дает начало костному мозгу, крови, сердечно-сосудистой системе. Мезенхима, называемая иногда 4-м зародышевым листком, также является производной мезодермы и дает начало костям, хрящам, мышцам, дерме и всей соединительной ткани организма. Формирование органов из ЭСК, включая гемопоэтические — костный мозг, тимус, селезенку, лимфоузлы, Пейеровы бляшки, мукозоассоциированную лимфоидную ткань, — осуществляется благодаря транскрипции генов, реализующих генетическую программу в клетке. В частности, известна роль ядерных Часть 1. Теоретическая гематология белков GATA-2* в развитии ранних кроветворных предшественников (Martin D. I. К. ct al., 1990; Romeo P. H. el al., 1990).

Кроветворение у человека начинается на 3-4-й неделе гестации одновременно в желточном мешке (внеэмбриональное кроветворение), а также в самом эмбрионе и хорионе (внутриэмбриональное кроветворение) в виде кровяных островков, окруженных клетками эндотелия, происходящего, по-видимому, из общих с гемопоэтическими стволовых клеток (Приндулл Г., 1998). К. Choi и соавторы (1998) подтвердили идею существования бшготентных гемангиобластов, прослеживая путь развития кроветворной клетки по схеме: мезодерма—эндотелий—кровь. Однако еще в 1932 г.

А. В. Румянцев отметил, что «как кровяные клетки, так и сосуды, по которым движется кровь, — дериваты мезенхимы». М. Tavian и соавторы (1996) показали, что в области парааорталыюй спланхоплевры эмбриона одновременно с желточным мешком возникают первые стволовые кроветворные клетки (СКК), которые мигрируют затем в фетальную печень, костный мозг и другие места гемопоэза. Только эти клетки по праву могут называться стволовыми кроветворными, но в силу сложившейся традиции это название сохранилось и за некоторыми более поздними их потомками.

В период гаструляции ЭСК начинают формировать гемопоэтическую мезенхиму (Приндулл Г., 1998), а также синтезируется экстрацеллюлярный протеиновый матрикс, включающий фибронектин, ламинин и коллаген; экспрессируются рецепторы молекул клеточной адгезии — интегрины; секретируются цитокины. Эндотелиальные клетки, сливаясь в капилляры, соединяют желточный мешок с эмбрионом. По этим капиллярам из желточного мешка на 4й неделе гестации двигаются примитивные гемопоэтические клетки и колонизируют образующуюся к тому времени печень.

На 8-10-й неделе происходит колонизация вилочковой железы.

Таким образом, закладка кроветворной системы осуществляется при координированном взаимодействии трех клеточных пулов — производных мезодермы — гемопоэтического, стромального и сосудистого.

Первыми клетками, которые к концу 4-й недели образуются в желточном мешке, являются примитивные эритробласты-мегалоGATA — семейство ядерных белков, которые наряду с другими факторами транскрипции генов не только ответственны за пролиферацию и дифференцировку стволовых кроветворных клеток (GATA-2), но и участвуют в закладке эритропоэза и синтезе глобина, в развитии мегакариоцитопоэза (GATA-1, GATA-5). базофилов и нейтрофилов (GATA-1) и Т-лимфоцитов (GATA-3).

Глава 1. Кроветворение 11 бласты, синтезирующие фетальный гемоглобин.

На 4-5-й неделе развития эмбриона в желточном мешке возникают различные генерации кроветворных клеток, в том числе полипотентные клетки-предшественники гранулоцито-эритро-моноцито-мегакариоцитопоэза, образующие в агаре смешанные колонии в составе этих клеток — КОЕ-ГЭММ (колониеобразующие единицы гранулоэритро-моноцито-мсгакариоцитопоэза). Данные клетки экспрессируют рецепторы ранних миелоидных стволовых клеток CD34 (CD — кластер дифференцировки, т. е. группа дифференцировочных антигенов). Одновременно с ними в желточном мешке появляются биопотентные грануломоноцитарные клетки-предшественники, способные образовывать в условиях клеточных культур колонии из гранулоцитов и моноцитов, поэтому их называют КОЕ-ГМ. В эти же сроки развития эмбриона в желточном мешке также обнаружены эритроидные клетки-предшественники. По способности образовывать в культуре крупные эритроидные колонии из нескольких агрегатов — бурсты или просто эритроидные колонии — их называют соответственно бурстобразующими единицами эритропоэза (БОЕ-Э) и колониеобразующими единицами эритропоэза (КОЕ-Э) (Migliaccio G., 1986; Приндулл Г., 1998). Активный гемопоэз в желточном мешке продолжается до 8-й недели и полностью заканчивается к 16-й неделе (Чертков И. Л. и др., 2002).

Эмбриональная печень, закладка которой происходит на 4-й неделе развития, становится главным местом гемопоэза. Это второй, печеночный, период кроветворения. Печеночная ткань представлена гепатоцитами — производными эндодермы и кроветворными клетками — производными мезодермы. К 30-му дню в эмбриональной печени определяются первые гемопоэтические клетки, несущие маркер ранних кроветворных клеток-предшественников — CD34. В эмбриональной печени гемопоэз в основном эритроидный, позже, в фетальной печени, усиливается миелоидный гемопоэз и количество гранулоцитов, макрофагов и мегакариоцитов возрастает (Балашова В. А., Абдулкадыров К. М., 1984). К 9-й неделе в печени плода наблюдается В-лимфопоэз (Tavian M. et al, 1999 a, b).





Третий период кроветворения происходит в костном мозге, и его начало относится к 11-12-й неделе развития плода. Хрящевой скелет образуется уже у 6-8-недельного эмбриона. Костные рудименты окружаются сетью капилляров, клеток-предшественников остеобластов и макрофагов. Макрофаги быстро переваривают хрящ, оставляя небольшие островки хондроцитов, где при участии остеобластов начинается процесс костеобразования, и к 10-й неделе 12 Часть 1. Теоретическая гематология между костными трабекулами образуются большие сосудистые синусы и костномозговые полости (Charbord P. et al, 1996). К 11-й неделе в костном мозге начинается активный гемопоэз и количество эритроцитов и гранулоцитов быстро увеличивается. С этого времени костный мозг навсегда становится главным местом гемопоэза у человека.

Всю общность гемопоэтических клеток во взрослом организме весьма условно подразделяют на 5-6 этапов дифференцировки, границы которых размыты и которые содержат много переходных промежуточных форм (Чертков И. П. и др., 2002). В процессе этих дифференцировок происходит постепенное снижение пролиферативной активности клеток и их потентности, т. е. способности развиваться сначала во все кроветворные линии, а затем во все более ограниченное количество линий. В схеме (рис. 1) приведены последовательные этапы развития кроветворных клеток, начиная от тотипотентных стволовых клеток и заканчивая зрелыми элементами крови.

Пул поли- или мультипотентных СКК (II отдел) образуется из тотипотентной ЭСК, стоящей на самом верху этой иерархической лестницы (I отдел).

В эмбриональном периоде ЭСК экспрессируют гены, индуцирующие дифференцировку в направлении гемопоэза, что инициирует возникновение СКК и начало кроветворения. Количество СКК невелико — около 0,01% (Шкловская Е. В. и др., 1998), а вместе с потомками — клетками-предшественниками — около 0,05% (Weissman I. L. et al., 1997). Их морфологические характеристики не выяснены, однако предполагают, что они подобны лимфоцитам малого и среднего диаметра. Методы их исследования не морфологические, а функциональные, и информация о них получена экспериментальным путем. В отличие от тотипотентной клетки СКК не обладают неограниченным пролиферативным потенциалом и не являются бессмертными. Возможно, что нелимитированное самовозобновление и бессмертность СКК явились бы условием, угрожающим их жизни, так как подобные клетки скорее подвержены неоплазии (Ploemacher R. Е., 1999). В настоящее время доказана полипотентность данных клеток, способность развиваться во все 8 линий гемопоэза, а также способность к Ограниченному самоподдерживанию ранних СКК (Воробьев А. И. и др., 1985, 2002). Их саморепликация ограничена, как полагают, приблизительно 50 клеточными делениями (Vaziri H. et al., 1994), однако они поддерживают продукцию клеток крови в течение всей жизни индивидуума.

Большая часть СКК находится в состоянии покоя, в глубоком реГлава 1. Кроветворение 13 зервс, обладая при этом огромным пролиферативным потенциалом (Чертков И. Л. и др., 2002; Ploemacher R. Е., 1999). Согласно характеристикам и свойствам этих клеток, полученным экспериментальным путем, гетерогенный пул СКК II отдела подразделяют на клетки, способные:.

1) репопулировать кроветворение смертельно облученных мышей длительно (в течение всей жизни) — КРКМ-Д или кратковременно - КРКМ-К;

2) формировать колонии в селезенке смертельно облученных мышей через 8 или 12 дней — колониеобразующие единицы селезенки - КОЕс-8 дн., КОЕс-12 дн.;

3) образовывать в длительной культуре через 5 недель на адгезивном слое так называемые области «булыжника» — очень плотно прилегающие друг к другу клетки бластного типа — КООБ-5 нед.

СКК, имплантированные в организм животных, демонстрируют клональный рост, т. е. формируют клоны-колонии, состоящие из однотипных клеток различных клеточных линий, или смешанные, что является доказательством их полипотентности (способности развиваться во все клеточные линии). Полипотентность СКК доказана также с помощью метода маркирования отдельных СКК чужеродным геном (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 1996; Lemischka I. R. et al., 1986; Keller G. et al., 1990). Перенос гена производится благодаря встраиванию в ДНК клетки специального ретровируса.

Имплантированные в организм облученной мыши «меченные» таким образом СКК способны полностью репопулировать кроветворение животного, а донорские клетки обнаруживаются в различных участках его кроветворной системы.

Ранние CD38 СКК экспрессируют антиген CD34, который является их маркером, и рецепторы к фактору стволовой клетки (ФСК), фактору, подобному тирозинкиназе (ФЛТ 3-лиганд); рецептор к интерлейкину 6 (IL-6R); рецептор к CD45 (CD45R). Однако среди ранних СКК выделены клетки, не экспрессирующие CD34 — CD34 CD38CKK. Возможно, они являются предшественниками CD34XKK (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2001).

По мере снижения пролиферативного потенциала СКК дифференцируются в полиолигопотентные коммитированные клеткипредшественники (III отдел). (Коммитирование — от англ. commit — принятие на себя обязательств.) Клетки этого уровня имеют уже ограниченную потентность, так как коммитированы к дифференцировке в направлении лишь 2-5 гемопоэтических клеточных линий. В этот отдел включены клетки, способные образовывать в 14 Часть 1. Теоретическая гематология

–  –  –

Рис. 1. Схема кроветворения (И. Л. Чертков, Н. И. Дризе, А. И. Воробьев, М. Д. Бриллиант;

схема из кн.: Руководство по гематологии / Пол ред. А. И. Воробьева.

М, 2002. Т. 1.) ЭС — эмбриональная стволовая клетка; СКК -- стволовая кроветворная клетка;

КРКМ-Д — клетка, репопулирующая костный мозг длительно; КРКМ-К — клетка, репопулирующая костный мозг кратковременно; КОЕс-12 дн. (8"дн.) — колониеобразующая единица селезенки, дающая колонии через 12 дней (8 дней): КООБ-э нед. — клетка, образующаяся в культуре области «булыжника» через 5 недель; КОЕ-Бл — колониеобразующая единица бластная; КОН-ВВП — колониеобразующая единица высокого пролиферативного потенциала; КОЕ-ГЭММ — колониеобразующая единица гранулоцитарная,-эритроцитарная, моноцитарная (макрофагальная), мегакариоцитарная; КОЕ-ГМ — колоГлава 1. Кроветворение 15

–  –  –

ниеобразующая единица гранулоцитарно-моноцитарная (макрофагальная); КОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитарная; КОЕ-М — колониеобразующая единица моноцитарная (макрофагальная); КОЕ-Баз — колониеобразующая единица базофильная ц тучноклеточная; КО К-Эоз — колониеобразующая единица эозинофильная; КОЕНейтр — колониеобразующая единица нейтрофильная; КОЕ-Э -- колониеобразующая единица эритроцитарная; КОЕ-Мгкц — колониеобразующая единица мегакариоцитарная; БОЕ-Э — бурстообразующая единица эритроцитарная; пре-Т — клетка-предшественник Т-лимфоцитов; пре-В — клетка-предшественник В-лимфоцитов.

16 Часть 1. Теоретическая гематология культуре бластные колонии (КОЕ-Бл), клетки, дающие в культуре рост смешанных колоний, состоящих из гранулоцитов, эритроидных клеток, макрофагов, мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), и 2потентные КОЕ (в любом составе). КОЕ-ГЭММ являются общим предшественником миелопоэза. Они несут маркер CD34, а также маркер, специфичный для клеток миелоидной линии, — CD33 и детерминанты гистосовместимости — HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-DR. Ранние эритроидные предшественники экспрессируют стволовоклеточный антиген CD34, ранний миелоидный CD33 и антигены HLA-DR. Поздние эритроидные предшественники несут на мембране рецепторы к эритропоэтину и трансферрину и специфический маркер гликофорин А. Их способность образовывать колонии в полутвердых и вязких культуральных средах под влиянием колониестимулирующих факторов (КСФ) позволила доказать их существование и способность данных клеток к клональному росту.

Клетки IV отдела — коммитированные предшественники отдельных клеточных линий являются моноолигопотентными. Они коммитированы в направлении 1-2-й клеточных линий. Среди них находятся: КОЕ-Г — клетка-предшественник нейтрофилов, эозинофилов, базофилов; КОЕ-Мгкц — предшественники мегакариоцитов; БОЕ-Э и КОЕ-Э — предшественники эритроидных клеток;

КОЕ-Баз — предшественник базофилов; КОЕ-М —предшественник моноцитов и макрофагов; КОЕ-ГМ — общий предшественник гранулоцитов и макрофагов; КОЕ-Эоз — предшественник эозинофилов; КОЕ-Нейтр — предшественник нейтрофилов; предшественники Т- и В-лимфоцитов — пре-Т и пре-В клетки. КОЕ-ГМ экспрессируют CD34, CD33, HLA-DR и антиген более зрелых миелоидных клеток — CD 13, по мере созревания которых на мембране унипотентных моноцитарных и гранулоцитарных КОЕ появляются новые маркеры, но они утрачивают антиген CD34. Близость путей дифференцировки эритроидных и мегакариоцитарных предшественников, существование бипотентных бурстобразугощих единиц эритро-мегакариоцитопоэза (БОЕ-ЭМгкц), выделенных из фракции CD34+CD38* клеток, доказаны цитогенетически (McLeod D. L.

et al., 1980) и методом клеточных культур, где общий предшественник этих двух линий требует для пролиферации комбинации фактора стволовой клетки (ФСК), интерлейкина-3 (ИЛ-3) и эритропоэтина (ЭРП) (Hunt P., 1995; Debili N. et. al., 1996).

V отдел морфологически узнаваемых клеток включает дифференцирующиеся, созревающие и зрелые клетки всех 8 клеточных линий, начиная с бластов. Морфоцитохимическая характеристика Глава 1. Кроветворение 17 в световом микроскопе позволяет идентифицировать большинство бластных клеток этого уровня. Таким образом, собственно стволовыми кроветворными могут быть названы только клетки I отдела и ограниченно — II отдела, длительно репопулирующие костный мозг, или СКК, получаемые в длительных культурах на стромальной подложке — LTCIC (Longterm Culture Initial Cells — клетки, инициирующие длительную культуру), обладающие, как известно, высокой способностью к самоподдержанию. Эти СКК не несут лииешгоспецифических маркеров и дают рост всем линиям гемопоэтических клеток (Weissman 1. L. et al., 1997). В норме они находятся в состоянии глубокого покоя (Laitha L. G., 1963; Ladd А. С. et al., 1997; Traycoff С. М. et al., 1998).

Известно, что отдел стволовых кроветворных клеток представляет из себя пул клеток с различной потентностью и пролиферативным потенциалом. Истинные стволовые кроветворные клетки, единые для всех кроветворных линий, существование которых гениально предсказал Maximov А. А. (1909), располагаются, возможно, в отделе мезенхимальных клеток, или гемангиобластов (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2001).

Изучение СКК сопряжено с решением многих проблем, связанных с трудностью их выделения, расшифровки механизмов регуляции на клеточном и молекулярном уровне, направляющих клетку на путь самоподдержания или дифференцировки. Знание этих механизмов имеет большое значение для понимания патогенеза лейкозов.

В последние годы широко обсуждается вопрос о способности СКК к дедифференцировке и трансдифференцировке, о так называемой пластичности СКК. Под пластичностью СКК понимают способность развиваться в другие типы клеток, не свойственные им в норме. Трансдифференцировка СКК предполагает перепрограммирование ее генома, что позволило бы ей проявить истинную мультипотентность, если не тотипотентность.

Недавние исследования поколебали представление об СКК как о клетках, потенциал которых ограничивается лишь дифференцировкой в клетки крови, т. е. гемопоэтической специализацией.

Пластичность СКК внутри гемопоэтической системы давно доказана. Однако множество работ сообщают о том, что любой тип тканей взрослого организма имеет свои стволовые клетки, способные при трансплантации репопулировать гемопоэтическую систему. Появилось большое количество сообщений о способности СКК при определенных условиях развиваться в клетки неродственных тканей — кле ГК8ЁС.К научная би Инв.№

•О 18 Часть 1. Теоретическая гематология клетки ЖКТ (Okada Т. S., 1991; Shi Q. et a]., 1998; Krause D. S. et al., 2001; Kornblung M. et al., 2002). E. Lagasse и соавторы (2000) показали в экспериментах на мышах трансформацию СКК в гепатоциты. Т. R. Brazelton с соавторами (2000) и Е. Mezey с соавторами (2000) сообщили о трансформации СКК мышей в нейроны головного мозга и способности СКК преодолевать барьер между кровью и головным мозгом. По данным К. A. Jackson и соавторов (1999) и С. R. Bjornson и соавторов (1999), стволовые мышечные или нейральные клетки способны мигрировать в костный мозг и производить там клетки крови. Slack I. M. W., Tosh D. (2001), Tosh D., Slack I. M. W. (2002) в экспериментах на животных показали, что взрослые стволовые клетки способны продуцировать дифференцированные клетки из неродственных тканей. По их мнению, подобная метаплазия показывает, что обязательства, взятые на себя клеткой в период эмбриогенеза, могут быть полностью отменены.

В работах D. Orlik и соавторов (2001) и К. A.Jackson и соавторов (2001) было показано, что клетки донорского костного мозга трансформировались в клетки миокарда и сосудов у мыши с экспериментальным инфарктом.

В то же время существует очень много критических замечаний по поводу заявлений о возможности трансдифференцировки клеток взрослого организма (Дыбан А. П., Дыбан П. А., 2002; Morrison S. I., 2001; Abkowitz I. L, 2002; Orkin S. H., Zon L. I., 2002).

Учитывая, что гепатоциты, эпителий кишечника и клетки крови происходят из разных зародышевых листков, выводы о возможности их трансдифференцировки в клетки других тканей вызывают много вопросов. Действительно ли тогда специализированные ткани происходят из соответствующих специальных листков? Ведь этот факт всегда был главным принципом, догмой эмбриологии.

Однако то, что негемопоэтические клетки могут быть получены из клеток костного мозга, еще не доказывает, что они происходят из СКК. Причиной может быть то, что обогащенная стволовыми кроветворными клетками клеточная взвесь, используемая для трансплантации, может содержать как гемопоэтические предшественники, так и прекурсоры, коммитированные в направлении других негемопоэтических линий. Доказано, что костный мозг содержит мезенхимальные, эндотелиальные клетки, способные развиваться в различные негемопоэтические ткани — остеокласты, хондроциты, адипоциты, эндотелий (Сухих Г. Т. и др., 2002). Очевидно, что костный мозг может также содержать различные эндодермальные предшественники, способные развиваться в клеточные компоненты пищеварительной системы, а их физические и Глава 1. Кроветворение 19 фенотипические свойства могут способствовать их попаданию в обогащенную популяцию СКК (Dorshkind К., 2002). Кроме того, полагают, что СКК могут находиться в покоящемся состоянии не только в костном мозге, но и в других негемопоэтических тканях (Kawada H., Ogawa ML, 2001; Lewis R., 2002). Terada N. и соавторы (2002) и Ying Q. L. с соавторами (2002) показали в эксперименте, что происходит не трансдифференцировка, а слияние клеток донора и реципиента, в результате чего клетки реципиента приобретают донорский фенотип. К тому же, существование во взрослом организме тотипотентных эмбриональных клеток, а также плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток многими исследователями уже не подвергается сомнению (Weissinan I. L, 2000; Сухих Г. Т. и др., 2002). Авторы полагают, что эти клетки способны, по-видимому, покидать зоны своего распределения и мигрировать, циркулируя в кровотоке. Источником ЭСК в экспериментальных условиях является внутренняя клеточная масса (ВКМ) in vitro фертилизированной человеческой бластоцисты (Schuldiner M. et al., 2000). ЭСК имеют также и гемопоэтический потенциал. Они персистируют в организме, очевидно, в очень небольших количествах и пребывают в состоянии глубокого покоя. ЭСК взрослого организма могут быть коммитированы к образованию эндо-, мезо- или эктодермы и могут либо циркулировать в крови, либо оставаться в тканях, в том числе и в костном мозге. Под влиянием сигналов микроокружения их потенциал может быть реализован (Gussoni E. et al., 1999; Lagasse E.

et al., 2000; Krause D. S. et al., 2001; Dorshkind K., 2002). Тотипотентность ЭСК, имеющих неограниченный потенциал, обеспечивается выключением программы специализации клеточных линий. Если тотипотентную клетку удастся выделить из тканей, то окажется, что отвергать концепцию эмбриогенеза о зародышевых листках преждевременно (Dorshkind К., 2002). В настоящее время обсуждают роль микроокружения тотипотентных клеток, способного сыграть решающую роль в их судьбе. С одной стороны, индуцирующие сигналы могут вызвать экспрессию определенных генов и дифференцировку ЭСК в направлении этой ткани. Так, в костном мозге эти клетки могут быть стимулированы к развитию в СКК, чей потенциал ограничен клетками крови. С другой стороны, микроокружение может ингибировать другие программы развития ЭСК, к которым она потенциально способна, и если эти негативные сигналы ослабеют, то в ткани могут появиться клетки, не характерные для нее. Это скорее объяснило бы метаплазию в тканях, чем возможность трансдифференцировки стволовых клеток. Решение этих вопросов нуждается в дальнейших исследованиях.

20 Часть 1. Теоретическая гематология Конечной целью процесса кроветворения является образование зрелых, функционально полноценных клеток крови — лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов.

Гемопоэз — очень динамичная, четко сбалансированная и непрерывно обновляющаяся система. В постнатальном периоде он происходит в плоских костях скелета, а также в позвонках, проксимальных отделах бедренных и плечевых костей, лимфоузлах, селезенке, тимусе. Ежесуточно в организме человека весом около 70 кг вырабатывается более 300 миллиардов клеток: 20 х 10" — эритроцитов, 45 х 10" — нейтрофилов; 109 — моноцитов, 175 х 109 — тромбоцитов (DanceyJ. Т. et al, 1976; Erslev A. I., 1983; Огава М„ 1990).

В течение жизни у человека в среднем вырабатывается приблизительно 460 кг эритроцитов, 5400 кг гранулоцитов, 40 кг тромбоцитов, 275 кг лимфоцитов; всего — 5-6 т. Это обеспечивается за счет пролиферации и дифференцировки СКК и их коммитированных потомков. В крови взрослого человека в каждый данный момент находится около 25 х 1012 эритроцитов, 15 х 10 й тромбоцитов и 3 х 109 лейкоцитов. Более 300 млн клеток производится в каждую минуту жизни человека (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2002). Кроветворный красный костный мозг располагается среди элементов кости и стромы, образующих его микроокружение. Кость, ее балки и трабекулы образуют главную опорную структуру, ограничивающую зоны кроветворения. Клеточными элементами костной ткани являются остеобласты, остеокласты и остеоциты. Строма, или подстилка из клеток, является производной мезенхимы и состоит из большого количества высокоспециализированных клеток — адипоцитов, фибробластов, эпителиальных, адвентициальных, эндотелиальных, ретикулярных клеток. Строму также образуют кровеносные сосуды, нервные окончания и макрофаги. Производным стромы является внеклеточный матрикс, включающий коллагеновые и ретикулиновые волокна и серию нерастворимых белков — фибронектин, ламинин, тромбоспонин, тенасцин, гликозаминогликаны и др. Гемопоэтические клетки находятся в тесном контакте с клетками стромы. Адгезивное межмембранное взаимодействие клеток стромы и гемопоэтических клеток обеспечивает передачу регуляторных сигналов и необходимых клетке веществ. В этом процессе большую роль играют молекулы клеточной адгезии, относящиеся к мембраносвязанному классу регуляторов гемоноэза (Ploernacher R., 1999) и являющиеся производными клеток стромы. Главный маркер СКК — CD34 также является молекулой клеточной адгезии и поэтому участвует в адгезии СКК со стромальными клетками костного мозга. В костном мозге находятся СКК и Глава 1. Кроветворение 21 все их потомство, в том числе ранние предшественники лимфопоэза. Окончательная дифференцировка В-лимфоцитов завершается в лимфоузлах, селезенке и Пейеровых бляшках. Специализация и дифференцировка Т'лимфоцитов осуществляется в вилочковой железе.

Процесс кроветворения в костном мозге схематично можно представить следующим образом: костные трабекулы, клетки стремы и прежде всего фибробласты, эндотелиальные и адвентициальные клетки образуют в костях полости, ниши или синусоиды, в которых в виде гроздьев размещаются кроветворные клетки (Натан Д. Г., Зифф К. А., 1994; Spardling A. et al, 2001). Это отдельные клоны, содержащие клетки различной степени зрелости. Полагают, что СКК и их потомство находятся в кроветворных зонах преимущественного расположения миелоидных или эритроидных клеток (Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А., 1980; Wolf N. S., 1978; Трентин Д. Д., 1982). Ниши не омываются кровью, и система полностью замкнута. Ниши являются смежными с венозными синусами, у них общие стенки, выстланные со стороны венозного синуса эндотелием, а со стороны гемопоэтических ниш — адипоцитами, клетками адвентиция, между которыми находится базальная мембрана. Созревшие клетки должны преодолеть этот барьер в виде стенки, чтобы оказаться в венозном синусе, а затем в кровотоке.

Показано, что в определенных нишах находятся клетки различных кроветворных ростков, а на границах ниш кроветворение смешанное. Способность гемопоэтических клеток распознавать соответствующие клетки стромы и размещаться в своих определенных зонах называется хомингом.

Созревая, клетка продвигается ближе к стенке венозного синуса. Теперь она должна протиснуться между слоями клеток стенки.

Для этого в цитоплазме эндотелиальных клеток находятся отверстия в 1-2 мкм, через которые клетки могут проходить, если обладают достаточной эластичностью. Клетки с поврежденными или потерявшими эластичность мембранами не могут пройти через отверстия и расщелины в стенке и гибнут. В прохождении нормобластов через стенку принимают участие макрофаги, освобождающие нормоцит от ядра. Мегакариоциты плотно прижаты к промежуткам между клетками стенок, их цитоплазма в виде отростков выпячивается в эти трансмуральные отверстия и отделяет в просвет венозного синуса тромбоциты (Натан Д. Г., Зифф К. А., 1994).

Иногда созревшие клетки могут проходить непосредственно через мегакариоциты. Это явление, называемое эмпериополезисом, опосредовано способностью мегакариоцитов к эндоцитозу — захвату 22 Часть 1. Теоретическая гематология других гемопоэтических клеток. В норме только зрелые, функционально полноценные клетки крови проходят через барьер и попадают в кровеносное русло. Способность зрелых клеток покидать нишу и перемещаться в направлении стенки венозного синуса называется хемотаксисом. Этот процесс опосредован влиянием на клетку специальных веществ — хемоаттрактантов, продуцируемых пристеночными клетками.

Регуляция гемопоэза

Процессы регуляции кроветворения до сих пор изучены недостаточно. «...Мы по-прежнему не понимаем, как регулируется сложный процесс вступления стволовой клетки в цикл и выбор ею направления дифференцировки» (Чертков И. Л. и др., 2002). Необходимость непрерывно поддерживать гемопоэз, адекватно отвечать на все запросы организма, удовлетворяя его потребности в различных специализированных клетках, обеспечивать постоянство и равновесие внутренней среды — гомеостазис — все это предполагает существование сложных и тонких регуляторных механизмов, действующих по принципу обратной связи. В первую очередь таким регулятором являются сами СКК и их коммитированные потомки, обеспечивающие поликлональный гемопоэз, а также индуцирующее гемопоэз микроокружение (ИГМ). Микроокружение играет огромную роль в регуляции гемопоэза. Клетки стромы, наряду с гемопоэтическими и некоторыми соматическими клетками, а также молекулами экстрацеллюлярного матрикса продуцируют регулирующие гемопоэз факторы — цитокины. Особая роль принадлежит классу мембраносвязанных глюкозаминогликанов. Гемопоэз инициируется этими факторами и непрерывно поддерживается благодаря пулу СКК. Как уже упоминалось, пул СКК мал и, так как он находится у истоков гемопоэза, бесценен для организма, и поэтому должны быть механизмы, защищающие его от истощения.

СКК покоятся в специальных нишах и почти не отвечают на сигналы, запросы организма, на гуморальные факторы регуляции (Laitha L. G., 1979). Полагают, что их количество регулируется стохастически, т. е. случайно. Регуляция пула СКК осуществляется в соответствии с некой генетически обусловленной случайной вероятностью пролиферации и дифференциации, как бы заданной периодичностью этих процессов (Чертков И. Л., Гуревич О. А., 1984; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985; Гольдберг Е. Д. и др., 2000; Laitha L. G., 1963; Nakahata et al, 1982; Mctcalf D., 1984; OraваМ., 1990).

Глава 1. Кроветворение 23 Стволовые кроветворные клетки стромозависимы и воспринимают короткодистантные регулятор.

ные стимулы, получаемые ими при тесном межклеточном контакте с клетками стромального окружения. Однако существуют основания полагать, что регуляция СКК не ограничена влиянием только корохкодистантных стимулов и что факторы ИГМ влияют на СКК, находящиеся в кроветворных зонах преимущественного расположения миелоидных и эритроидных предшественников (Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А., 1980; Wolf N. С, 1978; Трентин Д. Д., 1982). По мере дифференциации клетка начинает отвечать на дальнедействующие гуморальные стимулы. Эндогенная регуляция всех звеньев гемопоэза осуществляется цитокинами, которые инициируют клеточную пролиферацию, дифференциацию, воспаление, иммунный ответ, апоптоз.

Влияние цитокинов осуществляется через рецепторы на клеточной мембране, которые проводят сигнал в клеточное ядро, где происходит активация соответствующих генов. Цитокины включают в себя интерлейкины, имеющие цифровые обозначения (ИЛ-1, ИЛ-2 и т. д.), и ростовые факторы, включая колониестимулирующие факторы (КСФ) с буквенными обозначениями. Основными продуцентами цнтокинов являются моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты и стромальные элементы — фибробласты, эндотелиальные клетки и др. (Лурия Е. А., Фриденштейн М. Я., 1981; Теста Н., 1991).

Стволовые кроветворные клетки самообновляются медленно и при готовности к дифференцировке (процесс коммитирования) выходят из состояния покоя (С(1-фаза клеточного цикла) и становятся коммитированными. Это значит, что процесс стал необратимым и такие рестриктированные клетки, управляемые соответствующими цитокинами, пройдут все стадии развития вплоть до конечных зрелых элементов крови, т. е. «погибнут через дифференцировку» (Till J. E., McCulloch Е. А., 1961). Стволовые кроветворные клетки способны дифференцироваться в одном из трех главных направлений гемопоэза: миелоидном, В- и Т-лимфоцнтарном. Факторы регуляции гемопоэза подразделяют на близкодистантные (для СКК) и дальнедействующие гуморальные ростовые факторы для коммитированных предшественников и других дифференцирующихся и созревающих клеток. В зависимости от уровня развития клетки факторы регуляции делятся на 3 основных класса.

1. Факторы, влияющие на ранние СКК. К ним относятся: фактор стволовой клетки (ФСК, или фактор Стила), ФЛТ 3лиганд, колониестимулирующий фактор для гранулоцитопоэза — Г-КСФ, ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-12, а также ингибиторы, 24 Часть 1. Теоретическая гематология которые тормозят выход СКК в клеточный цикл из состояния покоя, — воспалительный белок макрофагов (М1Р-1а, ф ), трансформирующий рост фактор (TGF-(3), фактор некроза опухоли (ФНО), кислые изоферритины и др. Фактор стволовой клетки экспрессируется фибробластами и эндотелиальными клетками стромы. Он действует на СКК непосредственно, инициируя их вхождение в клеточный цикл, или влияет на клетку как ко-стимулятор других цитокинов, например ИЛ-3, являясь синергическим цитокином (Bernstein I. D. et al., 1991). Эта фаза регуляции СКК не зависит от запросов организма.

2. Срсднедействующие линейно неспецифические факторы:

ИЛ-3, ИЛ-4, ГМ-КСФ (КСФ для грануломоноцитопоэза).

3. Позднедействующие линейно специфические факторы, которые поддерживают пролиферацию и созревание коммитированных предшественников и их потомков. Они включают:

для эритроидной серии клеток — гормон эритропоэтин (ЭРП), для мегакариоцитов — гормон тромбопоэтин, а также ИЛ-5, М-КСФ и Г-КСФ (Чертков И. Л. и др., 2002: Огава М., 1990; Натан Н., Зифф К, 1994).

Эритроидные предшественники отличаются по чувствительности к ЭРП, которая возрастает по мере их созревания. Ранние эритроидные прекурсоры (БОЕ-Э) для своего развития нуждаются в специфическом стимуляторе роста — бурстстимулирующей активности (БСА). Наибольшей чувствительностью к ЭРП обладают КОЕ-Э. Присутствие этого гормона также требуется при развитии эритробластов. иначе клетка погибнет.

Ингибиторы гемопоэза являются плеотропными факторами, которые могут оказывать как стимуляторное, так и ингибиторное влияние на различные клетки. Например, TGF-P, стимулирует предшественников миелопоэза — поздние КОЕ-ГМ и в то же время прямо ингибирует все виды ранних гемопоэтических предшественников (Axelrad А. А., 1990; Ploemacher R. E. et al., 1993). Для взаимодействия клеток со стимуляторами и ингибиторами роста необходима локальная презентация этих факторов. Вероятно, контакты клетка—клетка, клетка—экстрацеллюлярный матрикс опосредованы молекулами адгезии. Кроме этих факторов предположительно существуют и другие, более интимные уровни регуляции СКК, включающие соединение внутриклеточных образований смежных клеток через места соединения — лакуны, окна.

К регуляторам гемопоэза относятся также некоторые интерфероны и ядерные белки, например семейства GATA. Стимуляторы и Глава 1. Кроветворение 25 ингибиторы действуют одновременно, одни и те же клетки вырабатывают как позитивные, так и негативные регуляторы, и этот синергизм определяет понятие «цитокинового каскада». Фаза регуляции гемотюэза средне- и позднедействующими цитокинами является чувствительной к запросам организма. Благодаря влиянию этих факторов костный мозг способен быстро обеспечить потребности организма в специализированных клетках.

На смену представлению о бессмертии СКК и их неограниченном самоподдержании (способности к неограниченному количеству делений без снижения пролиферативного потенциала и воспроизведению абсолютно идентичных дочерних клеток) пришло понятие клональной сукцессии, смене клонов СКК в течение жизни организма. В 1965 г. Н. Е. М. Кау и соавторы предложили гипотезу о поочередном участии клонов СКК в гемопоэзе. Клоновая (каскадная) теория получила экспериментальное подтверждение и сегодня имеет много последователей (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 1996; Огава М., 1990). Было доказано, что на протяжении жизни индивидуума в организме существуют десятки одновременно функционирующих небольших короткоживущих клонов, состав которых меняется в течение 1-4 месяцев, а исчезнувшие клоны никогда больше не появляются. Авторы показали, что различные зоны и органы кроветворной системы заселены разными локально расположенными клонами, где СКК и совершают свой жизненный цикл.

Существуют СКК как глубокого, так и быстромобилизуемого резерва. Клетки последнего могут возвращаться в состояние покоя после 1-3 делений. Эти СКК, имеющие уже дифференцировочные маркеры, способны быстро отвечать на запрос организма. Согласно И. Л. Черткову и Н. И. Дризе СКК закладываются только в эмбриогенезе и затем экономно расходуются в течение жизни, образуя короткоживущие, сменяющие друг друга клоны. Следовательно, система структурирована таким образом, что, несмотря на отсутствие непрерывного самоподдержания индивидуальных СКК, имеет место самоподдержание всей популяции стволовых клеток в целом за счет непрерывно сменяющихся клонов.

Еще одним регулятором гемопоэза является апоптоз — запрограммированная клеточная смерть или генетически обусловленная программа самоубийства. Понятие «апоптоз» было введено J. F. R. Кегг с соавторами в 1972 г. Учитывая, какое огромное количество клеток крови вырабатывается в организме взрослого человека (более 300 г в сутки и около 5-7 т в течение жизни), очевидно, что для поддержания гомеостаза и сохранения клеточного баланса должен существовать механизм удаления избыточных 26 Часть 1. Теоретическая гематология клеток. Этим механизмом является апоптоз, и основной закон клеточной кинетики состоит в том, что в единицу времени рождается и умирает одно и то же количество клеток (Владимирская Е. Б. и др., 1997). Апоптоз необходим для элиминации поврежденных, старых и избыточных или потенциально опасных клеток. В организме происходит дифференцировка и активация большого числа лимфоцитов, и только часть их в результате селекции отбирается для выживания. Лимфоциты, не получившие сигналы выживания, погибают, при этом апоптозу подвергается 75% В-клеток-предшественников и 95% Т-клеток-предшественников (Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 2001). В норме апоптоз, в отличие от некроза, не представляет собою патологическую форму смерти клеток, и удаление умирающих клеток происходит без развития воспаления.

Апоптоз — это контролируемое самоперевариванис. в процессе которого клетка сморщивается, происходит конденсация и фрагментация ее ядра, разрушение цитоскелета. Фрагменты апоптической клетки поглощаются фагоцитами. Программа самоуничтожения клетки, для включения которой существуют внутренние и внешние сигналы, уравновешивается программой ее блокирования. Рецептор, воспринимающий сигнал клеточной смерти, называется АРО-1, или FAS, или CD95 (Nagata S., 1998). Апоптоз регулируется онкогеном р53 и семейством онкогенов BCL-2, причем ген р53 индуцирует апоптоз, a BCL-2 и BCL-X его блокируют.

Недавние работы показали, что митохондрии, семейство генов BCL-2 и клеточные белки семейства ICE (IL-1-converting enzime) взаимодействуют внутри клетки в регуляции апоптоза. Так, большая часть противоопухолевой терапии, такая как химиотерапия, облучение, опосредуют клеточную смерть через активацию белков ICE (Debatin K.-M., 1999). Эти механизмы еще недостаточно ясны, но нарушение взаимодействия апоптоз—ингибиция апоптоза может привести к развитию тяжелых заболеваний. В результате мутации гена р53 клетка теряет способность к апоптозу и могут возникнуть опухоль (рак, лейкоз) или аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка,-гломерулонефрит) (Thompson С. В., 1995). Повышенное саморазрушение клеток лежит в основе патогенеза таких заболеваний, как апластическая анемия, миелодиспластический синдром, СПИД, болезни Альцгеймера и Паркинсона (Барышников А. Ю., 2001; Maciejewski J. P. et al, 1995; Gersuk G. M. et al., 1996). Причиной возникновения опухоли может быть снижение противоопухолевого иммунного надзора вследствие усиления апоптоза иммунокомпетентных клеток. В здоГлава 1. Кроветворение 27 ровом организме эти процессы уравновешены и апоптоз является важным физиологическим регулятором гемопоэза.

Номенклатура клеток костного мозга и крови Костный мозг включает кроветворную ткань (паренхима — красный костный мозг) и клетки стромального микроокружения. Клетки стромы костного мозга представлены большим количеством высокоспециализированных элементов, принимающих прямое участие в регуляции гемопоэза. К ним относятся фибробласты, адипоциты (жировые клетки), эндотелиальные, эпителиальные, адвентициальные клетки. Среди клеток микроокружения кроветворной ткани обычно рассматривают и такие, как остеокласты, мастоциты, макрофаги, хотя они являются дериватами кроветворных клеток. К клеткам микроокружения относятся остеобласты, участвующие в образовании кости. Жизненный цикл пролиферирующих.

дифференцирующихся и созревающих кроветворных клеток совершается в костном мозге, подчиняясь сложным законам регуляции, опосредованным множеством взаимодействующих факторов, способных обеспечивать интерактивные связи клетки и ее микроокружения. К этим факторам относятся многочисленные цитокины, включающие ростовые стимулирующие факторы и ингибиторы роста, различные интерлейкины, а также интерфероны, ядерные белки, факторы внеклеточного матрикса, молекулы адгезии, гормоны, белки, контролирующие апоптоз, и др. Данные факторы действуют на кроветворные клетки, направляя их к пролиферации или дифференцировке, и многие из них продолжают оказывать свое влияние на клетки, циркулирующие и находящиеся в тканях.

Отдел морфологически узнаваемых клеток включает бластные клетки-предшественники зрелых клеток всех клеточных линий, которые, пройдя заключительные этапы дифференцировки, через несколько промежуточных стадий развития превращаются в зрелые клетки, готовые выполнять свои функции.

Первой морфологически распознаваемой клеткой нейтрофильного ряда в костном мозге является миелобласт. Его пролиферация и дифференциация под влиянием позднедействующих регуляторных факторов приводит последовательно к образованию нейтрофильного промиелоцита, миелоцита, метамиелоцита, палочкоядерного и сегментоядерного нейтрофилов.

Процесс дифференциации и созревания эозинофилов и базофилов происходит аналогично таковому у клеток нейтрофильного 28 Часть 1. Теоретическая гематология ряда: эозинофильный и базофильный бласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты и, наконец, палочко- и сегментоядерные эозинофилы и базофилы.

Монобласт является предшественником линии морфологически идентифицируемых моноцитарных клеток. Его дифференцировка и созревание приводят к образованию промоноцита, затем моноцита. Моноциты после циркуляции в периферической крови поступают в ткани, где превращаются в макрофаги.

В отделе морфологически распознаваемых клеточных элементов идентификация клеток эритроидной линии становится возможной начиная с эритробласта (проэритробласта). Последующая эритроидная дифференцировка приводит к образованию базофильного нормобласта (нормоцита), затем, по мере гемоглобинизации клетки, полихроматофильного и оксифильного нормобласта (нормоцита) — последней ядросодержащей клетки эритроидной линии. После энуклеации оксифильного нормобласта образуется ретикулоцит и наконец зрелый эритроцит.

Морфологическое распознавание клеток мегакариоцитарного ряда в костном мозге начинается с мегакариобласта. В результате эндомитоза и полиплоидизации мегакариобласт превращается в промегакариоцит, базофильный, полихроматофильный и оксифильный мегакариоциты. Эффекторными клетками мегакариоцитарного ряда являются тромбоциты, главным продуцентом которых служит полихроматофильный мегакариоцит.

Лимфобласты — клетки-предшественники Т- и В-лимфоцитов в составе V отдела кроветворных клеток — подразделяются на Т-лимфобласты и В-лимфобласты, количество которых в костном мозге слишком мало, а морфологические характеристики недостаточно убедительны для их распознавания.

Следующими за лимфобластами клетками этого ряда идут Т- и В-пролимфоциты, которые созревают в зрелые Т- и В-лимфоциты.

Жизненный цикл этих клеток после костного мозга проходит в основном в лимфоидных органах, куда они поступают после циркуляции в крови.

Продолжением В-лимфоцитарной серии клеток является линия плазматических клеток, которые берут свое начало от В-иммунобласта — активированного антигеном В-лимфоцита. В этом ряду самой молодой клеткой является плазмобласт, который созревает в проплазмоцит и плазмоцит — клетку иммунного ответа, продуцирующую антитела. Конечные стадии дифференциации и созревания клеток всех 8 клеточных линий преодолевают костномозговой барьер и поступают в кровеносное русло. Вместе с жидкой Глава 1. Кроветворение 29 частью (плазмой) клетки, именуемые форменными элементами, образуют периферическую кровь.

Огромный пул циркулирующих и функционирующих в тканях кровяных клеток представляет собою чрезвычайно гетерогенный состав. Это объясняется очень тонкой дальнейшей специализацией клеток и нахождением их в различных зонах распределения и влияния.

Клетки так называемой белой крови — лейкоциты — включают палочкоядерные и сстментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты и плазматические клетки. Клетки красной крови представлены ретикулоцитами и эритроцитами. Еще одна категория клеток — кровяные пластинки, или тромбоциты.

Непрерывное поступление этих клеток из костного мозга и естественная адекватная убыль обеспечивают постоянство и равновесие клеточного состава крови.

Литература

Афанасьев Б. В., Алмазов В. А. Родоначальные кроветворные клетки. Л.: Наука.

1985.204 с.

Балашова В. А., Абдулкадыров К. М. Клеточный состав гемопоэтической ткани печени и селезенки у плодов человека // Арх. анат., гнет, и змбр. 1984. Т. 4.

С. 80-83.

Барышников А. Ю. Программированная клеточная смерть (Апоптоз)// Онкогематология / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 36-43.

Владимирская Е. В., Масчан А. А., Румянцева А. Г. Апоптоз и сю роль в развитии опухолевого роста // Гематол. и трансфузиол. 1997. Т. 42. № 5. С. 4-9.

Воробьев А. И. Клетка // Руководство по гематологии / Под ред. А. II. Воробьева. М., 2002. Т. 1.С. 1-28. " Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Шерстобоев Е. Ю. Механизмы локальной регуляции кроветворения. Томск, 2002. С. 8-76.

Дыбан А. П., Дыбан П. А. Стволовые клетки в экспериментальной и клинической медицине // Мед. академ. журн. 2002. Т. 2, № 3. С. 3-24.

Лурия Е. А., Фриденштейн А. Я. О стромальной и Т-клеточной регуляции стволовых кроветворных клеток // Терапевт, архив. 1981. Т. 53, № 9. С. 116-120.

Натан Д. Г., Зифф К. А. Регуляция кроветворения // Гематол. и транефузиол.

1994. Т. 39, №2. С. 3-10.

Огава М. Стволовая кроветворная клетка: стохастическая дифференцировка и гуморальный контроль пролиферации // Гематол. и трансфузиол. 1990. Т. 35, № 2. С. 24-32.

Приндулл Г. Гемопоэз в желточном мешке // Гематол. и трансфузиол. 1998.

Т. 43, №3. С. 14-15.

Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.: Медицина, 1985.

2 т.

Сухих Г. Т., Малайцев В. В., Богданова И. М. Мезенхимальная стволовая клетка // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2002. № 2. С. 124-131.

Глава 2

ПУНКЦИЯ КОСТНОГО МОЗГА. МЕТОДИКА ЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ. МИЕЛОГРАММА

Пункция костного мозга производится главным образом при заболеваниях системы крови для оценки клеточного состава костного мозга и его функционального состояния, установления диагноза и уточнения стадии заболевания (рецидив, ремиссия при лейкозах), оценки эффективности проводимой терапии, исключения (или подтверждения) фазы лейкемпзации злокачественных лимфом, обнаружения метастазов рака.

Наиболее простой и доступный способ получения костного мозга из грудины, который применяется до настоящего времени, был предложен в 1927 г. М. И. Аринкиным. Пункция костного мозга производится специальными иглами (Кассирского, швейцарской фирмы Unimed, разовыми иглами итальянской фирмы Bauer и др.). Костный мозг получают посредством аспирационной биопсии в области тела грудины на уровне третьего-четвертого межреберий или в области рукоятки грудины, а также гребня или бугристости подвздошной кости. Место прокола обрабатывают раствором йода или другим антисептиком. Проводится местная анестезия 1раствором новокаина послойно: кожа—подкожная клетчатканадкостница.

Пункция костного мозга производится врачом в процедурном кабинете при соблюдении правил асептики. Пункционная игла и шприц должны быть тщательно стерилизованы и обезвожены эфиром. Иглу вводят строго перпендикулярно поверхности грудины в костномозговой канал; щиток иглы устанавливают на расстоянии 0,8-2 см от грудины, в зависимости от конституции пациента. После извлечения мандрена из иглы на нее насаживается 10-20-миллиметр. вый шприц и производится аспирация костного мозга, после чего иг.,у извлекают и обрабатывают место прокола антисептиГлава 2. Пункция костного мозга. Миелограмма 35 ком. Количество аспирированной взвеси клеток зависит от объема и характера предполагаемых исследований. Для целей диагностики достаточно 0,1-0,2 мл во избежание примеси крови, однако для проведения цитогенетических, культуральных, иммунологических, цитохимических и других исследований требуется несколько миллилитров костного мозга. Костный мозг из шприца помещают на парафинированное часовое или предметное стекло и часть материала немедленно вносят в пробирки для определения клеточности костного мозга и количества мегакариоцитов. Сразу после этого на предметных стеклах углом шлифованного стекла делают тонкие мазки для оценки клеточного состава костного мозга. Во избежание свертывания костного мозга все перечисленные процедуры делаются очень быстро.

Методика исследования

Подсчет миелокариоцитов производится в счетной камере Горяева под световым микроскопом. Пунктат разводят уксусной кислотой, для этой цели во время пункции в одну пробирку с 4 мл 3уксусной кислоты вносят 0,02 мл клеточной взвеси (для подсчета миелокариоцитов), во вторую пробирку с 0,4 мл уксусной кислоты помещают 0,02 мл клеточной взвеси (для подсчет;! мегакариоцитов). Содержимое пробирок тщательно перемешиьают п заполняют счетные камеры. Через 2 минуты в камере Горяеь а под микроскопом подсчитывают количество миелокариоцитов с пересчетом на 1 мкл. Подсчет ядросодержащих клеток костного мезга производят в 100 больших квадратах и искомую цифру определяют по формуле их 200x250 = п х500, х= где х — количество миелокариоцитов в 1 мкл пунктата;

п — количество миелокариоцитов в 100 квадратах сетки счетной камеры;

200 — разведение пунктата;

250 — множитель для приведения к 1 мкл.

Число миелокариоцитов в 100 больших квадратах достаточно просто умножить на 500. Нормальные показатели и количество миелокариоцитов колеблется в довольно широких пределах — от 42 до 195 х 109/л (Соколов В. В., Грибова И. А., 1972). Клиническое значение имеет как повышение, так и понижение клеточности костного мозга.

36 Часть 1. Теоретическая гематология Подсчет мегакариоцитов осуществляется в счетной камере Фукса -Розенталя. Разведенным пунктатом заполняют камеру и подсчитывают мегакариоциты на всей площади сетки камеры. При расчете на 1 мкл костномозговой взвеси используют формулу «х20, х= 3,2 где х — количество мегакариоцитов в 1 мкл взвеси;

п — количество клеток в камере;

20 — степень разведения;

3,2 — объем камер Фукса-Розенталя в мкл.

У здоровых людей нормальные показатели мегакариоцитов колеблются от 50 до 150 в 1 мкл (0,050-0,150 х 109/л) (Соколов В. В., Грибова И. А., 1972; Лабораторные методы исследования в клинике, 1987; Грибова И. А., Воробьев А. И., 2002; Медицинские лабораторные технологии, 1998).

Миелограмма Состав костного мозга в норме подвержен значительным колебаниям и зависит от возраста обследуемого, функционального состояния костного мозга в момент пункции и качества произведенной пункции. Разбавленность пунктата периферической кровью и фиброз костного мозга сильно влияют на клеточный состав миелограммы. В световом микроскопе анализируют мазки костного мозга, окрашенные принятым в лаборатории методом (по Романовскому-Гимзе, Нохту, Крюкову-Паппенгейму и др.). Анализ начинают с просмотра мазков под 100-кратным увеличением с целью определения клеточности пунктата, ориентировочной оценки его состава, количества мегакариоцитов, наличия атипичных клеток и их скоплений. Затем на окрашенный сухой мазок наносят каплю иммерсионного масла и начинают подсчет всех попадающих в поле зрения окуляра ядросодержащих клеточных элементов в количестве 500 или более клеток. Считают в различных участках нескольких (2-3) препаратов, используя 1000-кратное увеличение, иммерсионный объектив и счетные клавишные машинки. После подсчета 500 клеточных элементов определяют содержание всех клеток в составе их клеточных рядов (в %), располагая их в зависимости от стадии созревания. Распределенные таким образом клеточные элементы всех клеточных линий представляют собой миелограмму. В состав миелограммы входят все ядросодержащие клетки нейтрофильного ряда, начиная с миелобластов и заканчивая сегментоядерными нейтрофилами (в среднем 60,8%), все эозиноГлава 2. Пункция костного мозга. Миелограмма

–  –  –

Определяют лейкоэритробластическое соотношение (отношение клеток белого ряда к клеткам красного ряда), которое в норме равно 4 (3) : 1. При необходимости высчитывают индексы созревания нейтрофилов (0,6-0,8), эритрокариоцитов (0,8-0,9), парциальные эритрограммы и мегакариоцитограммы (Воробьев А. И., Часть 1. Теоретическая гематология 1985; Абрамов М. Г., Воробьев А. И., 2002). Миелограмму выписывают на специальном бланке, где кроме количественного анализа клеточного состава пунктата (содержание клеток в %) производят качественный анализ — морфологическое описание клеточных элементов в составе их клеточных рядов. Прежде всего дают оценку клеточностн пунктата, например: пунктат костного мозга клеточный, гиперклеточный, скудный или клеточность пунктата нормальная, умеренная, пониженная, повышенная. Затем дается описание каждого клеточного ряда, начиная с количества клеток и их соотношения внутри него. Употребляют выражения: росток сохранен, в пределах нормальных колебаний, на нижней границе нормы; или сужен, редуцирован, угнетен; или, напротив, усилен, раздражен, гиперплазирован. Отмечают увеличение или уменьшение содержания клеток какой-либо стадии созревания (например: содержание миелобластов увеличено до 15%), подчеркивают особенности морфологии клеток, их созревания, признаки дисплазии, наличие патологических включений в цитоплазме (палочки Ауэра в лейкозных миелобластах и др.) (Коленкин С. М., Михеева А. И., 1999).

Таким образом, после тщательного просмотра мазков, подсчета миелограммы и последующего анализа всех клеточных линий результат аналитического исследования мазков костного мозга выписывается на бланке с цифровой и описательной характеристиками пунктата, заключением по каждому клеточному ряду и предполагаемым диагнозом, основанным на данных лабораторных исследований.

Литература Абрамов М. Г., Воробьев А. И. Костный мозг, клеточный состав. Пункционная диагностика //' Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.,

2002. Т. 1.С. 47-53.

Грибова И. А., Воробьев А. И. Гематологическая норма // Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М„ 2002. Т. 1. С. 61-63.

Коленкин С. М., Михеева А. И. Основные правила исследования пунктата костного мозга // Клинич. лаб. диагностика. 1999. № 2. С. 41-43.

Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /11од ред. В. В. Меньшикова. М„ 1987. С. 140-145.

Медицинские лабораторные технологии: Справочник / Под ред. А. II. Карпищенко. СПб.: Интермедицина, 1998. 406 с.

Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.: Медицина, 1985.

Т. 2. 448 с.

Соколов В. В., Грибова И. А. Гематологические показатели здорового человека.

М„ 1972.

Глава 3

МОРФОЛОГИЯ И ФУНКЦИИ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И КРОВИ

Морфологическое распознавание клеток костного мозга становится возможным, начиная с бластных клеток V отдела костномозгового кроветворного пула (Чертков И. Л. и др., 2002). Властные клетки предшествуют созревающим и зрелым клеткам костного мозга и подразделяются на бласты миелоидной и лимфоидной линий. Миелопдные бластные клетки включают миелобласты, монобласты, эритробласты и мегакариобласты. Миелобласты подразделяются в свою очередь на 3 гранулоцитарных типа: бласты нейтрофильные, базофильные и эозинофильные. Лимфоидные клетки также имеют бласты, предшествующие В- и Т-лимфоцитам, а именно Т-лимфобласты и В-лимфобласты.

Нейтрофильные гранулоциты

Нейтрофильный миелобласт созревает из унипотентной клетки-предшественника гранулоцитопоэза и затем — нейтрофилопоэза (в агаровой культуре из колониеобразующей единицы гранулоцитопоэза — КОЕ-Г и колониеобразующей единицы нейтрофилопоэза — КОЕ-Нейтр). Его диаметр — 15-20 мкм, ядро круглое, с нежнозернистой структурой ядерного хроматина, 2-4 нуклеолами. Цитоплазма умеренная, голубого или синего цвета. Редкие миелобласты содержат в цитоплазме единичные азурофильные гранулы. Количество миелобластов в норме составляет в среднем 1% миелокариоцитов. Пролиферация и созревание миелобластов под влиянием специфических цитокинов приводит к образованию более зрелых клеток — промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов.

40 Часть 1. Теоретическая гематология Нейтрофильный промиелоцит — самая крупная клетка этого ряда, ее диаметр может достигать 25 мкм. Округлое ядро, расположенное несколько эксцентрично, имеет нежнозернистую структуру хроматина, четко прослеживаются 1-3 ядрышка. Цитоплазма более широкая, чем у миелобласта, голубая или базофильная и содержит яркую азурофильную (окрашивающуюся азуром) зернистость, которая представляет собою первичные лизосомальные гранулы. Гранулы содержат миелопероксидазу, кислую фосфатазу, (3-глюкуронидазу, арилсульфатазу, лизоцим, сульфатированные мукополисахариды, основные белки и др. На стадии промиелоцита начинают формироваться вторичные гранулы. В миелограмме определяется 1-4% промиелоцитов.

Миелоцит — более зрелая клетка, ее размер меньше, чем размер промиелоцита (12-15 мкм). Это последняя клетка данного ряда, способная к делению. Эксцентрично расположенное овальное или бобовидное ядро отличается более грубой структурой хроматина.

В «молодых» миелоцитах можно видеть отчетливые нуклеолы, в более зрелых миелоцитах ядрышки не видны. Цитоплазма клетки уже не базофильная, а полихроматофильная, розоватая или сероголубоватая. Кроме первичных она содержит вторичные гранулы, более мелкие, розовато-коричневые, а позднее в ней появляются еще более мелкие — третичные гранулы. Маркером вторичных гранул является щелочная фосфатаза. Содержание миелоцитов в костном мозге колеблется от 7 до 12%.

Нейтрофильный метамиелоцит и все последующие стадии созревания клеток этой серии уже не способны к делению (Fibbe W. Е., Ploemacher R. Е., 1999). Диаметрметамиелоцита — 12-14мкм,ядро бобовидное, грубое, ядрышки не видны. Ядерно-цитоплазматическое соотношение низкое, цитоплазма светлая, розоватая и содержит мелкую специфическую зернистость. Содержание метамиелоцитов в костном мозге — 8-15%.

Небольшая часть палочкоядерных нейтрофилов и сегментоядерные нейтрофилы, представляющие из себя зрелые, функционально полноценные клетки, способны преодолевать костномозговой барьер и выходить в кровеносное русло. Ядро палочкоядерного нейтрофила лентовидной формы и может быть изогнуто в виде подковы, закручено и т. д. Ядро сегментоядерного нейтрофила имеет 2-4 фрагмента, соединенных мостиками из ядерной мембраны и тонких нитей хроматина. Структура хроматина грубая, цитоплазма розоватого цвета и содержит мелкую специфическую коричневатую зернистость и небольшое количество первичных азурофильных гранул. Содержание палочко- и сегментоядерных нейтрофиГлава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 41 лов в костном мозге колеблется от 25 до 47%. Увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов в периферической крови (в норме 2-3,5%) является чаще всего следствием воспаления, бактериальной инфекции. Сегментоядерные нейтрофилы созревают в костном мозге за 1-2 дня, после чего поступают в периферическую кровь, образуя 2 пула — циркулирующий и пристеночный, в соотношении 1 :3 (Френкель М. А., 2001). В крови нейтрофилы остаются 6-8 часов перед тем как проникнуть в ткани, где они выполняют свои основные функции фагоцитов (Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 1999). Среднее содержание клеток нейтрофильного ряда в костном мозге составляет около 60% миелокариоцитов.

Функции нейтрофилов

Нейтрофилы, называемые также микрофагами, являются главными эффекторными клетками при остром воспалении, первой линией защиты, и их основные функции заключаются в фагоцитозе — захвате и переваривании чужеродного материала (микробных агентов, грибов и других частиц) и секреции цитокинов. Работы И. И. Мечникова (1898) явились пионерскими в открытии явления фагоцитоза, а П. Эрлих (1900) обосновал секреторную способность нейтрофилов. Учитывая относительно ограниченную длительность их жизни, понятно, что большие количества нейтрофилов должны ежедневно восполняться, особенно при возникновении инфекции, когда их количество увеличивается в 10-30 раз. Во взрослом организме в 1 минуту продуцируется до 120 млн нейтрофилов (Dexter Т. М., 1984). Быстрая трансмиграция нейтрофилов через клетки эндотелия опосредована действием многих цитокинов, в том числе хемокинов, которые являются медиаторами воспаления, активируя нейтрофилы. Они продуцируются многими клетками крови и тканей, и прежде всего моноцитами, макрофагами, Т-лимфоцитами, нейтрофилами, фибробластами и эндотелием сосудов, на поверхности которых происходит маргинация нейтрофилов. К хемокинам для нейтрофилов относятся ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО (фактор некроза опухоли) и др. Хемоаттрактантной активностью — способностью обеспечить направленное движение фагоцита к очагу воспаления — обладают также некоторые компоненты системы комплемента; пептиды, секретируемые тучными клетками; гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ); эндотоксины бактерий; N-формил-олиго-пептиды (FMLP), выделяемые из бактерий; содержимое лизосом разрушаЧасть 1. Теоретическая гематология ющихся нейтрофилов; вазоактивные амины (серотонин, гистамин) и многие другие факторы. Прикреплению нейтрофилов к эндотелию сосудов способствуют молекулы адгезии — интегрины, к которым нейтрофилы экспрессируют рецепторы. После трансмиграции пейтрофилов в ткань и их встречи с антигеном начинается сложный процесс фагоцитоза — захвата чужеродного объекта нейтрофилом. Нейтрофил может захватывать только опсонизированные частицы. Опсонизация осуществляется специфическими сывороточными факторами, опсонинами, которые обволакивают бактерии или другие антигены, готовя их к фагоцитозу. К опсонинам относятся некоторые компоненты системы комплемента, иммуноглобулины, фибронектин, липополисахарид-связывающий белок (LBP) и другие факторы, которые соединяются со специфическими антигенами бактерий и обеспечивают их адсорбцию к нейтрофилу. Далее нейтрофил путем инвагинации мембраны формирует фагосому, окружающую объект фагоцитоза, и замыкает его в полости фагосомы. Гранулы нейтрофила перемещаются к фагосоме и проникают в нее. Происходит внутриклеточная дегрануляция.

Внутри образованной фаголизосомы происходит киллинг микроорганизмов протеолитическими ферментами, содержащимися в гранулах, а также за счет образующихся в результате «респираторного взрыва» перекиси водорода и гидроксильных радикалов при кислородзависимом механизме киллинга. Последняя стадия фагоцитоза — переваривание. В результате эффективного фагоцитоза нейтрофил погибает. Секреторная функция нейтрофилов опосредована наличием в их гранулах многих секреторных продуктов, взаимодействующих как с микроорганизмами, так и с окружающими тканями. Нейтрофилы высвобождают активные вещества путем внутриклеточной (при фагоцитозе) и внеклеточной дегрануляции. При внеклеточной дегрануляции, когда объект слишком велик и не может быть включен в фагосому, происходит экзоцитоз — выброс содержимого гранул в межклеточное пространство.

Нейтрофил взаимодействует с инфицированной клеткой также через межклеточные контакты. В месте контакта образуются трансмембранные каналы, через которые проходит секреторное содержимое гранул нейтрофила, и это может привести к дегенерации клеточных органелл и ядра зараженной клики и ее деструкции.

Факторами лнзосомальных гранул являются протеазы, фосфолипазы, гликозидазы. лизоцим, другие белки и пептиды, лактоферрин и эластаза (Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1983; Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 1999). Первичные и вторичные гранулы нейтрофилов содержат более 20 протеолитических ферментов.

Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 43

Эозинофильные гранулоциты

Эозинофильный миелобласт происходит из монопотентной эозпнофилыюй клетки-предшественника. Существуют доказательства, что эозинофилы имеют также общую с базофилами бипотентную клетку-предшественника (Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 2001). Эозинофильный миелобласт редко встречается в костном мозге, и распознавание клеток этой линии начинается с зозинофильного промиелоцита. Это крупная клетка с округлым тонкодисперсным ядром и 2-3 нуклеолами. Цвет цитоплазмы плохо различим из-за обилия зернистости. На стадии промиелоцита наблюдаются 2 вида гранул: преобладающие первичные крупные почти базофильные гранулы и специфические вторичные эозинофильные (окрашиваются кислым эозином). Вторичные гранулы активно формируются в основном на стадии миелоцита. Миелоцит имеет меньший диаметр, более грубое округлое ядро, плохо контурируемые ядрышки. Цитоплазма заполнена обильной специфической эозшюфи.тьной зернистостью ярко-оранжевого цвета и содержит очень мелкие третичные гранулы, содержащие кислую фосфатазу и арилсульфатазу. Входящая в состав вторичных гранул эозинофильная пероксидаза вместе с перекисями и галлоидами обеспечивает киллерный, противопаразитарный эффект эозинофилов.

Миелоцит созревает в метамиелоцит, затем в палочко- и сегментоядерный эозинофил. Диаметр последнего 12-15 мкм. Ядро менее фрагментировано, чем у зрелого нейтрофила, и обычно состоит из двух долей. В костном мозге эозинофилы остаются в течение 2дней, а в кровеносном русле — 6-12 часов, затем мигрируют в ткани. Тканевые эозинофилы расположены в слизистых тканях дыхательного, пищеварительного и мочеполового трактов, ближе к поверхности. Эозинофилы составляют 0,4-5% (в среднем 2,5%) миелокариоцитов костного мозга.

Функции эозинофилов Главные функции эозинофилов — клеток иммунной системы — заключаются в участии в механизмах защиты при гельминтозах, паразитозах и в. реакциях гиперчувствительности немедленного типа, связанных с острой аллергией. Эозинофилы предупреждают генерализацию иммунного ответа. В уничтожении антигенов (паразитов, аллергенов) участвуют различные факторы, включая гистамин базофилов и тучных клеток (Струков А. И., Кауфман О. Я..

1989). Эозинофилы контролируют избыточное выделение гистамина и нейтрализуют его. Они способны ограничить очаг поражеЧасть 1. Теоретическая гематология ния с помощью местного некроза и фиброзирования вокруг этого участка (Виноградова Ю. Э., 2002). Эозинофилы способны быстро проникать из сосудистого русла в ткани и концентрироваться там в больших количествах в очаге поражения. Это приводит сначала к эозинофилопении, так как эозинофилы не формируют пристеночный пул, но ответное усиление продукции эозинофилов в костном мозге сопровождается нормализацией их уровня в периферической крови и затем эозинофилией (Тотолян А. А., ФрейндлинИ. С, 2001).

Факторами активации эозинофилов служат липиды (лейкотриены), пептиды, белки (иммуноглобулины, в частности IgG), компоненты комплемента (СЗа, С5а), некоторые цитокины (ИЛ-3, ИЛ-5-и ГМ-КСФ — колониестимулирующий фактор для грануломоноцитопоэза). Хемотаксическими факторами для эозинофилов, опосредующими их движение к месту поражения в тканях, являются гистамин, иммунные комплексы, ИЛ-8, воспалительный белок макрофагов (М1Р-1а) и фактор RANTES (регулятор активации, экспрессируемый и секретируемый Т-лимфоцитами) — один из основных хемоаттрактантов для эозинофилов. RANTES способен быстро и в больших количествах рекрутировать эозинофилы в очаг поражения.

Эозинофилы обладают цитотоксичностью по отношению к гельминтам. Они способны соединяться с паразитами и вводить содержимое своих гранул в их цитоплазму. Специфические белки цитоплазмы эозинофилов повреждают личинки паразитов. При реализации «респираторного взрыва» эозинофилы образуют активные метаболиты кислорода — токсичные кислые радикалы. Эозинофилы обладают способностью к фагоцитозу и киллингу чужеродных клеток. Они способны к фагоцитозу бактерий, грибов и других частиц, осуществляя сходный с нейтрофилами метаболизм и механизм дегрануляции, но не столь эффективный (Козинец Г. И., Макаров В. А., 1997). Эозинофильные катионные белки принимают участие в реакциях воспаления и механизме свертывания крови, повреждая эндотелий сосудов и эндокард при длительных гиперэозинофилиях.

Секреторная функция эозинофилов состоит, в продукции и секреции ИЛ-2, ИЛ-3, ФИО, ИЛ-4, ИЛ-5, ИНФ-у (гамма-интерферон). Цитоплазматические гранулы эозинофилов секретируют большое количество катионных белков, ферментов, в том числе эозинофильную миелопероксидазу, арилсульфатазу В, гистаминазу и фосфолипазу D, но не содержат, в отличие от нейтрофилов и моноцитов, лизоцим.

Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 45

Базофильные гранулоциты

Базофилы имеют монопотентную клетку-предшественника базофилов (в культуре клеток — КОЕ-Баз — колониеобразующая единица базофилов). Есть доказательства того, что базофилы имеют общую с эозинофилами бипотентную клетку-предшественника, дифференцирующуюся из общей гранулоцитарной клетки-предшественника (Тотолян А. А., Фрейдлин И. С, 2001). Базофильный бласт — очень редкая клетка, которую обычно не удается увидеть в костном мозге здорового человека. Базофильный промиелоцит и миелоцит также очень редкие клетки. Миелограмма содержит всего 0,1-0,5% этих клеток. Базофильный промиелоцит и миелоцит имеют ядра округлой или овальной формы с трудноразличимой структурой ядерного хроматина, особенно когда гранулы покрывают ядро клетки. Зрелые базофилы в диаметре составляют 8мкм, их ядра отличаются неопределенной формой, иногда билобулярной, лопастной и окрашены в фиолетово-розовый цвет.

В клетках этой линии определяется специфическая крупная метахроматическая (отличная от цвета красителя) темно-фиолетовая, не обильная зернистость. По причине ее водорастворимости она частично теряется при окраске, и на месте гранул остаются пустоты, вакуоли. Базофилы, как и тканевые тучные клетки (мастоциты), являются гистаминсодержащими клетками (Valent P. et al.,1990).

В процессе созревания базофилов и тучных клеток в зоне их пластинчатого комплекса происходит синтез гепарина и содержимое гранул формируется путем образования комплекса белок-гистамин-гепарин. Базофилы находятся в крови в течение 6 часов, после чего поступают в ткани, где по истечении 1-2 суток, после дегрануляции, выброса гистамина и других веществ погибают (Проценко В. А. и др., 1987).

В росте и созревании базофилов принимают участие ИЛ-3, ГМ-КСФ, ИЛ-5. В регуляции базофилов особая роль отводится ИЛ-4, для которого на его клеточной мембране имеется много рецепторов. ИЛ-4 — мультипотентный лимфокин, он играет важную роль в регуляции иммунного ответа и во взаимодействии различных гемопоэтических клеток. Существуют доказательства, что ИЛ-4 является важным медиатором роста и активации базофилов и тучных клеток, регулируя продукцию IgE и В-клеток (Valent P.

et al., 1990).

Количество базофилов возрастает при миелопролиферативных заболеваниях (хроническом миелолейкозе, истинной полицитемии, базофильных лейкозах) и уменьшается в начале воспалительного Часть 1. Теоретическая гематология процесса и особенно аллергических реакций типа крапивницы, бронхиальной астмы, характеризующихся гиперчувствительностью немедленного типа, за счет быстрого перехода базофилов в ткани. Тканевые тучные клетки очень варьируют в размерах (от 5 до 30 мкм). Они имеют неопределенное, скорее округлое ядро и большое количество довольно крупных красно-фиолетовых гранул. В них выявляют полисахариды, амины, металлы, ферменты, белки, ферменты триптазу и химазу. Триптаза снижает свертываемость крови и является маркером анафилактической реакции. Мастоциты содержат много органелл — рибосомы, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Рецептор к IgE является главным рецептором на поверхности тучных клеток, которые, как и базофилы, отвечают секрецией гистамина на опосредованную IgE активацию. Кроме того, они экспрессируют рецепторы к IgG, CD28 и молекулам адгезии. Тучные клетки наряду с базофилами ведут свое начало от общей клетки-предшественника гранулоцитопоэза (Чертков И. Л. и соавт., 2002). Доказательства того, что базофилы и тучные клетки принадлежат к одной и той же популяции клеток, приводят Т. Nakahata и соавторы (1982).

Клетка-предшественник тканевых базофилов зкспрессирует антиген CD34, маркер ранних миелоидных предшественников (Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 2001). Специфическим маркером мастоцитов является CD 123. В развитии тучных клеток принимают участие ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИНФ-у (гаммаинтерферон), TGF-p (трансформирующий рост фактор), ГМ-КСФ, IgE. В слизистых тканях описаны слизистые (атипичные) тучные клетки, которые называют глобулярными лейкоцитами. Тучная клетка представлена в тканях ЖКТ, легких, урогенитальном тракте, в соединительных тканях вблизи сосудов, в коже, дыхательных путях.

Функции базофилов и тучных клеток Базофилы и тканевые мастоциты способны к фагоцитозу, но их главная функция связана с высоким содержанием в их гранулах гистамина — главного медиатора реакции, гиперчувствительности немедленного типа (Струков А. И., Кауфман О. Я., 1989). Гистамин — двуосновной вазоактивный амин, вызывающий сокращение гладких мышц бронхов, трахеи, кишечника. Он повышает проницаемость СОСУДОВ крови и принимает участие в возникновении кожной гиперемии, аллергического ринита, астмы, оказывает хемотаксическое действие на нейтрофилы и эозинофилы. Гепарин, продуцируемый тучными клетками и базофилами, является антикоаГлава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 47 гулянтом. Среди многих его функций нужно отметить участие в регуляции клеточной пролиферации, подавление действия комплемента, стимуляцию фагоцитоза и пиноцитоза и др. Базофилы и тучные клетки могут быть источником образования и секреции ряда хемокинов и цитокинов, включая ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13, ГМ-КСФ, ФНО (тучные клетки), макрофагальный воспалительный протеин — MIP-loc (базофилы), фактор стволовой клетки (ФСК) и др. Секреции мастоцитами ИЛ-4 придают особое значение, так как он является одним из важных регуляторов В-лимфоцитов, базофилов, моноцитов, дендритных клеток и участвует в аллергических, противоопухолевых и противовоспалительных процессах (Виноградова Ю. Э., 2002). Базофилы секретируют также простагландины, тромбоксаны, лейкотриены, фактор хемотаксиса эозинофилов и нейтрофилов серотонин, протеазы, фактор активации тромбоцитов. Доказана способность тканевых базофилов к фагоцитозу—эндоцитозу.

Моноциты и макрофаги

Моноциты имеют общую с гранулоцитами клетку-предшественника и затем унипотентного предшественника моноцитарной линии (КОЕ-М - в культуре). Все клетки этой линии, особенно зрелые моноциты и макрофаги, относятся к системе мононуклеарных фагоцитов (СМФ) и занимают особое место в гемоиоэзе. R. Van Furth и соавторы обосновали выделение моноцитов и тканевых макрофагов, ранее объединяемых в ретикуло-эндотелиальную систему, в систему мононуклеарных фагоцитов — клеток с особыми функциями, что было официально утверждено в бюллетене ВОЗ в 1972 г. (Van Furth R. et al, 1968, 1972, 1979). Первой распознаваемой клеткой этого ряда является монобласт. Морфологически его трудно отличить от миелобласта. Это клетка диаметром 15-20 мкм, имеет овальное или круглое ядро с пежносетчатой структурой, 2нуклеолы, более широкую, чем у миелобласта, цитоплазму светло-серого или светло-голубого цвета без зернистости или со скудной пылевидной зернистостью. Следующая клетка — промоноцит, диаметром 11-15 мкм, характеризуется более грубым волокнистым хроматином ядра, имеющего овальную или бобовидную форму и слабоконтурируемые ядрышки. Цитоплазма промоноцита серо-голубая, довольно широкая и часто содержит нежную пылевидную азурофильную зернистость. Моноцит — зрелая клетка данной клеточной линии, диаметром 12-20 мкм, имеет ядро часто неправильной формы (бобовидное, рассеченное, лопастное), Часть 1. Теоретическая гематология светлую серо-голубую цитоплазму с пылевидной зернистостью.

В периферической крови моноциты образуют циркулирующий и пристеночный пулы. В тканях они создают субпопуляции дифференцированных органо- и тканеспецифических макрофагов. Моноциты циркулируют в крови от 12 до 48 часов перед тем, как мигрировать в ткани, где они превращаются в макрофаги (Яворковский Л. И., 1987: Fibbe М. Е., Ploemacher R. Е„ 1999). В крови моноциты составляют 1-5% лейкоцитов, в костном мозге 1-3% миелокариоцитов.

Регуляция роста и дифференцировки моноцитов и макрофагов осуществляется группой ростовых факторов — стимуляторов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, М-КСФ) и ингибиторов (интерферон-а и -р, простагландин, ИЛ-10). Часть моноцитов остается в костном мозге, где превращается в резидентные или оседлые макрофаги (Van Furth R. et al., 1979).

Функции моноцитов и макрофагов Одной из основных функций мононуклеарных фагоцитов является неспецифическая антибактериальная защита организма, которая обеспечивается способностью к фагоцитозу и секрецией цитокинов про- и противовоспалительного действия. Эти цитокины активируют и мобилизуют как моноциты и макрофаги, так и другие клетки иммунной системы — лимфоциты, NK-клетки, гранулоциты.

Миграция моноцитов в ткани опосредована действием молекул адгезии — интегринов — и активаторов моноцитов (хемоаттрактантов) — ИЛ-8, компонента комплемента С5а, тромбоцитактивирующего фактора (PAF), воспалительного макрофагального протеина (М1Р-1(3), макрофагального хемоаттрактантного протеина (МСР-1), фактора, ингибирующего миграцию (MIF) и др.

(Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 1999). Следующей после адгезии фазой является трансмиграция моноцита через эндотелий сосуда и движение к очагу воспаления под влиянием хемотаксических факторов, которыми могут быть эндотоксины бактерий, продукты деструкции ткани и др. Киллинг и переваривание микроорганизмов происходит при участии протеолитических ферментов, включая лизоцим и другие факторы. Характерным для моноцитарных макрофагов является метаболический, или респираторный, «взрыв» в процессе фагоцитоза, который проявляется повышенным потреблением кислорода и продукцией микробицидных кислородных радикалов, перекиси водорода и супероксиданиона, обладающих мощными цитотоксическими и бактерицидными свойствами (Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1983). В тканях, где моноциты/макроГлава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 49 фаги выполняют свои функции, они специализируются в иммунокомпетентные клетки 2 классов:

1-й — антигенперерабатывающие макрофаги;

2-й — антигенпредставляющие макрофаги.

Относящиеся к первому классу антигенперерабатывающие, или резидентные макрофаги называют также профессиональными фагоцитами. И. И. Мечников, открывший явление фагоцитоза как защитной функции организма против микробов, называл их «клетками-мусорщиками». Открытие И. И. Мечниковым фагоцитоза и его работы по иммунитету были удостоены Нобелевской премии.

Резидентные макрофаги — это большое сообщество клеток, которое включает фиксированные макрофаги печени, плевральные и перитонеальные макрофаги, альвеолярные макрофаги легких, макрофаги соединительной ткани, клетки микроглин, астроциты, макрофаги селезеночных синусов, костномозговые макрофаги, макрофаги лимфоузлов; в почках — интрагломерулярные и мезангиальные макрофаги, гигантские клетки очагов воспаления и другие.

Эти клетки имеют различные морфологические характеристики и функциональные особенности, но их принадлежность к единой клеточной линии, моноцитарное происхождение подтверждается наличием ряда общих свойств — они содержат большое количество фермента лизоцима (мурамидазы), неспецифическую моноцитарную эстеразу, кислую фосфатазу и сходный иммунофенотип, в частности они экспрессируют моноцитарный антиген CD 14. Данные клетки характеризуются также очень развитым лизосомальным аппаратом (Лукина Е. А., 2002). Это оседлые макрофаги, не способные к рециркуляции. Продолжительность их жизни исчисляется месяцами и годами. Диаметр тканевых макрофагов колеблется от 18 до 80 мкм (Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Они имеют рыхлое, относительно небольшое ядро без четких ядрышек, широкую, слабо очерченную голубую или светло-серую цитоплазму, содержащую гранулы и вакуоли. В световом микроскопе можно видеть клетки с пенистой цитоплазмой, фагировавшие липиды, — липофаги или пигментофаги, фагировавшие гемоглобин. При некоторых заболеваниях (гистиоцитозах, лейкозах) можно видеть макрофаги, фагировавшие другие клетки, например эритрофаги.

Пул макрофагов пополняется за счет моноцитов периферической крови, так как их способность к делению очень ограничена. Их основной функцией является фагоцитоз микроорганизмов, фрагментов клеток, циркулирующих иммунных комплексов и других частиц. Они осуществляют также пиноцитоз — поглощение растворимого антигена. В процессе фагоцитоза макрофаги включают 50 Часть 1. Теоретическая гематология в свою цитоплазму объект фагоцитоза и формируют фагосому, в которой под влиянием лизоцима и других ферментов происходит киллинг и переваривание фагоцитированного материала.

Второй класс — антигенпредставляющие (антигенпрезентируюгдие) макрофаги (Van Furth R. et al, 1979; Knight S., Stagg A., 1993). К ним в настоящее время относят в основном дендритные клетки (ДК). Морфология большинства дендритных клеток имеет звездчатую форму со множеством тонких отростков — дендритов.

Эта форма и их подвижность позволяют Д К задерживать антигены и фиксировать их, а также взаимодействовать с Т-лимфоцитами.

В тканях они часто находятся в незрелом состоянии. Активацию ДК инициирует встреча с антигеном — микробами или продуктами воспаления. Активаторами ДК являются ИЛ-1, ГМ-КСФ, ФНОос, бактерии, липополисахариды микробов. ИЛ-10 блокирует процесс активации ДК. В процессе созревания ДК их способность активировать лимфоциты увеличивается (Птушкин В. В., 2001).

Дендритные клетки продуцируют ИЛ-8, ИЛ-12, MIP-а и р\ Этапы презентации антигена включают захват антигена и его ферментативную обработку, транспортировку пептидных фрагментов антигена — эпитопов — в соединении с главным комплексом гистосовместимости I и II на поверхность дендритной клетки для презентации и распознавания Т-лимфоцитами. Активированные дендритными клетками Т-лимфоциты осуществляют запуск иммунных реакций, стимулируя В-лимфоциты к продукции антител. Таким образом, клетки СМФ обеспечивают специфический иммунный ответ организма.

Антигенпредставляющие ДК — иммунные акцессоры, включают клетки Лангерганса (эпидермоциты), интердигитачьные Д К и дендритные ретикулярные ДК (интерстициальные ДК) (Птушкин В. В., 2001). Клетки Лангерганса (КЛ) расположены в эпидермисе, их диаметр 14-20 мкм, они имеют широкую светлую цитоплазму, бобовидное или округлое ядро. В КЛ ультраструктурным методом выявляют гранулы Бирбека (их маркеры). Эти клетки экспрессируют антиген С D 1а и S-100 протеин и содержат аденозинтрифосфатазу (Chu Т., Jaffe R., 1994). После связывания антигена КЛ поступают в региональные лимфоузлы, где дифференцируются в интердигитальные ДК, способные представлять антиген Т-лимфоцитам (Strunk D. et al.. 1997). Клетки Лангерганса не экспрессируют моноцитарный антиген CD 14, обладают слабой фагоцитарной активностью, не содержат лизоцим и не могут превращаться в макрофаги.

В настоящее время предполагают 3 пути развития ДК: из моноцитов крови, лимфоцитов и клеток-предшественников гемопоэза.

Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 51 Интерстициальные ДК, как считают, имеют миелоидное (моноцитарное) происхождение и, в отличие от КЛ, стимулируют В-лимфоциты к продукции антител (Птушкин В.

В., 2001; Peters J. Н.

et al., 1991). Они могут превращаться в макрофаги под влиянием М-КСФ или ГМ-КСФ и экспрессируют CD14. В то же время установлен другой путь развития ДК — из лимфоцитов. Дендритные клетки могут принимать участие в индукции иммунной толерантности. Они способны подавлять незрелые Т-лимфоциты тимуса или зрелые Т-лимфоциты лимфоузлов, направленные против собственных антигенов. Установлено, что ДК толерантности происходят из общего с Т-лимфоцитами предшественника. Аргументы в пользу лимфоидного происхождения некоторых ДК у человека привели V. Soumelis с соавторами (1997), показавшие противоположный эффект ИЛ-4 на ДК миелоидного и лимфопдного происхождения. По их данным, лимфоидные ДК имеют морфологию плазматических клеток, низкую экспрессию миелондных маркеров CD13 и CD33, позитивный эффект на их клеточный рост от ИЛ-3 и отсутствие эффекта от миелоидного ГМ-КСФ.

ДК используют в терапии злокачественных заболеваний в качестве фактора, стимулирующего противоопухолевый иммунитет и инициирующего иммунный ответ на антиген.

Таким образом, клетки СМФ обеспечивают специфический иммунный ответ, а также участвуют в процессах репарации и заживления ран и очистке кровяного русла в основном за счет макрофагов печени и селезенки (Маянский Д. Н., 1981). Они участвуют в обмене железа, углеводов и липидов, регуляции гемостаза и гемопоэза, продуцируя как стимуляторы гемопоэза (М-КСФ, ГМ-КСФ, ИЛ-1), так и ингибиторы (TNF-a, TGF-a). Как секреторные клетки они продуцируют медиаторы воспаления, протеазы, интерлейкины, факторы роста, адгезивные молекулы (Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Клетки макрофагалыгой системы обладают цитотоксической активностью против опухолевых, инфицированных и других измененных клеток.

Эритроидные клетки

Первой морфологически распознаваемой клеткой эритроидного ряда является эритробласт, который происходит из унипотентной эритроидиой клетки-предшественника. Последняя проходит несколько этапов дифференциации, постепенно ограничивающих ее пролиферативный потенциал. Это происходит в результате осуществления эритроидной программы генной экспрессии (Romeo P.-H., 52 Часть 1: Теоретическая гематология 1999). Большую роль в регуляции экспрессии эритроидно-специфических генов, таких как гены глобина, порфобилиногена, гликофорина А и В, гена эритропоэтина играют ядерные белки семейства GATA. Поздние этапы эритропоэза полностью зависят от присутствия эритропоэтина (ЭРП), для которого эритроидные клетки-предшественники экспрессируют рецептор (ЭРГТ-R). Эритропоэтин необходим для эритроидной дифференцировки вплоть до позднего базофильного (раннего полихроматофильного) нормоцита, после чего эритроидная клетка больше не нуждается в ЭРП для своего созревания (Долгов В. В. и др., 2001; Romeo P.-H., 1999).

Эритробласт — крупная клетка диаметром 15-25 мкм. Круглое ядро с мелкозернистой структурой ядерного хроматина содержит 2-3 крупные нуклеолы. Умеренная цитоплазма резко базофильна, часто содержит 1-2 выступа в виде «ушек». Вокруг ядра находится перинуклеарная зона просветления. Синтез гемоглобина (Hb) начинается на стадии эритробласта. После митоза количество гемоглобина сокращается наполовину и в течение интерфазы полностью восстанавливается. Клетка совершает от 3 до 7 делений, и один эритробласт продуцирует в среднем 32 эритроцита. Эритробласты составляют 0,2—1,0% миелокариоцитов. По мере созревания эритробласт превращается в пронормоцит и затем в нормоцит, который в процессе развития уменьшается в размере, ядерный хроматин становится все более грубым, приобретая колесовидную структуру. Количество гемоглобина в нормоцитах прогрессивно нарастает, в результате чего цитоплазма утрачивает базофилию, и в зависимости от ее гемоглобинизации различают 3 вида нормоцитов — базофильные, полихроматофильные и оксифильные. Последней клеткой, способной к пролиферации, является полихроматофильный нормоцит. После деления раннего полихроматофильного нормоцита концентрация гемоглобина в дочерних клетках достигает критической величины — 13,5 пг (пикограммов), синтез ДНК в ней прекращается и она выводится из митотического цикла. Оксифильный нормоцит — клетка, которая не делится и не синтезирует НЬ. Часть эритрокариоцитов уже на стадии базофильного нормоцита достигает критической массы НЬ и выключается из митотического цикла. Эти незрелые клетки гибнут в костном мозге, подчиняясь законам апоптоза и демонстрируя таким образом неэффективный эритропоэз. Последний является одним из факторов регуляции эритрона, поддержания необходимого уровня эритроцитов в крови. Ядро оксифильного нормоцита конденсировано, пикнотично («вишневая косточка»). Клетка лишается его в период Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 53 нахождения в костном мозге. Цитоплазма оксифильного нормоцита розовая, насыщенная гемоглобином. Стадия созревания после энуклеации оксифильного нормоцита перед зрелым, полностью гемоглобинизированным эритроцитом называется ретикулоцитом.

Ретикулоцит характеризуется активным метаболизмом. Время его пребывания в костном мозге 1-2 дня, после чего он покидает его и еще от 1 до 3 дней дозревает в периферической крови, лишаясь остатков сетчатой ретикулофиламентозной субстанции, представляющей собою фрагменты рибосом, митохондрий и других органелл. Зрелый эритроцит (клетка, основным содержимым которой является гемоглобин) — это двояковогнутый диск диаметром 7,5— 8 мкм. Его эластичность и деформируемость при сохранении структуры клетки обусловлены особенностями цитоскелета и позволяют ему проходить даже через стенки синусов селезенки. В костном мозге содержание клеток эритроидного ряда колеблется от 14 до 26%, в среднем около 20%. Длительность жизни эритроцита — 100— 120 дней.

Функции эритроцитов Основная функция эритроцитов заключается в снабжении тканей кислородом и транспорте углекислоты. Она осуществляется за счет присутствия в клетке гемоглобина. Гемоглобин — дыхательный пигмент, хромопротеид. У взрослого человека гемоглобин представлен двумя типами: НЬА — взрослым гемоглобином (98%) и HbF — фетальным гемоглобином (2%). Его небелковая часть, включающая железо, называется гемом, белковый компонент — глобином. Гемоглобин переносит кислород от легочных альвеол к тканям, транспортирует углекислый газ от тканей к легким и участвует в поддержании буферного кислотно-основного равновесия крови.

В самих эритроцитах совершается много ферментативных реакций. Они участвуют в иммунных процессах, взаимодействуя с циркулирующими иммунными комплексами, так как на мембране эритроцитов имеется Fc-рецептор к иммуноглобулинам. На своей мембране они адсорбируют аминокислоты, липиды, токсины. Среди них выделяют эритроциты-супрессоры, участвующие в подавлении иммунного ответа (Козинец Г. И., Макаров В. А., 1997).

–  –  –

Мегакариобласт является первой морфологически распознаваемой клеткой этого ряда в костном мозге. Предшественником мегакариобласта является унипотентная клетка-предшественник 54 Часть 1. Теоретическая гематология мегакариоцитов. Тромбоциты, или кровяные пластинки, самые маленькие клетки крови, происходят из мегакариоцитов — самых крупных, гигантских клеток костного мозга. Мегакариобласт, по данным ряда авторов (Paulus J.-H., Aster R. H., 1983) и нашим наблюдениям, — крупная клетка, имеющая большое округлое или складчатое ядро и слабо различимые нуклеолы. Структура хроматина сетчатая, узкая базофильная цитоплазма иногда имеет выросты. В результате процессов эндомитоза (многократного удвоения числа хромосом без разрушения ядерной оболочки и без деления клетки) и по.пшлоидизации (возникновения более чем диплоидного набора ДНК) ядро мегакариобласта увеличивается, оставаясь в пределах той же цитоплазмы, и возникает мегакариоцит. Большой размер этих клеток обусловлен очень высоким содержанием в них ДНК. Среди мегакариоцитов различают более молодые 6азофильные и более зрелые гранулярные формы. Среди гранулярных выделяют полихроматофильные и оксифильные мегакариоциты. Мегакариоциты достигают в диаметре 120 мкм и более (в среднем — 40-50 мкм). Ядро базофильного мегакариоцита нелобулярное, ядрышки плохо различимы. Неширокая темно-голубая или базофильная цитоплазма не содержит зернистости и в норме не отделяет пластинки.

Диаметр полихроматофильного мегакариоцита (клетка окрашивается основными и кислыми красителями) колеблется от 40 до 120 мкм. Ядро грубое, без нуклеол, форма ядра вариабельная, причудливая, может быть сегментированной; в цитоплазме содержится азурофильная зернистость. Клетка является главным продуцентом пластинок, в ее цитоплазме видны тромбоциты и можно наблюдать процесс их отделения. В процессе эндомитоза клетка становится полиплоидной (4N, 8N, 16N, 32N, 64N).

Оксифильный мегакариоцит характеризуется очень слабой функциональной активностью и, как правило, не отделяет пластинки.

Это крупная клетка с грубым полиморфным ядром, широкой розовой цитоплазмой с остатками скудной зернистости. Различают также инволютивные формы — старые, разрушающиеся клетки и свободные ядра мегакариоцитов. Жизненный цикл мегакариоцита — 10 суток. Стимулятором его роста и дифференцировки является тромбопоэтин (ТП).

В развитии и дифференцировке мегакариоцитов принимают участие многие другие факторы, среди которых:

ИЛ-1, ИЛ-3. ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, НЛ-11, ЭРП, лейкозингибирующий фактор (ЛИФ), колониестимулирующие факторы ГМ-КСФ, М-КСФ и многие другие (Chatelain С, 1999). Регулятором мегакариопоэза является также количество тромбоцитов, избыток котоГлава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 55 рых тормозит тромбоцитопоэз, и наоборот. В цитоплазме зрелых мегакариоцитов находятся гранулы, содержащие большое количество белков, среди которых фактор Виллебранда, тромбоспондин, тромбоцитарный фактор 4, фибронектин, фибриноген, тромбоцитарный ростовой фактор, IV7 и V факторы свертывания крови и др.

Ультраструктурным маркером мегакариоцитов является выявляемая при электронной микроскопии тромбоцитарная пероксидаза.

Мегакариоциты составляют 0,2-0,6% миелокариоцитов.

Функции тромбоцитов

Эффекторными клетками мегакариоцитоноэза, участвующими в процессах свертывания крови, являются тромбоциты — производные мегакариоцитов. Это сферические образования диаметром 1-4 мкм, их количество составляет в среднем 250 тыс. в 1 мкл.

В кровяном русле тромбоциты находятся в активированном (40%) и неактивированном состоянии. Они имеют периферическую зону, условно называемую цитоплазмой, или гиаломером, и зону-гель, а также мембраны и органеллы (Иванов Е. П., 1991). Зона-гель содержит гранулы, включающие множество факторов, обеспечивающих функции тромбоцитов. Главные функции тромбоцитов — ангиотрофическая и адгезивно-агрегационная. Известно 11 пластинчатых факторов свертывания, которые содержатся в тромбоцитах.

Среди них тромбоцитарный тромбопластин, акцелератор тромбина, активатор фибринолиза, фибринстабилизирующий фактор, ссротонин, антигепаригговый фактор, фибриноген тромбоцитов и др.

(Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Тромбоциты обеспечивают тромбоцитарное звено гемостаза. Повреждение сосуда немедленно влечет за собою его спазм и прилипание (адгезию) тромбоцитов к коллагеновым волокнам и другим адгезивным белкам субэндотелия. Пластинки агрегируют в месте повреждения под влиянием многих факторов, в частности тромбина, и в результате фазы обратимой или первичной агрегации образуется тромбоцптарная пробка. Дальнейшая агрегация и уплотнение пробки обеспечивают необратимую, вторичную агрегацию — первичный гемостаз (Петрищев Н. Н., Папаяп Л. П., 1999). На основе первичного тромба образуется фибриновый сгусток и формируется тромбоцитарнофибриновая пробка, обеспечивающая окончательный, или вторичный гемостаз. Плазменно-коагуляционный механизм гемостаза также происходит при непосредственном участии тромбоцитов, которые секретируют многие факторы, активирующие плазменный гемостаз.

56 Часть 1. Теоретическая гематология Лимфоциты Лимфопиты имеют общую с миелоидными элементами клеткупредшественника на уровне СКК, но затем они приобретают независимую линию дифференцировки (Morrison S.J.etal., 1997). Лимфоциты представлены в основном тремя клеточными линиями — В-, Т- и NK-клетками, — и имеют общую для них клетку-предшественника, коммитированную в направлении лимфопоэза. В костном мозге В- и Т-лимфобласты присутствуют в очень небольшом количестве (-0,5%). Лимфобласт характеризуется более мелкими размерами, чем миелобласт, круглым ядром с 1-2 нуклеолами и нежнозернистой структурой хроматина. Его неширокая голубая цитоплазма в норме лишена зернистости.

Следующие клетки — пролимфоцит и лимфоцит. Пролимфоцит характеризуется более грубым ядерным хроматином и реже выявляемыми нуклеолами. Лимфоциты даже морфологически очень гетерогенная группа, которая объединяет многие типы этих иммунокомпетентных клеток. Давая морфологическую характеристику лимфоцитам, учитывают их форму и размеры, структуру хроматина, особенности цитоплазмы, наличие или отсутствие в ней включений и другие признаки. Обычный лимфоцит крови имеет размер 7-12 мкм. Он имеет овальное или круглое ядро, глыбчатую структуру ядерного хроматина, отличается отсутствием нуклеол. Клетка чаще не содержит зернистости, но есть категории гранулированных лимфоцитов, например большие гранулированные лимфоциты размером 9-15 мкм. По ширине цитоплазмы их делят на узко-, средне- и широкоцитоплазменные. Первые из них — это малые лимфоциты диаметром 6-7 мкм с плотным ядром. Деление лимфоцитов на В- и Т-типы обусловлено их специализацией и функциями. В костном мозге В-лимфоциты при участии цито* кинов проходят антигеннезависимую стадию созревания и дифференцировку от про-В-типа, через пре-пре-В-тип, пре-В тип до В-типа — зрелого лимфоцита. В костном мозге формируется антигенраспознающий иммуноглобулиновый рецептор В-лимфоцитов — BCR. Из костного мозга В-лимфоциты, зкепрессирующие IgM и IgD, поступают в периферическую кровь и заселяют В-зависимые зоны лимфоидных органов — фолликулы, в зародышевых центрах которых они проходят антигензависимую пролиферацию и дифференцировку в плазматические клетки, продуценты антител, или В-клетки памяти (Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 2001;

Тупицын Н. Н., 2002). Активированный антигеном В-лимфоцит превращается в В-иммунобласт, затем плазмобласт. Это крупная клетка диаметром 15-22 мкм. Она имеет округлое ядро, располоГлава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 57 женное эксцентрично, 2-4 нуклеолы, резкобазофильную ••цитоплазму без включений. Иногда наблюдается зона просветления вокруг ядра. Проплазмоцит характеризуется эксцентрично расположенным ядром, боле плотной структурой ядерного хроматина, менее отчетливыми нуклеолами и базофильной цитоплазмой.

Плазмоциты очень различаются по размеру. Они имеют округлое, эксцентрически расположенное ядро с грубым хроматином. Ядрышки отсутствуют; цитоплазма базофильна, часто вакуолизирована.

Плазматические клетки продуцируют антитела, одной специфичности и одного класса иммуноглобулинов. Предшественники Т-лимфоцитов — протимоциты — из костного мозга мигрируют в корковый слой тимуса — центральный орган Т-лимфопоэза. Здесь они подвергаются антигеннезависимой дифференцировке и проходят стадии про-Т-клетки, пре-Т-клетки и Т-клетки. На стадии про-Тлимфоцита начинает формироваться антигенраспознающий Т-клеточный рецептор — TCR. При переходе из коркового слоя в мозговой Т-лимфоциты превращаются в СО4+Т-хелперы (Th) и C D 8 предшественники цитотоксических лимфоцитов (киллеров).

«Наивные» СО4*Т-лимфоциты после встречи с антигеном и активации представляют собою ThO, секретирующие ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ-у, и могут дифференцироваться в ТЫ и Th2. Thl способны активировать макрофаги, участвовать в клеточном иммунном ответе. Th2 активируют В-лимфоциты к продукции антител, т. е.

участвуют в гуморальном ответе. Эти две популяции продуцируют цитокины, которые способны противодействовать дифференцировке и активации противоположной субпопуляции (Фрейндлин И. С, 2000). Морфологически различить Т- и В-лимфоциты практически невозможно. Единственно надежным способом их идентификации является иммунофенотипирование с использованием моноклональных антител.

Классические NK-клетки (natural killer — естественные киллеры) — 3-я очень небольшая популяция лимфоцитов — не несет на своей поверхности маркеров В- или Т-клеток. Они составляют около 5% от числа лимфоцитов периферической крови. Морфологически это большие гранулированные лимфоциты, способные непосредственно, без помощи антител убивать клетки-мишени — опухолевые или инфицированные вирусом — или микроорганизмы, т. е. они обладают клеточной цитотоксичностью. Специфический белок NK-клетоК — перфорин способен разрушать мембрану клетки-мишени. Полагают, что NK-клетки, возможно, включают в себя + супрессорные цитотоксические СО38 Т-клетки. Вся популяция лимфоцитов в костном мозге составляет 8-9% миелокариоцитов.

58 Часть 1. Теоретическая гематология Функции лимфоцитов Основной функцией лимфоцитов является распознавание собственных и чужеродных антигенов и обеспечение гуморального и клеточного иммунитета. В-лимфоциты получили свое название от слова «bursa» — сумка, так как впервые были обнаружены у птиц в органе, называемом «бурса Фабрициуса». Они ответственны за гуморальный иммунитет и способны распознавать антигены с помощью экспрессируемых ими на мембране специфических рецепторов. В-лимфоциты способны самостоятельно распознавать антигены и отвечать продукцией соответствующих антител, но в основном для реализации иммунного ответа они нуждаются в кооперации с Т-лимфоцитами, которые представляют им антиген и стимулируют к дифференцировке в плазматические клетки и выработке антител. Т-лнмфоциты обеспечивают клеточный иммунитет и распознают антигены с помощью антигенпрезентирующих клеток, к которым относятся макрофаги и главным образом дендритные клетки. В результате этих контактов происходит активация Т-лимфоцитов хелперов и секреция ими цитокинов, стимулирующих к пролиферации и дифференциации макрофаги, В-лимфоциты и сами Т-клетки.

Цитокины, секретируемые Т-лимфоцитами, инициируют выход нейтрофилов из крови в ткани к очагам воспаления, и сами активированные Т-лимфоциты — Т-цитотоксические лимфоциты — способны лизировать клетки, несущие чужеродные антигены и внутриклеточные паразиты: грибы, микобактерии туберкулеза, вирусы и простейшие. Цитотоксические Т-лимфоциты принимают прямое участие в реакции отторжения трансплантата.

Лимфоциты находятся в состоянии постоянной циркуляции между кровью, лимфой и лимфоидными органами, и это делает возможной встречу каждого антигена с соответствующей очень немногочисленной популяцией лимфоцитов, несущих специфические маркеры для распознавания именно данного антигена. Одной из форм иммунного ответа является иммунологическая память, которая формируется при контакте лимфоцита с чужеродным антигеном и способствует быстрой выработке соответствующих антител при повторном контакте с тем же антигеном. Это вторичный иммунный ответ, который обеспечивается клоном долгожнвущих клеток памяти - соответствующих Т- и В-лимфоцитов.

Т-лимфоциты являются секреторными клетками, и их цитокины играют большую роль в регуляции гемопоэза. иммунного ответа, процессов воспаления и др. Они секретируют:

Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови 59

1) гемопоэтины ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17,ТМ-КСФ;

2) интерфероны, в том числе ИНФ-у;

3) факторы некроза опухоли — ФНОа, ФНОр и др.;

4) хемокины — цитокины, обладающие активностью хемоаттрактантов, в частности М1Р-1а и -1(3 и RANTES — хемоаттрактант для эозинофилов и базофилов, принимающий участие в аллергических реакциях;

5) TGF-J3 н фактор, ингибирующий миграцию, — MIF и др.

Синтез и секреция иммуноглобулинов В-лимфоцитами - завершающая стадия специфического гуморального иммунного ответа.

Продукты иммунного ответа — иммуноглобулины — относятся к фракции гамма-глобулинов. Активированные В-лимфоциты также способны секретировать некоторые цнтокины, например ИНФ-а, IUI-12,TGF-p.

Таким образом, координированное взаимодействие клеток крови, опосредованное влиянием регуляторов пролиферации и дифференциации — цитокинов, обеспечивает постоянство клеточного состава крови и равновесие внутренней среды организма.

Литература

ВиноградоваJO. Э. Строение и функции лейкоцитов. Гранулоциты // Руководство по гематологии / Под рел. А. И. Воробьева. М., 2002. С. 88-106.

Воробьев А. И. Клетка// Руководство по гематологии / Пол ред. А. И. Воробьева. М., 2002. Т. 1.С. 13-28."

Долгов В. В., Луговская С. А., Морозова В. Т. и др. Лабораторная диагностика анемий: Пособие для врачей. Тверь, 2001. 88 с.

Иванов Е. П. Руководство по гемостазиологии. Минск, 1991.

Козинец Г. И., Макаров В. А. Исследование системы крови в клинической практике. М., 1997. 480 с.

Лукина Е. А. Моноциты и макрофаги // Руководство по гематологии / Под ред.

А. И. Воробьева. М„ 2002. Т. 1. С. 100 - 106.

Маянскип Д. Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. Новосибирск: Наука, 1981. 168 с.

Мая некий А. Н., Маянскип Д. II. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1983. 256 с.

Петрищев А. Л., Напаян Л. П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. СПб., 1999.

117с.

Проценко В. А., Шпак С. И., Доценко С. М. Тканевые базофилы и базофильные гранулоциты крови. М., 1987. 128 с.

Птушкин В. В. Дендритические клетки и роль цитокинов is их дифференцировке и функционировании /'/' Клиническая онкогематология / Под ред. М. А. Волковой. М.: Медицина, 2001. С. 72-76.

Глава 4

ТРЕПАНОБИОПСИЯ КОСТНОГО МОЗГА.

СТРОМАЛЬНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ:

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И УЧАСТИЕ В ГЕМОПОЭЗЕ

Главным кроветворным органом человека является деятельный костный мозг губчатого вещества костной ткани. Являясь сложнорегулируемой иерархической системой, гемопоэз возможен только при обязательном условии взаимодействия со стромой костного мозга. Как известно, в основе интенсивного обновления различных клеточных форм гемолимфопоэза.[ежит единая клеточная линия. Мультипотентная стволовая кроветворная клетка является общим предшественником всех известных линий гемопоэтическоп дифференцировки и всей мозаики лимфоидных элементов. Процессы, лежащие в основе самоподдержания, коммитирования, пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, определяются регуляторными механизмами на уровне генома и эпигеномными факторами.

Ведущими среди эпигеномных факторов, играющих ключевую роль в жизнедеятельности стволовых клеток, являются межклеточные взаимодействия гемопоэтических предшественников с элементами стромального микроокруженйя, которые представлены в костном мозге синусоидальными сосудами, ретикулярными, жировыми и эндостальными клетками (Ругаль В. И. и др., 1991;

Mayany H. et al., 1992; Van Damme A. et al, 2002). Регуляторный потенциал указанных элементов реализуется путем их непосредственных контактов с кроветворными предшественниками, а также благодаря широкому спектру стимуляторов и ингибиторов гемолимфопоэза, продуцируемых стромой костного мозга — цитокинов, рестриктинов, циклинов, адгезшюв и других, локальный эффект которых обеспечивается как их продукцией in situ, так и Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга 63 иммобилизацией на компонентах внеклеточного матрикса. Строма костного мозга является источником сигналов, которые воспринимаются рецепторами плазматических мембран гемопоэтических клеток, преобразуются при участии сложных взаимодействий клеточных органоидов и поступают в ядро, где происходит запуск экспрессии генов, необходимых для клеточной пролиферации и дифференцировки. В результате этого начинают реализовываться генетические программы, ответственные за формирование тканеспецифических и стадиеспецифических клеточных фенотипов с соответствующими морфофункциональными особенностями клеток гемолимфопоэза.

Одним из доступных и информативных методов изучения костного мозга в целом и стромы костного мозга в частности является трепанобиопсия (Теодорович В. П., Абдулкадыров К. М., 1977).

Признавая неоценимое диагностическое значение при заболеваниях системы крови стернальной пункции, необходимо подчеркнуть, что метод трепанобиопсии костного мозга позволяет получить более полную информацию о состоянии костномозгового кроветворения. Так, с помощью трепанобиопсии возможно изучить истинное соотношение кроветворной ткани и жировой субстанции. При трепанобиопсии также легко выявляются и изменения со стороны костной ткани, стромы костного мозга и гемопоэтического микроокружения. Однако данный метод не может заменить, тем более вытеснить стернальную пункцию. Он является весьма информативным, объективным и обязательным при диагностике заболеваний системы крови.

Методика исследования При трепанобиопсии забор губчатого вещества костной ткани осуществляют иглой Jamshidi или Islam из задней ости подвздошной кости. Для исследования необходим столбик костной ткани не менее 2 см длиной, поскольку субкортикальные лакуны не отражают состояние кроветворения. Материал фиксируется в 10% водном растворе формальдегида или жидкости Карнуа. Объем фиксирующих сред должен превышать объем трепаната не менее чем в 10 раз. Кусочек ткани после фиксации декальцинируется и проводится через ряд спиртов восходящей концентрации, хлороформ и жидкий парафин. Обезвоженный материал, пропитанный парафином, погружают в специальные кассеты с жидким парафином. Полученные после охлаждения блоки закрепляют в микротоме и приготовляют гистологические препараты толщиной около 5 мкм. Срезы прикрепляют к предметным стеклам, депарафинируют и 64 Часть 1. Теоретическая гематология окрашивают Азур-2-эозином или гематоксилин-эозином, заключают в оптически прозрачную среду и покрывают покровным стеклом. При необходимости производится окраска азотнокислым серебром по Гомори или пикрофуксином по Ван-Гизону.

При ря/[е патологических состояний бывает трудно, даже невозможно с помощью указанных методов окраски определить тип клеток и их происхождение (гистогенез). В связи с этим, наряду с гистологическим методом, используют дополнительно иммуногистохимические исследования трепанобиопсий подвздошной кости. При использовании этого метода на гистологические препараты наносят раствор с антителами к определенным антигенам. Антитела иснользуемых сывороток имеют на себе метку флюорохром либо красящий фермент. Более распространен иммунопероксидазный метод, при котором антитела красящей сыворотки несут фермент — пероксидазу хрена. Для иммуногистологических реакций используют два типа антител: поли- и моноклональные. Имеется большое количество коммерческих наборов (kits) сывороток к различным антигенам. Использование маркеров позволяет дагь иммунофенотипическую характеристику кроветворных и лимфоидных клеток костного мозга для диагностики заболеваний, назначения и оценки лечения. Ниже представлены результаты исследований структурной организации стромы костного мозга на основании изучения трепанобиоптатов подвздошной кости здоровых лиц с использованием стандартных методов гистологических, морфометрических и ультрамикроскопических исследований.

Стромалыюе микроокружение:

структурная организация и участие в гемопоэзе Синусоидальные сосуды Клетки крови человека формируются в экстравазальных секторах костного мозга и в сосудистое русло проникают через васкулярную стенку. Ежесуточно у взрослого человека образуется около 1/3 триллиона клеток. Их миграция в кровоток обеспечивается особенной структурной организацией сосудистого русла костного мозга. Как известно, активный гемопоэз происходит в тех участках костной ткани, которая имеет губчатую структуру и, в отличие от компактной, не обладает системой гаверсовых каналов, обеспечивающих кровоток. В губчатой кости снабжение кровью костных балок и интрамедуллярной кроветворной паренхимы осуществляется за счет периостальных артерий, которые в виде a. perforans входят внутрь костного мозга через плотную кортикальную пласГлава 4. Трепанобиопсия костного мозга 65 тинку. Указанные сосуды в лакунах губчатого вещества разделяются на костномозговые артерии, переходящие в артериальные капилляры. Последние, расширяясь в виде воронки, образуют синусоиды костного мозга. Венозный отток осуществляется посредством балочковых синусов, которые проходят через компактный слой губчатой кости, вливаясь в периостальные вены. Таким образом, синусы костного мозга — это «чудесная сеть» внутри венозного русла. Именно в этих участках в условиях нормального кроветворения происходит миграция клеток крови в сосудистое русло..

В гистологических препаратах подвздошной кости здоровых людей синусы представлены тонкостенными сосудами, которые на разрезе имеют вытянутую, овальную или округлую форму. Их вид зачастую зависит от размеров. Мелкие и средние синусоиды имеют преимущественно удлиненную и вытянутую форму. Для более редко встречающихся крупных синусоидальных сосудов характерны овальные или округлые очертания. В интрамедуллярных пространствах костного мозга иногда выявляются синусоиды неправильной формы вследствие неравномерного расширения просвета (грушеобразные, колбовидные и др.).

Представляя собой начальное звено венозного русла, синусоидальные сосуды образуются в результате слияния узких капилляров или ветвления артериол. Венозные сосуды, следующие за синусами, имеют значительно меньший диаметр. Однако в гистологических препаратах синусоидальные сосуды не всегда представлены с их приносящими и выносящими ветвями. В большинстве наблюдений морфологический рисунок синусоидального русла представлен преимущественно только синусоидами. Стенка синусоида состоит из одного слоя эндотелиоцитов, цитоплазма которых имеет вид истонченного тяжа, ограничивающего просвет.

Встречаются клетки как с увеличенными просветленными, так и пикнотическими ядрами. В просветах сосудов находились эритроциты, небольшое количество гранулоцитов, а в некоторых — незрелые элементы эритроидного ряда. Фагоцитоз эндотелиальным клеткам не свойственен. При морфометрическом исследовании площадь, занимаемая в гистологических препаратах синусоидальными сосудами, составляет около 5%.

При обзорном просмотре электронно-микроскопических срезов обнаруживаются синусоиды двух видов. В одних эндотелиоциты имеют уплощенную форму с длинными, резко истонченными цитоплазматическими отростками. Ядра в этих клетках плоские, с грубым, конденсированным по всему сечению хроматином. Ядрышки не выявляются. Как в перикарионе, так и в маргинальных 3 Гематология. Нов. справочник 66 Часть 1. Теоретическая гематология участках цитоплазмы обнаруживается небольшое количество органоидов: единичные митохондрии с небольшим числом крист и матриксом умеренной плотности, незначительное количество nvзырьков, гетерогенные по размеру электронноплотные гранулы, тельца Вейбеля-Палладе. В просвете синусоидов выявляются только зрелые клетки гранулоцитарного ряда, эритроциты и тромбоциты. В состав стенки таких синусов входит тонкая базальная мембрана.

В синусоидах другого типа эндотелиоциты отличаются от описанных выше структурой ядра и содержанием органелл в цитоплазме. Как правило, эти клетки выбухают в просвет синусов и имеют крупные ядра с у меренной конденсацией хроматина по периферии и четким преобладанием эурохроматина. Цитоплазма богата органоидами и имеет хорошо выраженные признаки пино- и экзоцитоза.

Базальная мембрана имеет прерывистую структуру. В синусах такого тина наблюдается трансмуральный проход зрелых клеток, а в их просветах наря!су со зрелыми элементами гемопоэза обнаруживаются эритроидные клетки на стадии эритробластов.

Полученные ультрамикроскопические данные подтверждают существование в костном мозге человека замкнутой системы кровообращения. Вместе с этим наблюдается отчетливая функциональная мозаичность эндотелия. Трансцеллюлярная миграция клеток крови происходит в местах наличия прерывистой базальной мембраны и расположения функционально активных, богатых органеллами эндотелиоцитов с признаками пино- и экзоцитоза. Вполне вероятно, что миграция стволовых гемопоэтических клеток также осуществляется в этих зонах.

Учитывая сведения о непосредственном влиянии эндотелиальных клеток на кроветворение, можно предполагать, что богатые органоидами эндотелиоциты способны не только передавать, но и секретировать функционально активные вещества, регулирующие процессы дифференцировки и созревания гемопоэтических предшественников. Резкое увеличение диаметра просвета синусоидальных сосудов приводит к значительному снижению в них скорости кровотока, поэтому синусы могут выполнять роль своеобразного отстойника, создавая условия для созревания ядросодержащих гемопоэтических клеток. Это предположение подтверждается обнаружением эритробластов в просветах синусов.

Несомненно, что синусоиды, обеспечивая упорядоченное поступление в кровоток физиологически важных веществ и клеток крови, создают благоприятные условия для деятельности костного мозга как кроветворного органа. Их значение не ограничивается Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга 67 • функцией гистогематического барьера. Входящие в их состав эндотелиальные клетки могут играть инструктивную роль в гемопоэзе, а регуляторный эффект может осуществляться посредством секреции ростовых факторов либо путем межклеточных контактов эндотелиоцитов с гемопоэтическими предшественниками.

Интрамедуллярные ретикулярные клетки

Ретикулярные клетки костного мозга являются одним из основных клеточных компонентов кроветворного микроокружения.

В интрамедуллярных пространствах трубчатой кости цитоплазматические отростки ретикулярных клеток контактируют с отростками соседних клеток, а также с периваскулярными адвентициальными и покрывающими поверхность костных балок клетками, формируют цитоплазматическую сеть — ретикулум, в ячейках которого располагаются гемопоэтические клетки. В костномозговых пространствах подвздошной кости человека в одном поле зрения иммерсионного увеличения микроскопа заметны около трех ретикулярных клеток. Размеры и форма ретикулярных клеток весьма изменчивы. Чаще обнаруживаются крупные клеточные элементы с деформациями и длинными цитоплазматическими выростами.

Как правило, цитоплазма интрамедуллярных стромальных клеток слабо базофильна, мелкоячеистого строения. Ядра неправильной формы с мелкодисперсной структурой хроматина. Также встречаются малоотростчатые клетки с овальными светлыми ядрами.

В центральных отделах лакун, вокруг них в виде островков располагаются эритроидные клетки. Когда ретикулярные клетки выявляются вблизи поверхности костных трабекул, их цитоплазма находится в тесном контакте с властными элементами гранулоцитарного ростка. Наряду с цитоплазматическими отростками ретикулярные клетки костного мозга способны образовывать тонкие волокна, которые могут располагаться свободно либо связываться с цитоплазматическими отростками.

В гемопоэтической ткани в зависимости от локализации можно выделить два основных типа ретикулярных клеток, отл ичающихся по ультраструктуре. Клетки первого типа с очень длинными цитоплазматическими отростками располагаются диффузно и формируют сеть, в ячейках которой располагаются кроветворные элементы. Ядра с мелкодисперсным хроматином иногда содержат ядрышки. Цитоплазма содержит большое количество рибосом, хорошо развитую сеть канальцев эндоплазматического ретикулума и пучки микрофнламентов.

68 Часть 1. Теоретическая гематология В эндостальных и периваскулярных зонах среди кроветворных элементов гранулоцитарного ряда выявляются ретикулярные клетки другого типа — малоотростчатой формы со светлым ядром и наличием ядрышек. Они имеют тесный контакт с гемопоэтическими бластными элементами. Довольно часто в местах контактов таких клеток их плазмолеммы как самостоятельные структуры не определяются. Отмечается их способность к фагоцитозу.

Как разновидность ретикулярных клеток рассматриваются адвентициальные клетки, тесно прилегающие к стенкам капилляров и синусов. Большинство периваскулярных клеток имеют темное ядро и умеренных размеров цитоплазму. В части клеток обнаруживаются крупные жировые капли, окруженные богатым органеллами ободком цитоплазмы. Наличие переходных форм между указанными клетками и адипоцитами указывает на возможности развития жировой ткани костного мозга человека из адвентициальных ретикулярных клеток.

Полученные в ходе исследований ретикулярной стромы результаты прежде всего свидетельствуют о функциональной мозаичное ти клеток стромального ретикулума. Кроме того, они указывают на существование функциональных взаимосвязей стромальной и кроветворной ткани.

Отростчатые ретикулярные клетки первого типа своими длин-' ными цитоплазматическими ответвлениями пронизывают интрамедуллярные пространства, формируют механический каркас, на котором располагаются гемопоэтические клетки. Они, вероятно, выполняют роль своеобразного якоря, который задерживает клетки крови и участвует в их движении в циркуляцию. Контактируя между собой, а также с костью и сосудами, они создают прочную основу для синусов, не позволяя спадаться их стенкам, состоящим из единственного слоя эндотелия.

Кроме того, в их цитоплазме обнаружены микрофиламенты.

Известно, что ретикулярные клетки лимфатических узлов способствуют транспортировке лимфоцитов в межуточной ткани и далее в лимфатические сосуды. По всей вероятности, в костном мозге ретикулярные клетки первого типа вместе с опорной функцией способствуют, по аналогии с лимфатическими узлами, миграции клеток крови в интрамедуллярных пространствах костномозговых лакун.

Нельзя исключить, что ретикулярные клетки первого типа наряду с отмеченными свойствами выполняют и более специфические функции. Имея в цитоплазме хорошо развитый белоксинтезирующий аппарат, дендритические клетки ретикулума являются Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга 69 основным источником образования экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микросреду интрамедуллярных пространств костного мозга. Синтезируя коллаген, гликозаминогликаны и другие физиологически активные субстанции, ретикулярные клетки способны непосредственно влиять на процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников. Особенно следует отметить роль коллагена. Как известно, экстрацеллюлярный коллагеновый матрикс интрамедуллярных пространств костного мозга представлен коллагеном первого и третьего типов. Химическая структура коллагена и его биологические функции хорошо изучены. Роль этого белка не ограничивается только опорной функцией. Он необходим в процессах эмбрио- и морфогенеза, оказывает влияние на рост и дифференцировку клеток различных органов и систем организма.

В гемопоэтических очагах, преимущественно гранулоцитарных и в меньшей мере эритроидных, выявляются ретикулярные клетки второго типа. Они характеризуются отсутствием цитоплазматических отростков, наличием молодого ядра, содержащего ядрышки. Их отличительной особенностью является тесный контакт с молодыми гемопоэтическими элементами. В местах контактов наблюдаются структурные перестройки мембран. На наличие функциональных взаимоотношений указывают отмеченные анатомические характеристики, а также перемещение гемопоэтических клеток, по мере созревания, от центра кроветворного очага с расположенными в нем стромальными клетками к периферии фокусов гемопоэза. Эритрокариоциты чаще ассоциированы с макрофагами. Однако, учитывая возможность трансформации ретикулярных клеток в элементы, обладающие фагоцитарной способностью, можно предположить, что среди макрофагальных элементов эритроцидных островков имеются ретикулярные клетки, способные к фагоцитозу.

Тесная гистотопографическая взаимосвязь ретикулярных и гемопоэтических клеток подтверждает положение о функциональных взаимоотношениях между ними. Таким образом, совершенно очевидно, что гетерогенность популяции ретикулярных клеток может быть проявлением их функциональных различий и отражением специфической роли в формировании кроветворного микроокружения.

Адипоциты. В условиях нормального кроветворения жировые клетки заполняют у взрослых все пространство костномозговой полости, не 70 Часть 1. Теоретическая гематология занятое миелоидной тканью. Как правило, форма адипоцитов шаровидная или слегка овальная. Обычно клетка содержит единственную крупную жировую вакуоль, занимающую практически всю цитоплазму. Последняя видна в виде небольших участков по краям ядер. В зрелых адипоцитах ядра всегда расположены эксцентрично, имеют ровные контуры, вытянутую форму, мелкозернистую структуру хроматина с конденсацией по периферии. В промежутках между жировыми клетками диффузно расположены гранулоциты. Иногда адипоциты тесно прилежат к поверхности костных балок. В таких участках молодые гемопоэтические клетки не выявляются. В интрамедуллярных пространствах подвздошной кости взрослых объем жировой ткани составляет около 30% площади гистологического препарата.

При ультраструктурном исследовании органеллы обнаруживаются в перинуклеарной зоне. Выявляются в небольшом количестве канальцы незернистой эндоплазматической сети, свободные рибосомы, крупные митохондрии с элетроннопрозрачным матриксом и короткими кристами. Наряду с такими зрелыми адипоцитами встречаются молодые формы, имеющие широкую цитоплазму с большим количеством органелл и пусками микрофиламентов, проходящих в различных направлениях.

Каких-либо ультраструктурных особенностей в местах межклеточных контактов зрелых адипоцитов с гемопоэтическими предшественниками, которые позволили бы предположить наличие функциональной связи, не выявлено. В то же время при электронно-микроскопическом исследовании можно отметить тесные взаимоотношения незрелых жировых клеток (преадипоцитов) с молодыми гранулоцитарными элементами. У незрелых адипоцитов отмечена высокая функциональная активность, а в местах межклеточных контактов с кроветворными предшественниками обнаружены перестройки плазмолемм преадипоцитов, подобные тем, которые наблюдали в межклеточных контактах ретикулярных и кроветворных клеток. По всей видимости, незрелые жировые клетки оказывают влияние на гранулоцитопоэз. Как известно, in vitro показана способность молодых жировых клеток влиять на пролиферацию и дифференцировку гранулоцитарных предшественников с помощью гуморальных факторов и межклеточных контактов. Что касается зрелых жировых клеток, то они являются энергетическими депо костного мозга и лабильным матриксом, легко теряющим липиды для обеспечения плацдарма развития гемопоэтических клеток в условиях повышенного запроса при различных экстремальных ситуациях. Способность адипоцитов адсорбировать на Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга 71 своей поверхности широкий спектр физиологически активных субстанций позволяет жировым клеткам непосредственно участвовать в гуморальной регуляции процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических предшественников.

Эндостальные клетки При морфометрическом исследовании площадь трабекул губчатого вещества подвздошной кости в норме составляет 20,0 ± 4%.

Костные балки правильной формы, имеют гладкие ровные края.

Их эндостальная поверхность выстлана сплошным слоем клеток, среди которых выявляются клетки двух основных типов. Первые характеризуются резко уплощенной вытянутой формой, небольшим объемом цитоплазмы, темными узкими ядрами. Вторые отличаются полигональными очертаниями, более обильной цитоплазмой, округлыми, содержащими ядрышки ядрами. В некоторых участках отчетливо прослеживается двуслойное расположение эндостальных клеток. Число клеток первого и второго типов в единице площади эндостальной поверхности составляет соответственно 1,17 ±0,26 и 0,09 ±0,02.

Молодые кроветворные клетки (миелобласты, промиелоциты) и мононуклеары типа лимфоцитов зачастую определяются вблизи трабекулярной поверхности в местах расположения эндостальных клеток с просветленными ядрами. В таких очагах количество стромальных клеток увеличено. Часть из них находится в тесном контакте с кроветворными клетками. По мере созревания гранулоциты смещаются в центральные отделы лакун.

Электронно-микроскопический анализ эндостальной и субэндостальной зон подвздошной кости показывает присутствие в них довольно гетерогенной группы стромальных клеток, отличающихся ультраструктурной организацией. Непосредственно на поверхности кости наиболее часто выявляются резко уплощенные вытянутые клетки с небольшим количеством органоидов и электронноплотной цитоплазмой, распространявшей остростки в костное вещество. Реже встречаются крупные клетки со сравнительно гладкими контурами. Их цитоплазма характеризуется большим количеством внутриклеточных органелл. Округлые ядра всегда имеют электронноплотные ядрышки. Оба типа клеток располагаются на матриксе, который состоит из большого количества примерно одинаковой толщины коллагеновых фибрилл с отчетливой поперечной исчерченностью.

Кроме описанных двух видов зндостальных элементов на костных балках обнаруживаются стромальные клетки третьего типа.

.72 Часть 1. Теоретическая гематология Вне зон активного гемопоэза, когда к кости прилежит жировая ткань или зрелые гемопоэтические элементы, кроветворная паренхима отделяется от эндоста истонченным клеточным пластом, элементы которого обозначаются как клетки «костномозгового мешка».

Толщина слоя эндостальных клеток в различных участках трабекулярной кости варьирует. Прежде всего клеточность эндоста и его структура находится в зависимости от присутствия в эндостальной зоне молодых гемопоэтических клеток гранулоцитарного ряда. В тех местах, где определяются признаки повышенной пролиферативной активности гемопоэтической ткани, эндостальная зона отличается увеличенным количеством стромальных клеток в состоянии повышенной функциональной активности, которые тесно прилежат к молодым кроветворным элементам. Характер межклеточных контактов указывает на существование функциональных взаимосвязей между стромальными элементами эндоста и гемопоэтическими предшественниками. Кроме этого, эндостальные клетки играют роль сеплективно проницаемой мембраны, регулирующей ионный обмен между костным матриксом и интрамедуллярной средой костного мозга. При этом особо важное значение имеет обмен кальция, который, как известно, играет значительную роль в развитии гемопоэтических клеток. Этому способствует присутствие в популяции эндостальных клеток — остеобластов, объем которых достигает 10%. Также хорошо известно, что в костном мозге наибольшая концентрация стволовых кроветворных клеток обнаруживается эндостально, а пролиферативная активность эндостальных зон значительно выше таковой на расстоянии от эндоста. С одной стороны, это связано с оптимальной концентрацией ионов кальция, с другой, — со способностью стромальных клеток создавать соответствующее микроокружение для стволовых клеток и влиять на развитие гемопоэтических предшественников посредством межклеточных контактов и широкого спектра гуморальных факторов.

Следует отметить, что кроме охарактеризованных выше клеточных элементов в состав стромы костного мозга входят также миоциты сосудов, фибробласты и фиброциты, располагающиеся по ходу части сосудов, нервные клетки. Естественно, они принимают участие в поддержании функции костного мозга как кроветворного органа. При этом их влияние сводится к обеспечению кровотока. Инструктивная, регуляторная роль процессов самоподдержания, пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников осуществляется эндотелием синусоидальных сосудов, жировыми, ретикулярными и эндостальными клетками.

Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга 73 Совершенно очевидно, что функциональные и структурные изменения элементов микроокружения могут быть причиной нарушений кроветворной функции костного мозга.

В связи с этим ключевым является вопрос об участии стромы костного мозга в развитии патологических состояний гемопоэза. В настоящее время твердо установлено значение дефектов стромы костного мозга в развитии апластической анемии, миелодисплазий, острых и хронических форм лейкозов, иммунодефицитных состояний (Duhrsen U., Hossfeld D., 1996; Tauros S. et al., 2002). В связи с этим учет изменений стромального микроокружения необходим как для определения оптимального лечения, так и для целей прогнозирования заболеваний.

Как известно, клетки стромы костного мозга, так же как и все клеточные линии гемолимфопоэза, имеют мезенхимальное происхождение. Также установлено присутствие мезенхимальных стволовых клеток, подобных эмбриональным, в костном мозге взрослых. Указанные клетки являются источником развития стромы костного мозга в течение жизни человека и, по мнению некоторых исследователей, они обладают способностью развиваться в кроветворные предшественники. Интерес к стволовым клеткам вообще и стволовым клеткам костного мозга в частности повысился в связи с обнаруженным свойством пластичности стволовых клеток, т. е. способности стволовых клеток одной линии развиваться в другие клеточные линии (Yannaki Е., 2001; Krause D., 2001; La Russa V.

et al., 2002). Так, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга взрослого человека могут дифференцироваться в кардиомиоциты, гепатоциты, нервные клетки и др. В связи с этим использование стволовых клеток костного мозга взрослых не ограничивается их применением только в лечении гематологических заболеваний.

В настоящее время стволовые клетки костного мозга, периферической и пуповиннои крови начинают использовать в лечении ряда соматических заболеваний.

Литература Ругань В. И., Блинова Т. С, Пономаренко В. М., Абдулкадыров К. М. Ультраструктурная организация кроветворного микроокружения костного мозга человека //' Гематология и трансфузиология. 1991. № 3. С. 11-14.

Теодорович В. П., Абдулкадыров К. М. Трепанобиопсия костного мозга при некоторых гематологических заболеваниях. Л.: Медицина, 1977. 95 с.

Duhrsen i'., Hossfeld D. Stromal abnormalities in neoplastic bone marrow diseases // Ann. Hematol. 1996. V 73. P. 53-70.

Krause D. Plasticity of marrow-derived stem cells // Gene Ther. 2001. V. 9, N 11.

P. 754-758.

Глава 5

ЦИТОХИМИЯ КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА

Среди многих современных и высокоинформативных методов диагностики лейкозов морфоцитохимия прочно сохраняет свое место, и необходимость применения морфоцитохимических методов диагностики лейкозов не вызывает сомнений.

Цитохимия основывается на использовании цветных химических реакций для определения химической природы клеток и выявления в них метаболически активных энзимов и веществ. Химический состав нормальных клеток крови и костного мозга изучен достаточно хорошо. Диагностическая цитохимия лейкозов базируется на том, что лейкозные клетки, особенно до начала химиотерапии, сохраняют особенности метаболизма и многие из основных свойств, присущих их нормальным аналогам. Поэтому идентификация лейкозных бластов, а значит, и установление варианта лейкоза в немалой степени основываются на выявлении этих свойств.

Одним из способов идентификации клеток и определения их принадлежности к соответствующей клеточной линии является определение с помощью цитохимических реакций характеризующих их субстанций и энзимов. Среди них наибольшее диагностическое значение имеют ферменты — миелопероксидаза, кислая и щелочная фосфатазы, неспецифические эстеразы (а-нафтилацетат-эстераза, кислая неспецифическая эстераза, сх-нафтилбутират-эстераза и хлорацетат-эстераза), а также такие субстанции, как липиды и углеводы.

Цитохимическая характеристика клеток крови Углеводы играют важную роль в клеточном метаболизме. Их расщепление сопровождается выделением большого количества энергии, обеспечивая таким образом энергетические потребности 76 Часть 1. Теоретическая гематология клетки. Разнообразные соединения углеводов включают моно- и полисахариды, в том числе гликоген, кислые мукополисахариды, а также гликопротеиды, гликолипиды и др. Для выявления углеводов применяют реакцию с использованием реактива Шифф и йодной кислоты — ШИК-реакция, она же PAS-реакция (Periodic Acid Schiff). Реакция выявляет в клетках не только гликоген, но и некоторые другие углеводы, однако гликоген — самый распространенный и основной полисахарид.

В миелобластах полисахариды могут отсутствовать или может наблюдаться слабая диффузная или мелкогранулярная реакция.

По мере созревания клеток нейтрофильного ряда их количество возрастает. Наибольшее количество полисахаридов содержится в зрелых нейтрофилах, где они выявляются в виде ярко-малиновых гранул или интенсивной диффузной окраски цитоплазмы. Целесообразно использование контрольной реакции с амилазой, которая устраняет розовое окрашивание цитоплазмы в случае гликогеновой природы углевода. В эозинофилах полисахариды диффузно окрашивают цитоплазму и не содержатся в гранулах. По данным Д. Ф. Глузмана (1978), Ф. Г. Дж. Хейхо и Д. К. Кваглино (1983), в базофилах они не определяются, в то же время S. J. Galli и соавторы (1983) выявили PAS-положительное вещество в этих клетках. Лимфоциты содержат умеренное количество полисахаридов в виде мелких немногочисленных гранул, иногда в виде венчика вокруг ядра, на фоне неокрашенной цитоплазмы. Согласно Ф. Г. Дж. Хейхо, Д. К. Кваглино, в норме 10-40% лимфоцитов содержат PAS-положительное вещество. В моноцитах оно распределяется в виде мелких пылевидных гранул на фоне бледно-розовой цитоплазмы. Реакция тромбоцитов на полисахариды высокоположительна. Мегакариоциты содержат их в виде рассеянных гранул на диффузном фоне. Контрольный тест с амилазой подтверждает гликогеновую природу полисахарида в этих клетках.

Кислые сульфатированные мукополисахариды включают хондроитин-4-сульфат и выявляются цитохимически, главным образом в незрелых миелоидных клетках (Морозова В. Т., 1977; Харченко М. Ф. и др., 1986; Kolset S. О., Gallagher J. Т., 1990).

Оксидазы — ферменты, катализирующие окислительные процессы молекулярным кислородом. Среди них особое значение имеет миелопероксидаза (МП). Энзим миелопероксидаза является очень важным компонентом клеток, особенно нейтрофилов. Она служит маркером клеток нейтрофильного ряда и располагается в основном в первичных лизосомальных гранулах (Бронштейн М. И., Френкель М. А., 2002). Этот фермент катализирует окисление разГлава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга 77 личных субстратов, например фенолов и некоторых аминокислот в присутствии перекиси водорода, которую он расщепляет. Активность МП обнаруживается уже на стадии миелобласта и возрастает в процессе созревания клетки, однако наибольшую активность фермента демонстрируют промиелоциты. Слабое окрашивание цитоплазмы эритроцитов и нормобластов выявляет псевдопероксидазу — продукт реакции с гемоглобином (Koike T. et al., 1986).

В эозинофилах выявляется специфическая эозинофильная пероксидаза. По данным одних авторов, МП никогда не выявляется в базофилах (Глузман Д. Ф. и др., 2000), в то время как другие находят, что она содержится в базофильных про- и миелоцитах и почти отсутствует в зрелых базофилах (Parwaresch M. R., 1976). Мы же не наблюдали активность МП в зрелых базофилах. В мегакариоцитах и тромбоцитах присутствует специфическая тромбоцитарная МП, которая определяется с помощью электронной микроскопии. Часть моноцитов дает реакцию на пероксидазу от умеренной до слабой.

Липиды — важная составная часть лейкоцитов — представляют собой разнообразные соединения, включающие простые липиды:

эфиры жирных кислот, в том числе нейтральные жиры, и сложные липиды в составе фосфолипидов, гликолипидов (цереброзидов), аминолипидов, сульфолипидов и др. Они содержатся во многих клетках крови, за исключением лимфоцитов и эритроидных клеток. Для выявления липидов существует несколько методов, но чаще применяют метод Sheehan и Storey (1947) и Ackerman (1952) с Суданом черным Б, который окрашивает фосфолипиды в черный цвет. Наибольшее их количество содержится в клетках нейтрофильного ряда, начиная с миелобласта, и реакция усиливается с увеличением зрелости клетки. Половина нейтрофилов содержит фосфолипиды в составе специфической зернистости. Эозинофилы демонстрируют'сильно положительную реакцию на липиды, которые содержатся в их гранулах. Реакция на липиды в базофилах, особенно незрелых, положительна, хотя и очень вариабельна (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Моноциты могут давать отрицательную реакцию на липиды, но чаще в них выявляется вариабельное количество мелких гранул, иногда в виде пылевидной зернистости.

Фосфатазы входят в состав гидролаз. Эти ферменты широко распространены в клетках человека и животных. Они участвуют в обменных процессах с жирами, полисахаридами и нуклеопротеидами.

Кислые фосфатазы (КФ) включают изоферменты, катализирующие освобождение фосфата из спиртовых или фенольных 78 Часть 1. Теоретическая гематология моноэфиров при кислой рН среды. Кислые фосфатазы локализованы в лизосомах и цитохимически выявляются благодаря образованию окрашенных участков красного цвета в местах гидролиза субстрата. В качестве субстрата могут быть использованы нафтолAS-фосфат, а-нафтилфосфат натрия, нафтол-А8-О-фосфат и др.

Кислая фосфатаза присутствует в большинстве клеток крови и костного мозга. В гранулоцитах, моноцитах, эозинофилах и базофилах она выявляется, начиная с незрелых клеток этих рядов, где ее активность наиболее высокая. Во многих клетках, в том числе в моноцитах, она ингибируется ионами тартрата (Глузман Д. Ф. и др., 2000). Активность фермента определяется в лимфобластах и лимфоцитах, где она очень вариабельна. Наибольшая активность среди клеток этой серии наблюдается в Т-лимфоцитах. Реакция положительна в плазматических клетках, мегакариоцитах, тромбоцитах и эритробластах. Высокую активность КФ демонстрируют макрофаги. Активность фермента снижена в лимфоцитах при хроническом миелолейкозе (ХМЛ). В нейтрофилах повышение ее активности наблюдается при ХМЛ, истинной полицитемии и миелофиброзе.

Щелочные фосфатазы (ЩФ) также относятся к группе гидролитических ферментов. Они способны освобождать фосфат, катализируя отщепление фосфатных групп из фосфомоноэфиров в щелочной среде. ЩФ принимают участие в обмене липидов и нуклеиновых кислот (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Активность ЩФ присуща только зрелым гранулоцитам. Иногда она может выявляться в метамиелоцитах (Бронштейн М. И., Френкель М. А., 2002). Фермент локализуется во вторичных гранулах и пластинчатом комплексе. В эритроцитах, тромбоцитах, моноцитах ЩФ не выявляется. Небольшая ее активность наблюдается в единичных лимфоцитах. Базофилы реагируют отрицательно, а эозинофилы могут демонстрировать слабую фоновую окраску (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Содержание ЩФ повышается при воспалительных состояниях, бактериальных инфекциях, лёйкемоидных реакциях, миелофиброзе, полицитемии и снижается при хроническом миелолейкозе, некоторых миелодиспластических синдромах и пароксизмалыюй ночной гемоглобинурии. Фермент выявляется в виде желто-коричневых гранул в цитоплазме.

Изофермент N-щелочная фосфатаза определяется иногда в лимфоидных клетках у больных хроническим лимфолейкозом, при лимфомах мантийной зоны (Nanba К. et.al., 1975).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 11 |
Похожие работы:

«ВВЕДЕНИЕ В АМЕРИКАНСКОЕ ПРАВО Лоуренс Фридмэн American Law Lawrence M. Friedman ВВЕДЕНИЕ В АМЕРИК4НСКОЕ W-W-Norton & Company прав New York • London о МОСКВА ИЗДАТЕЛЬСКАЯ ГРУППА «ПРОГРЕСС» «УНИВЕРС» Глава 1...»

«Александр Ващенков Бройлеры. Выращивание кур и уток мясных пород Текст предоставлен правообладателем http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=9067334 Бройлеры. Выращивание кур и уток мясных пород / Александр Ващенков: Клуб Семейного Досуга; Белгород; 2014 ISBN 978-5-9910-3077-9 Ан...»

«М. Ерохова Косвенные и коллективные иски в АПК РФ и ГК РФ. Тезисы.1.Цель допущения оспаривания сделки и взыскания убытков участником юридического лица Цель допущения участников и членов совета дирек...»

«Чистяков Константин Владимирович Криминальная ксенофобия: объяснение и предупреждение 12.00.08 – Уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва 2014 Работа выполнена на кафедре уголовно-правовых дис...»

«Эрнст Й. Кипхард Как развивается ваш ребенок? Текст предоставлен правообладателем http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=178608 Как развивается ваш ребенок? / Эрнст Й. Кипхард.: Теревинф; Москва; 2006 ISBN 5-901599-55-1 Аннотация Доктор Эр...»

«Октябрь — 2012 — October СВЯТО-ПАНТЕЛЕИМОНОВСКИИЙ ЛИСТОК SAINT PANTELEIMON LEAFLET Издается приходом Published by Parish of великомученика и целителя Пантелеимона Greatmartyr and Healer Panteleimon в Миннеаполисе, штат Миннесота in Minneapolis, Minnesota Чикагской и Средне-Американской Еп...»

«1 АННОТАЦИИ К СТАТЬЯМ ГРАЖДАНСКОЕ И ПРЕДПРИНИМАТЕЛЬСКОЕ ПРАВО ПУДАКОВ Евгений Рустамович, кандидат юридических наук, заведующий кафедрой уголовного права, процесса и криминалистики Башкирского и...»

«СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ СКАНИРОВАНИЯ. Для кожної конкретної ІТС склад, структура та вимоги до КСЗІ визначаються властивостями оброблюваної інформації, класом автоматизованої системи та умовами експлуатації ІТС. Висновки Аналіз вітчизняної но...»

«дет изменить – это будет видно только после того, как он заработает в полную силу. И если возникнет необходимость внести изменения, а это представляется неизбежным, то они будут внесены. Только хотелось бы, чтобы выводы делались не поспешно, а лишь после того,...»

«УДК 347.73 Бочкарева Екатерина Александровна Bochkaryova Ekaterina Aleksandrovna кандидат юридических наук, PhD in Law, доцент кафедры государственно-правовых Assistant Professor of the State дисциплин Legal Disciplines Department, Северо-Кавказского филиала North Caucasus br...»

«Кипр Справочник по налогообложению Услуги в сфере налогообложения Содержание «Делойт» на Кипре Налог на доходы физических лиц Налог на доходы компаний Взнос в фонд обороны Прибыль от деятельности по морским перевозкам Налог на прирост капитала Налог на недвижимое имущ...»

«КОНСПЕКТ ЛЕКЦИЙ ПО ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ Публикуется с разрешения правообладателя — Литературного агентства «Научная книга» Е. В. Ситкалиева Представленное издание — необходимое пособие для абитуриентов и студентов медицинских вузов, которое...»

«618100, Куйбышева ул., д. 35, г.Оханск Администрация Оханского муниципального района Главе администрации Зубрикову А.И. от На № Уважаемый, Андрей Иванович! В настоящее время имеют место случаи, когда садоводы, дачники не могут оформить п...»

«Ф едеральное государственное бю джетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПУТЕЙ СООБЩЕНИЯ» Кафедра «Теология» Г.И. М А Л И Н Ч Е В А ПРАВОСЛАВНОЕ УЧЕНИЕ О ДУХОВНОМ МИРЕ Рекомендовано редакционно-и...»

«1 Постановления Президиума ВАС РФ по актуальным вопросам частного права (на основе публикаций на сайте ВАС РФ в мае 2013 г.)1 Постановление Президиума ВАС РФ от 26.02.2013 № 12913/12 (нет оговорки о возможности пересмотра по новым обстоятельствам) (Ключевые с...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «САРАТОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЮРИДИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» «УТВЕРЖДАЮ» Первый проректор, проректор по учебной работе _С.Н. Туманов «22» июня 2012 г. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕС...»

«Владимир Васильевич Брюзгин Лечебное питание при онкологических заболеваниях Текст предоставлен правообладателем. http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=594025 Брюзгин В. В. Лечебное питание при онкологических заболеваниях: Эксмо; Москва; 2011 ISBN 978-5-699-44441-0 Аннотация Онкологи считают, что у взрослых людей около трети видов р...»

«КОНСТИТУЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ АРАБСКИХ ЭМИРАТОВ Поправки к конституции.1. поправка от 2004 года, принятая Высшим Советом ОАЭ согласованно с Национальным Советом ОАЭ, гласит: статья 1: «Данная поправка изменяет текст 121-й статьи конституции ОАЭ следующим...»

«Примеры наличия коррупциогенных факторов в проектах НПА. Широта дискреционных полномочий отсутствие или неопределенность сроков, условий или оснований принятия решения, наличие дублирующих полномочий органов государственной власти или органов местного самоуправления (их должностных лиц); Пример № 1.Пункт 4.12. п...»

«Франсуаза Дольто Жан-Давид Назьо Ребенок зеркала Текст предоставлен правообладателем http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=12005031 Дольто Ф., Назьо Ж.-Д. Ребенок зеркала: ПЕР СЭ; Москва; 2004 ISBN 5-9292-0122-6 Аннотация Книга «Ребенок зер...»










 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.