WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:   || 2 |

«5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 ВВЕДЕНИЕ 6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 1.1. Общая схема терминации трансляции 9 1.2. Факторы терминации трансляции ...»

-- [ Страница 1 ] --

5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Общая схема терминации трансляции 9

1.2. Факторы терминации трансляции первого класса 11

1.3. Факторы терминации трансляции первого класса 17

1.4. Декодирование стоп-кодона факторами терминации трансляции первого класса 21

1.5. Гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре 27 1.5.1. Молекулярная анатомия пептидил-трансферазного центра 27 1.5.2. Роль рРНК в реакции гидролиза пептидил-тРНК 29 1.5.2. Роль факторов терминации трансляции первого класса в реакции гидролиза пептидил-тРНК 34 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 40

2.1. Материалы 40 2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды 40 2.1.2. Среды 41 2.1.3. Реактивы 41 2.1.4. Ферменты 42 2.1.5. Олигонуклеотиды 42

2.2. Методы исследований 44 2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 44 2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 44 2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК 45 2.2.4. Трансформация E. coli плазмидной ДНК 45 2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 46 2.2.6. Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраймера" 46 2.2.7. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе 47 2.2.8. Сверхэкспрессия в E. coli и выделение мутантных форм eRF1 человека 47 2.2.9. Сверхэкспрессия в E. coli и выделение изолированного М- домена eRF1 человека и его мутантной формы G183A, меченных стабильными изотопами 15N и 13С 48 2.2.10. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ 50 2.2.11. Измерение спектров ЯМР и их анализ 50 2.2.12. Расчет структуры 52 2.2.13. Анализ динамических свойств 53 2.2.14. ЯМР-титрование субчастицами рибосом 54 2.2.15. Определение активности eRF1 55 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 56



3.1. Определение структуры М-домена eRF1 человека в растворе 56 3.1.1. Отнесение сигналов атомов основной белковой цепи и боковых цепей аминокислотных остатков M-домена 56 3.1.2. Определение вторичной и третичной

–  –  –

Механизм терминации трансляции, заключительной стадии биосинтеза полипептидной цепи у эукариот, до настоящего времени остается во многом неизученным. Ключевую роль в узнавании стоп-кодона в А-участке малой субчастицы рибосомы эукариот, передаче сигнала в большую субчастицу, а также последующем гидролизе сложноэфирной связи в пептидил-тРНК играет белковый фактор терминации трансляции первого класса eRF1. Ранее методом рентгеновской кристаллографии было показано, что молекула eRF1 состоит из трех доменов: N-концевого, или N-домена, среднего, или Мдомена, и С-концевого, или С-домена. N-домен ответственен за узнавание стоп-кодонов матричной РНК. С-домен взаимодействует с фактором терминации второго класса eRF3, за счет чего последний стимулирует активность eRF1. М-домен содержит высококонсервативный трипептидный фрагмент GGQ, необходимый для гидролиза пептидил-тРНК как в эукариотах, так и в прокариотах. Результаты структурных и биохимических исследований указывают на то, что минидомен GGQ располагается в пептидилтрансферазном центре большой субчастицы рибосомы. Абсолютная консервативность GGQ-мотива в факторах терминации первого класса всех живых организмов указывает на его исключительную роль в процессе терминации трансляции.

Полученная ранее структура eRF1 в кристалле имеет относительно низкое разрешение, особенно в подвижных функционально важных участках, таких, как, например, петля, содержащая трипептид GGQ, или GGQ-петля.





Несмотря на интенсивные исследования в области терминации белкового синтеза, проведенные в последнее десятилетие, многие вопросы остаются невыясненными: каким образом происходит передача терминационного сигнала от малой субчастицы рибосомы к большой, как происходит гидролиз пептидил-тРНК и какую роль в нем играет М-домен eRF1? Для понимания механизма реакции терминации трансляции у эукариот необходимы дальнейшие углубленные исследования структуры, динамических свойств и функциональных особенностей отдельных доменов Поэтому eRF1.

исследования в данном направлении представляются актуальными.

Целями данной работы являлись определение структуры высокого разрешения М-домена eRF1 человека в растворе, изучение его динамических свойств, связывания М-домена eRF1 с рибосомой эукариот и определение функциональной роли минидомена в механизме терминации GGQ трансляции. Для определения структуры М-домена eRF1 нами был выбран метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), который в последние годы широко используется для определения структуры различных белковых молекул в растворе. Методы ЯМР позволяют также определить динамические свойства белка и исследовать его взаимодействие с другими биомолекулами. В задачи работы входило: 1) получение высокоочищенных препаратов М-домена eRF1 человека, меченных стабильными изотопами 13C и N; 2) получение меченого препарата мутантной формы М-домена eRF1 Gly183Ala, неактивного в функциональных тестах; 3) измерение и последующий анализ гетероядерных 2D и 3D спектров ЯМР для расчета структуры М-домена и определения его динамических свойств; 4) изучение взаимодействия М-домена eRF1 с рибосомами эукариот; 5) выполнение точечных замен аминокислотных остатков в GGQ-петле М-домена eRF1 методом сайт-направленного мутагенеза; выделение, очистка и 6) исследование функциональной активности полученных мутантных форм eRF1 человека.

В данной работе впервые определена структура высокого разрешения в растворе М-домена eRF1 человека и изучены его динамические свойства. С помощью методов ЯМР нами было исследовано взаимодействие М-домена eRF1 с большой 60S субъединицей рибосомы эукариот, установлена его специфичность и идентифицированы аминокислотные остатки М-домена, образующие возможный интерфейс такого взаимодействия. В работе также было проведено изучение функционального вклада каждого из инвариантных и полуконсервативных аминокислотных остатков в составе минидомена GGQ. Полученные структурные и функциональные данные позволили впервые предложить модель механизма реакции гидролиза пептидил-тРНК в пептидил-трансферазном центре рибосомы, в которой eRF1 служит непосредственным катализатором.

Результаты представленной работы существенно углубляют понимание молекулярного механизма терминации белкового синтеза трансляции у эукариот, что имеет важное значение для детального изучения процесса синтеза белка в эукариотической клетке в целом.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая схема терминации трансляции Терминация трансляции, заключительная стадия биосинтеза полипептидной цепи, происходит в тот момент, когда в A-участке рибосомы оказывается один из трех стоп-кодонов транслируемой мРНК – UAA, UAG или UGA. В ответ на присутствие в А-сайте стоп-кодона с рибосомой связываются белковые факторы, получившие название факторов терминации трансляции (RF). Они делятся на два класса. RF первого класса осуществляют узнавание стоп-кодона в А-сайте малой субчастицы рибосомы, передают сигнал в пептидилтрансферазный центр (ПТЦ) большой субчастицы и вызывают гидролиз пептидил-тРНК, в результате чего синтезированный полипептид высвобождается из рибосомы. RF второго класса являются рибосомозависимыми стимулирующими GTP-азами, активность факторов 1-го класса.

Общая схема терминации трансляции представлена на рисунке 1.1.

После распознавания стоп-кодона RF 1-го класса вызывают гидролиз сложноэфирной связи в пептидил-тРНК, что приводит к высвобождению синтезированного полипептида из рибосомы. У прокариот (рис. 1.1.а) RF 1-го класса диссоциируют из комплекса с рибосомой в результате действия фактора 2-го класса RF3 и GTP. RF3 в комплексе с GDP связывается с рибосомой, затем происходит диссоциация GDP из комплекса и образуется комплекс из рибосомы, RF 1-го класса и RF3. Далее с RF3 связывается GTP, который вызывает конформационные изменения RF3, в результате чего RF 1го класса диссоциируют из рибосомы. Затем происходит гидролиз GTP и диссоциация самого RF3 из рибосомы, после чего с ней связывается фактор рециклинга рибосом RRF. Затем происходит связывание фактора элонгации EF-G в комплексе с GTP и последующий гидролиз GTP, приводящий к диссоциации малой и большой субчастиц рибосомы. После этого с малой Рис. 1.1. Общая схема терминации трансляции у прокариот (а) и эукариот (б) (Petry et al., 2008).

субчастицей связывается фактор инициации IF3, в результате чего происходит высвобождение мРНК и тРНК из Р-сайта. У эукариот (рис.

1.1б) с А сайтом рибосомы связывается фактор терминации 1-го класса eRF1, с которым в свою очередь связывается фактор 2-го класса eRF3. Связывание с eRF1, eRF3 и GTP приводит к полной или частичной транслокации кодона вместе с антикодоновой петлей тРНК из P-частка в Е-участок и стоп-кодона из А-участка в P-участок (Alkalaeva et al., 2006). Далее происходит гидролиз GTP и вновь образованный комплекс eRF3.GDP легко диссоциирует из рибосомы. После этого сложноэфирная связь в пептидил-тРНК гидролизуется под действием eRF1 и высвобождается синтезированный полипептид. После этого, согласно данным недавних исследований, посттерминационный комплекс диссоциирует под действием факторов инициации eIF3, eIF1, eIF1A и eIF3j (Pisarev et al., 2007)

1.2. Факторы терминации трансляции первого класса У прокариот обнаружено два фактора терминации 1-го класса, RF1 и RF2, которые узнают стоп-кодоны UAA/UAG и UAA/UGA, соответственно.

В эукариотах, архебактериях и митохондриях все три стоп-кодона узнаются одним фактором (eRF1, aRF1 и mtRF1, соответственно). Однако, как было обнаружено, в некоторых организмах фактор eRF1 присутствует в виде двух гомологов. У ресничных инфузорий рода Euplotes таких гомологов два ((Inagaki and Doolittle, 2001; Liang et al., 2001), а у растения Arabidopsis thaliana – три (Chapman and Brown, 2004). Неизвестно узнают ли эти гомологи одни и те же или различные стоп кодоны. У человека ген eRF1 представлен четырьмя копиями – на 5-ой, 6-ой, 7-ой и Х-хромосомах, однако функционально активной является только одна (на 5-ой хромосоме), а остальные представляют собой псевдогены (Guenet et al., 1999).

В нескольких родах инфузорий, таких как Paramecium, Tetrahymena, и универсальные стоп-кодоны переводятся Stylonychia Oxytrychia, трансляционным аппаратом как глутамин. В качестве стоп-кодона выступает только один UGA (Caron and Meyer, 1985; Preer et al., 1985). Напротив, у инфузорий рода Euplotes стоп-кодоны UAA и UAG являются истинными стоп-кодонами, в то время как UGA-кодон кодирует цистеин (Meyer et al., 1991). У инфузории Blepharisma americanum UGA-кодон, возможно, кодирует триптофан (Lozupone et al., 2001). Декодирование стоп-кодонов в инфузориях было объяснено «гипотезой захвата кодона» (Osawa and Jukes, 1995), которая постулирует превращение стоп-кодонов в смысловые за счет генетических изменений в eRF1, мутационного давления и появлениия новых тРНК.

Прокариотические факторы RF1, RF2 по своей первичной структуре сходны между собой и с митохондриальным фактором mtRF1, однако существенно отличаются от эукариотических и архейных факторов eRF1/aRF1 (Frolova et al., 1994; Frolova et al., 1999; Kisselev et al., 2000; Song et al., 2000). Единственной общей чертой первичных структур всех RF 1-го класса является наличие мотива Gly-Gly-Gln (GGQ) (Frolova et al., 1999).

Абсолютная консервативность мотива GGQ у всех RF 1-го класса свидетельствует о его уникальной роли в процессе терминации трансляции.

Структурные (Laurberg et al., 2008; Petry et al., 2005; Song et al., 2000) и функциональные (Frolova et al., 1999; Mora et al., 2003b; Seit-Nebi et al., 2001;

Shaw and Green, 2007; Song et al., 2000; Zavialov et al., 2002) исследования указывают на его участие в катализе реакции гидролиза сложноэфирной связи в пептидил-тРНК. Механизм катализа до сих пор остается невыясненным.

Накопленные данные структурных и функциональных исследований ряда факторов терминации и элонгации позволили выдвинуть концепцию тРНК-белковой мимикрии, согласно которой некоторые участвующие в биосинтезе белка факторы структурно и функционально схожи с тРНК (Nakamura et al., 2000; Nakamura et al., 1996; Nissen et al., 2000b). Гипотеза мимикрии между тРНК и eRF1 была впервые выдвинута на основании лишь биохимических данных, указывающих на наличие конкуренции eRF1 с (а) (б) GGQ М

–  –  –

Рис. 1.2. Трехмерные структуры факторов терминации трансляции 1-го класса в сравнении с трехмерной структурой тРНК. (а) eRF1 (Song et al., 2000); (б) RF2 (Vestergaard et al., 2001); (в) Met-тРНК (Schmitt et al., 1998).

супрессорной тРНК (Drugeon et al., 1997; Le Goff et al., 1997). Позднее результаты рентгеноструктурного анализа подтвердили это предположение (рис. 1.2). Действительно, в кристалле eRF1 человека имеет структуру, напоминающу по форме букву «Y», сходную по размерам и форме с тРНК (Song et al., 2000).

Молекула eRF1 состоит из трех доменов: N-концевого (N-домена), среднего (М-домена) и С-концевого (С-домена) (рис. 1.2а).

Соответствующий антикодоновой ветви тРНК N-домен содержит сайт распознавания стоп-кодона. На это указывают: а) данные мутационного анализа in vivo на дрожжевом eRF1 (Bertram et al., 2000; Fan-Minogue et al.,

2008) и биохимические данные полученные in vitro на eRF1 человека (Frolova et al., 2002; Kolosov et al., 2005; Seit-Nebi et al., 2002), в которых сайтнаправленный мутагенез ряда аминокислотных остатков внутри N-домена приводил к существенным изменениям в декодировании стоп кодона; б) данных о специфичности к стоп-кодонам химерных белков (Ito et al., 2002;

Lekomtsev et al., 2007; Salas-Marco et al., 2006); в) данных по химическим сшивкам между первым U стоп-кодона и N-доменом eRF1 человека (Chavatte et al., 2002). Однако, точная последовательность и структура декодирующего сайта все еще неизвестны.

На противоположном конце молекулы находится М-домен, который соответствует акцепторному стеблю тРНК (Song et al., 2000).

Пространственное расположение М-домена, а также нахождение в его составе инвариантного мотива GGQ, указывают на его роль в связывании с ПТЦ и индукции гидролиза пептидил-тРНК.

Функции С-домена до сих пор до конца не выяснены. Известно, что его удаление из eRF1 не вызывает потерю RF-активности фактора in vitro (Frolova et al., 2000). Было установлено, что С-домен взаимодействует с фактором терминации второго класса eRF3 (Eurwilaichitr et al., 1999;

Возможно, через С-домен происходит и Merkulova et al., 1999).

взаимодействие eRF1 с другими белками. Обнаружено, что такие белки как Upf1p, Upf2p и Upf3p (Wang et al., 2001), Mtt1p (Czaplinski et al., 2000) и Itt1p (Urakov et al., 2001) способны связываться с дрожжевым eRF1, однако сайты связывания не установлены.

Сравнение кристаллических структур eRF1 (Song et al., 2000) и RF2 E.

coli (Vestergaard et al., 2001) показало, что не только по первичной, но и по пространственной структуре прокариотический и эукариотический факторы терминации трансляции 1-го класса сильно различаются. Молекула RF2 образована четырьмя доменами, расположенными по отношению друг к другу намного более компактно за счет большего количества междоменных нековалентных контактов (рис. 1.2б). При этом домены 2, 3 и 4 образуют практически глобулярную структуру, в основании которой находится относительно вытянутый домен 1. Несмотря на то, что общие размеры молекулы RF2 близки к размерам тРНК, в целом RF2 выглядит более объемным, что может говорить о большем числе возможных участков связывания с рибосомой. Мотив GGQ в данном случае, также как и в молекуле eRF1, образует петлю экспонированную на поверхности молекулы.

Расстояние между «трипептидным антикодоном» SPF, ответственным за декодирование стоп-кодона в А-сайте малой субчастицы рибосомы (см.

ниже), и мотивом GGQ в полученной кристаллической структуре RF2 составляет лишь 23, в то время как в молекуле тРНК расстояние между 3’ССА концом и антикодоновой петлей составляет 75. Таким образом, исходя из расстояния в кристалле мотив SPF и мотив GGQ не могут располагаться в декодирующем центре и в ПТЦ, соответственно, в одно и то же время.

Однако, как показало криоэлектронное микроскопическое исследование терминационного комплекса, при связывании с рибосомой происходит изменение конформации RF2 (рис. 1.3). Связавшись с рибосомой, фактор переходит в «открытую» конформацию, в результате чего мотив SPF узнает стоп-кодон в А-сайте малой субчастицы рибосомы, а GGQ-мотив взаимодействует с ПТЦ (Klaholz et al., 2003; Rawat et al., 2003). Такую смену конформации в ответ на связывание со стоп-кодоном претерпевает и фактор RF1, который в кристалле в свободной форме также находится в «закрытой»

конформации (Rawat et al., 2006; Shin et al., 2004). Как показали недавние исследования с помощью метода малоуглового рассеивания рентгеновских лучей, в растворе RF1 в свободной форме находится в «открытой»

конформации (Vestergaard et al., 2005).

Изменение конформации при связывании с рибосомой предполагается и для eRF1, в котором расстояние между узнающим первый U стоп-кодона мотивом NIKS (см. ниже) и GGQ составляет около 100 (Kisselev, 2002; Ma and Nussinov, 2004; Song et al., 2000).

Ma and Nussinov (2004) предположили, что в основе механизма изменения конформации RF2 лежит протонирование остатков гистидина в белке. Исследователи предполагают, что такой механизм может быть общим для прокариотических и эукариотических RF.

Рис. 1.3. Трехмерная структура прокариотического фактора терминации RF2.

Показано взаимное расположение SPF и GGQ мотивов в «закрытой» конформации RF2 в кристалле (Vestergaard et al., 2001) (А) и в «открытой» конформации при связывании с рибосомой (Klaholz et al., 2003) (Б).

1.3. Факторы терминации трансляции второго класса Факторы терминации трансляции второго класса – RF3 у прокариот и eRF3 у эукариот – представляют собой рибосомозависимые GTP-азы. Было показано, что для реакции терминации трансляции in vitro их участие не является необходимым (Frolova et al., 1994; Grentzmann et al., 1994; Mikuni et al., 1994; Zhouravleva et al., 1995). (Freistroffer et al., 1997)) установили, что RF3 E. coli не влияет на скорость связывания RF1 или RF2 с рибосомами, содержащими пептидил-тРНК в Р-сайте и стоп-кодон в А-сайте. Кроме того, было обнаружено, что RF3 так же не влияет на константу скорости гидролиза сложноэфирной связи в пептидил-тРНК. Однако под действием RF3 значительно повышалась скорость диссоциации факторов первого класса из терминационного комплекса, причем GTP-зависимым образом. Из этих экспериментов можно заключить, что функцией RF3 в терминационной реакции является высвобождение RF1 и RF2 из рибосомы в посттерминационном состоянии. Ранее предполагалось, что свободная форма RF3 присутствует в цитоплазме в комплексе с GTP. Это предположение основывалось на том, что соотношение GTP/GDP в клетке очень высоко, а также на экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что связывание RF3 с GDP всего в пять раз сильнее его связывания с GTP (Mortensen et al., 1995). Однако позднее было выяснено, что RF3 связвается с GDP по крайней мере на три порядка сильнее, чем с GTP (Zavialov et al., 2001). Эти данные говорят о том, что цитоплазматическая форма RF3, скорее всего, связана с GDP. Таким образом, RF3 должен в GDP-связанной форме подойти к рибосоме, после чего, если в рибосоме присутствует RF 1-го класса, GDP быстро диссоциирует из комплекса. Эта реакция происходит как в присутствии пептидил-тРНК, так и в присутствии деацилированной тРНК в Р-сайте (Zavialov et al., 2002) и приводит к образованию стабильного комплекса, состоящего из RF1 или RF2 и свободной формы (не связанной с гуанидином) RF3. Далее с RF3 связывается GTP, что приводит к изменению его конформации. Изменение конформации RF3 способствует диссоциации RF1/RF2 из рибосомного комплекса. Механизм, по которому RF3 вызывает диссоциацию RF 1-го класса из терминационного комплекса до конца не изучен. Результаты недавно проведенной криоэлектронной микроскопии комплекса RF3 с рибосомой позволяют предполагать, что RF3 вызывает конформационные перестройки в рибосоме, что, в свою очередь, приводит к диссоциации RF1/RF2 (Gao et al., 2007). В результате, образуется стабильный комплекс рибосомы, деацилированной тРНК в P-сайте и RF3 в связанной с GTP форме. Дальнейший гидролиз GTP необходим для диссоциации RF3 из рибосомы, в результате чего фактор способен принимать участие в новом цикле терминации трансляции (Zavialov et al., 2001; Zavialov et al., 2002).

Наименее изученной стадией в терминации трансляции прокариот является диссоциация посттерминационного комплекса и подготовка компонентов аппарата трансляции для следующего цикла. Считается, что главную роль в этом процессе выполняет фактор рециклинга рибосом RRF вместе с фактором элонгации EF-G (Weixlbaumer et al., 2007).

Посттерминационный комплекс содержит мРНК, деацилированную тРНК в P-участке и RRF в А-участке. Согласно одной из гипотез, EF-G за счет гидролиза транслоцирует из А-участка в Р-участок, а GTP RRF деацилированную тРНК из Р-участка в Е-участок рибосомы. Затем посттерминационный комплекс диссоциирует на составляющие его компоненты. Согласно второй гипотезе, RRF и EF-G способствуют диссоциации рибосом на субъединицы в GTP-зависимой реакции, а фактор инициации IF3 обеспечивает выход деацилированной тРНК из Р-участка 30S субъединицы (Karimi et al., 1999; Peske et al., 2005).

Механизм работы эукариотического фактора терминации 2-го класса eRF3 изучен намного меньше, чем RF3. Молекулу eRF3 можно поделить на 2 части: С-концевую и N-концевую. С-концевой участок eRF3 является высококонсервативным и абсолютно необходим для жизнеспособности клеток (Ter-Avanesyan et al., 1993). Эту часть молекулы eRF3 можно разделить на домен, который напоминает GTP-связывающий соответствующие домены в RF3 и в факторах элонгации EF-G, EF-Tu и EF1А, и второй С-домен, необходимый для взаимодействия с eRF1 (см.

обзоры (Kisselev et al., 2003; Kisselev and Buckingham, 2000).

В отличие от C-концевого участка, N-участок и отличается по длине и аминокислотной последовательности у разных организмов (Kushnirov et al., 1990). N-концевой участок не является жизненно необходимым и не участвует в терминации трансляции, но ответственен за взаимодействие с poly(A)-связывающим белком (PABP), которое является связующим звеном между терминацией и инициацией биосинтеза белка (Hoshino et al., 1999). В дрожжах S. cerevisiae N-домен eRF3 ответствен за образование прионной формы eRF3 [PSI+]. В клетках с генотипом [PSI+] фактор eRF3 образует агрегаты, которые связывают что приводит к снижению eRF1, эффективности терминации трансляции и повышению уровня сквозного прочтения на стоп-кодонах (Paushkin et al., 1996). В настоящее время неизвестно, возможно ли образование прионной формы eRF3 у высших эукариот.

У дрожжей было показано, что eRF3, кроме взаимодействия с eRF1, также взаимодействует с белками Upf1p, Upf2p и Upf3p, входящими в состав РНК-белкового комплекса, участвующего в деградации мРНК, содержащих преждевременный стоп-кодон (NMD). Эти взаимодействия, по-видимому, также оказывают влияние на эффективность терминации трансляции (Wang et al., 2001).

Kong et al. (2004) определили кристаллическую структуру С-концевой части eRF3 S.pombe, которая, как оказалось, в общих чертах напоминает структуру EF-Tu. Однако в отличие от EF-Tu, связывание eRF3 с GTP/GDP не приводит к большим конформационным изменениям eRF3. Ионы Mg2+ не влияют на связывание GTP с дрожжевым eRF3, а при высокой концентрации увеличивают высвобождение GTP из комплекса eRF3·GTP (Kong et al., 2004).

Исследователи высказали предположение, что обладает иным eRF3 механизмом нуклеотидного обмена по сравнению с другими GTPазами.

Недавно был проведен ряд исследований, связанных со взаимодействием eRF3 с GTP (Hauryliuk et al., 2006; Kononenko et al., 2007; Mitkevich et al., 2006; Pisareva et al., 2006), результаты которых позволили сделать ряд важных выводов. Свободный eRF3 имеет более высокое сродство к GDP, чем к GTP, и вероятно, в клетке eRF3 находится в связанной с GDP форме (eRF3·GDP), как и RF3 у прокариот. Однако, eRF1 оказывает сильный эффект на связывание GTP c eRF3 при образовании комплекса eRF1·eRF3. Такой комплекс уже имеет большее сродство к GTP, чем к GDP. Таким образом, скорее всего факторы терминации eRF1 и eRF3 связываются с рибосомой в форме комплекса eRF1·eRF3·GTP, аналогично связыванию комплекса EF1A·GTP·аминоацил-тРНК с рибосомой.

Вопрос каким образом eRF3 способствует терминации трансляции до сих пор остается открытым. Согласно схеме терминации трансляции, предложенной Alkalaeva et al. (2006), eRF3 непосредственно участвует в процессе гидролиза пептидил-тРНК в рибосоме вместе с eRF1, способствуя правильному позиционированию мотива GGQ в ПТЦ. По мнению авторов, при связывании с предтерминационным комплексом eRF1, eRF3 и GTP, мотив в ПТЦ располагается неправильно, что препятствует GGQ расщеплению пептидил-тРНК. В результате гидролиза вновь GTP, образованный комплекс eRF3.GDP легко диссоциирует из рибосомы, способствуя правильному расположению GGQ мотива в ПТЦ и расщеплению пептидил-тРНК последующим высвобождением синтезированного c полипептида. Предложенная схема согласуется с генетическими данными, полученными in vivo (Salas-Marco and Bedwell, 2004).

Исходя из выше представленных данных, можно сделать вывод, что прокариотический RF3 и эукариотический eRF3 выполняют разные роли в процессе терминации трасляции. RF3 способствует высвобождению RF1/RF2 из рибосомы, а eRF3 способствует быстрому и эффективному расщеплению пептидил-тРНК. Основное различие заключается в том, что расщепление пептидил-тРНК у прокариот предшествует и необходимо для гидролиза GTP, тогда как у эукариот гидролиз GTP необходим для расщепления пептидилтРНК. Другой механизм работы eRF3 у эукариот возможно, связан с необходимостью более точного узнавания всех трех стоп-кодонов с помощью одного eRF1, в то время как у прокариот высокая специфичность узнавания стоп-кодонов достигается за счет разделения функции узнавания между двумя факторами RF1 и RF2.

1.4. Декодирование стоп-кодона факторами терминации трансляции первого класса Распознавание стоп-кодона, в принципе, может осуществляться тремя путями: а) за счет самой рибосомы; б) за счет RF; в) в результате комбинированного действия рибосомы и RF. Было предположено, что рРНК может непосредственно взаимодействовать со стоп-кодоном мРНК (Arkov Эта гипотеза была обоснована несколькими and Murgola, 1999).

экспериментами. Во-первых, мутации рРНК существенно влияют на терминацию трансляции (Green and Noller, 1997; Velichutina et al., 2001). Вовторых, стоп-кодоны находятся в тесном контакте с рРНК в рибосоме (Chavatte et al., 2001; Chavatte et al., 2002; Poole and Tate, 2000). В-третьих, два сегмента прокариотической 23S рРНК (петли 69 и 89) могут принимать третичную структуру подобную тРНК с петлями, схожими с антикодоновыми, комплиментарными стоп-кодонам (Ivanov et al., 2001). Тем не менее, роль рРНК в декодировании стоп-кодонов до конца не выяснена.

Существует ряд свидетельств о прямом взаимодействии факторов терминации первого класса со стоп кодонами (Moffat and Tate, 1994;

Nakamura et al., 1996). Показано, что факторы терминации первого класса образуют специфические химические сшивки с нуклеотидами стоп-кодонов мРНК (Bulygin et al., 2002; Chavatte et al., 2001; Chavatte et al., 2002; Poole and Tate, 2000). Установлено, что мутации в прокариотических (Ito et al., 2000;

Nakamura and Ito, 1998; Uno et al., 2002) и дрожжевых (Bertram, 2000; FanMinogue et al., 2008) RF 1-го класса, а также eRF1 человека (Frolova et al., 2002; Kolosov et al., 2005; Seit-Nebi et al., 2002) влияют на распознавание стоп-кодона.

Функциональные исследования, проведенные Ito et al. (2000), показали, что в прокариотических факторах RF1 и RF2 основную роль в определении специфичности узнавания стоп-кодона играют трипептидные мотивы ProAla/Val-Thr (P(A/V)T) и Ser-Pro-Phe (SPF), соответственно. Эти мотивы были названы антикодонами» и, как предположили «трипептидными исследователи, осуществляют прямое распознавание второго и третьего нуклеотида в стоп-кодоне. Структурные исследования также подтверждают гипотезу «белковых антикодонов»: в кристалле комплексов RF1 и RF2 в рибосоме петли факторов, содержащие мотивы P(A/V)T и SPF, сближены со стоп-кодоном в А-сайте (Laurberg et al., 2008; Petry et al., 2005). Недавно Laurberg et al. (2008) показали что мотив P(A/V)T взаимодействует с первым и вторым основанием стоп-кодона, а не вторым и третьим, тем не менее, данные взаимодействия осуществляются фактором напрямую, а роль 16S рРНК, по-видимому, заключается в правильном позиционировании RF1 в Асайте.

Относительно механизма декодирования стоп-кодона у эукариот фактором eRF1 предложено несколько гипотез, выдвинутых на основании данных по мутагенезу eRF1 (Bertram et al., 2000; Kolosov et al., 2005; SeitNebi et al., 2002) или анализе первичных структур eRF1 из различных организмов (Inagaki et al., 2002; Liang et al., 2005; Muramatsu et al., 2001;

Каждая гипотеза предлагает свой набор Nakamura et al., 2000).

аминокислотных остатков N-домена, предположительно участвующих в декодировании стоп-кодона (табл. 1.1). Гипотеза «белкового антикодона»

(Nakamura et al., 2000) заключается в том, что eRF1 узнает стоп-кодоны с помощью линейной последовательности аминокислотных остатков аналогично прокариотическим факторам RF1 и RF2. Было высказано предположение, что роль «белкового антикодона» могут играть Thr-Ala-Ser (положения 58-60; здесь и далее нумерация соответствует eRF1 человека).

Таблица 1.1.

Аминокислотные остатки, участвующие в декодировании стопкодонов согласно различным гипотезам. Нумерация соответствует eRF1 человека.

–  –  –

Liang et al., 2005 Gly31, Thr32, Ile62, Lys63, Cys127 Gly57, Ser70, Leu126 для универсального кода Ser57, Ser70, Phe126 для UGA-специфичности Gly57, Ala70, Ile126 для UAR-специфичности Muramatsu et al. (2001) предположили, что таким антикодоном могут быть аминокислотные остатки Gly57, Thr58, Asn60 и Ile61. По мнению авторов, Gly57 и Thr58 ответственны за узнавание второго, а Asn60 и Ile61 – третьего нуклеотида стоп-кодона. Согласно кристаллической структуре eRF1 положения 57/58 и 60/61 соответствуют положению антикодона в тРНК и расстояние между аминокислотными остатками 57/58 и 60/61 близко по значению к расстоянию между 2-ым и 3-им основаниями стоп-кодона.

Авторы предполагают, что в за узнавание 1-го U в стоп-кодоне ответствен остаток глутаминовой кислоты в положении 55.

Bertram et al. (2000), основываясь на биохимических исследованиях in vivo и результатах молекулярного моделирования, предположили, что стопкодон распознается не линейной последовательностью, а группой аминокислотных остатков eRF1, удаленных друг от друга в первичной структуре и образующих «узнающую полость» в пространстве. Для каждого из нуклеотидных оснований стоп-кодона предложен набор аминокислотных остатков, образующий "узнающую полость". Для первого основания стопкодона это аминокислотные остатки Met51 и Ser123, второго – Leu126, Asp128 и His132, третьего – Glu55, Val71, Tyr125 и Cys127. Inagaki et al.

(2002) считают, что "узнающие" стоп-кодон аминокислотные остатки, предложенные Bertram et al. (2000), идентифицированы верно, однако антикодон должен располагаться в противоположной ориентации при взаимодействии с eRF1. В результате чего, 1-ый нуклеотид стоп-кодона находится в "узнающей полости", образованной Glu55, Val71, Tyr125 и Cys127, а 3-ий – Met51 и Ser123.

В результате сравнения структур факторов с разной eRF1 специфичностью узнавания стоп-кодонов и биоинформатического анализа выделили восемь аминокислотных остатков, Liang et al. (2005) предположительно участвующих в узнавании стоп-кодонов. Из них пять являются абсолютно консервативными в семействе eRF1 (Gly31, Thr32, Ile62, Lys63 и Cys127), а остальные три (положения 57, 70 и 126) консервативны в группах eRF1 с одинаковой специфичностью узнавания (Ser57, Ser70 и Phe126 для UGA-специфичных eRF1; Gly57, Ala70 и Ile126 для UARспецифичных eRF1; Gly57, Ser70 и Leu126 для омнипотентных eRF1).

Мутационный анализ человека позволил выделить два eRF1 консервативных мотива в N-домене, имеющих критическое значение в процессе распознавания стоп-кодона: NIKS (положения 61-64) и YxCxxxF (положения 125-131) (Frolova et al., 2002; Kolosov et al., 2005; Seit-Nebi et al., 2002). Введение мутаций в эти мотивы приводило к значительным изменениям в специфичности узнавания стоп-кодонов. Инвариантный дипептид Ile-Lys в составе мотива NIKS, как предполагают, участвует в узнавании первого нуклеотида U стоп-кодона. Данное предположение основано на том, что Lys63 образует химические сшивки с 4-тиоуридином, находящимся в 1-ом положении стоп-кодона (Chavatte et al., 2002). За узнавание 2-го и 3-го нуклеотида, вероятно, ответственен мотив YxCxxxF (Kolosov et al., 2005; Seit-Nebi et al., 2002). Основную роль в узнавании А во 2-ом положении стоп-кодона играют Cys127 и Phe131, а Tyr125 осуществляет узнавание нуклеотида в 3-м положении. Предполагается, что Tyr125 важен для поддержания правильной конформации декодирующего сайта eRF1 и, возможно, образует водородную связь с Glu55 (Kolosov et al., 2005).

В пространственной структуре eRF1 мотивы NIKS и YxCxxxF расположены в разных петлях (рис. 1.4) и расстояние между ними составляет 15 (Song et al., 2000). На основании данных по химическим сшивкам, а также данных по моделированию предположено, что eRF1 может менять конформацию при узнавании стоп-кодона, в результате два мотива становятся сближенными, что способствует эффективному узнаванию стопкодона в мРНК (Chavatte et al., 2003).

Рис. 1.4. Трехмерная структура N-домена eRF1 человека. Указана локализация YxCxxxF и NIKS мотивов. E55 – остаток глутаминовой кислоты в 55 положении, Y125 – остаток тирозина в 125 положении (Kolosov et al., 2005) Из представленных гипотез видно, что данные о механизме узнавания стоп-кодонов и о роли в нем отдельных аминокислотных остатков eRF1 противоречивы, поэтому необходимы дальнейшие исследования в этой области. Тем не менее, очевидно, что наибольшее экспериментальное подтверждение получили гипотезы, рассматривающие узнающий сайт eRF1 как комплекс нескольких аминокислотных остатков в пространстве. Остается неизвестным, осуществляет ли eRF1 декодирование стоп-кодона напрямую, либо этот процесс опосредуется рРНК. Так как по своей пространственной структуре eRF1 схож с тРНК (Song et al., 2000), то вполне обосновано предположение о формировании тройного комплекса, состоящего из стоп кодона, рРНК малой субчастицы и фактора терминации первого класса.

Таким образом, возможно, основная специфичность распознавания стопкодона осуществляется за счет фактора, а сила взаимодействия и стереохимия, усиливающая его специфичность, находится под влиянием рРНК.

1.5. Гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре 1.5.1. Молекулярная анатомия пептидил-трансферазного центра Расположенный на большой субчастице рибосомы пептидил-трансферазный центр (ПТЦ) играет ключевую роль в процессе белкового синтеза (Polacek and Mankin, 2005). ПТЦ необходим как для формирования пептидной связи между остатками аминокислот в ходе синтеза полипептидной цепи (реакция транспептидации), так и для высвобождения синтезированной полипептидной цепи при терминации трансляции за счет гидролиза пептидил-тРНК. Он представляет собой сложный динамический комплекс с молекулярной массой приблизительно 1,8 МДа. ПТЦ расположен в районе «шеи» (в борозде под центральным выступом) большой субчастицы рибосомы и представляет собой плотно упакованный участок, состоящий из нуклеотидов центральной петли домена V 23S рРНК (Ban et al., 2000; Harms et al., 2001) (рис. 1.5). Это наиболее высококонсервативный участок во всей рибосоме. Рибосомальные белки находятся не ближе, чем на расстоянии 18 от него (Nissen et al., 2000a). Ближе всего к ПТЦ подходят длинные «хвосты»

рибосомальных белков L2, L3, L4 и L10e, которые тянутся от расположенных на поверхности 50S субчастицы глобулярных доменов в ядро рибосомы (Nissen et al., 2000a). Эти «хвосты», возможно, важны для поддержания структуры ПТЦ. Таким образом, в ПТЦ не обнаружено наличние каких-либо рибосомальных белков, которые могли бы принимать участие в катализе реакций транспептидации и гидролиза пептидил-тРНК. При исследовании кристаллической структуры 50S субчастиц рибосом H. marismortui, а также их комплексов с субстратными аналогами, в ПТЦ не удалось выявить наличие каких-либо каталитических ионов металлов (Steitz, 2005).

Единственным ионом металла, обнаруженным во внутренней полости ПТЦ, был ион калия, который, вероятно, участвует в координации нуклеотидов А2451, G2447 и G2061 (здесь и далее нумерация по 23S рРНК Е. coli) (Nissen et al., 2000a). По-видимому, функциональная роль ПТЦ обеспечивается исключительно рРНК.

Рис. 1.5. Кристаллическая структура большой субчастицы рибосомы H.

marismortui. Желтым цветом выделены 23S и 5S рРНК, зеленым - рибосомальные белки. ПТЦ выделен красным цветом. Справа показана вторичная структура центральной петли домена V 23S рРНК E. coli (Polacek and Mankin, 2005).

Позиционирование ССА-концов находящихся в А- и Р-сайте тРНК происходит за счет взаимодействия с 23S рРНК (Yusupov et al., 2001). В Рсайте С74 и С75 тРНК комплементарно взаимодействуют с G2252 и G2251 Pпетли 23S рРНК (Samaha et al., 1995). ССА-конец тРНК, расположенной в Асайте, закрепляется в ПТЦ за счет комплементарной пары С75 тРНК и G2553 23S рРНК (Kim and Green, 1999). На поверхность каталитического центра выступают абсолютно консервативные нуклеотиды 23S рРНК А2602, U2585, U2506, A2451 и С2063 (Nissen et al., 2000a).

1.5.2. Роль рРНК в реакции гидролиза пептидил-тРНК Как уже было отмечено, в ПТЦ происходят две ключевые реакции процесса трансляции: реакция транспептидации, в том случае, когда в Асайте находится аминоацил-тРНК, и реакция гидролиза пептидил-тРНК, которая запускается присутствием в А-сайте RF 1-го класса. Реакция транспептидации заключается в аминолизе сложноэфирной связи между синтезирующимся пептидом и 3’-гидроксилом 3’-концевого остатка рибозы тРНК, находящейся в Р-сайте. Аминолиз осуществляется посредством нуклеофильной атаки -аминогруппы находящейся в А-сайте аминоацилтРНК. На первом этапе происходит депротонирование -NH3+-группы, что приводит к образованию нуклеофильной группы NH2. Акцептором протона, наиболее вероятно, служит молекула воды. Затем следует нуклеофильная атака -аминогруппой аминоацил-тРНК карбонильной группы пептидилтРНК. Это вызывает формирование промежуточного тетраэдрического интермедиата. После этого происходит переход протона на атом кислорода, в результате чего комплекс распадается, и образуются продукты реакции – деацилированная тРНК в Р-сайте и элонгированная пептидил-тРНК в А-сайте (рис. 1.6А). Гидролиз пептидил-тРНК происходит, наиболее вероятно, посредством нуклеофильной атаки сложноэфирной связи молекулой воды (Tate and Brown, 1992) (рис. 1.6Б). Согласно (Amort et al., 2007) такая атака карбонильного атома углерода сложноэфирной связи пептидил-тРНК приводит к формированию тетраэдрического интермедиата. Затем происходит перенос протона на 2’(3’)-гидроксил 3’-концевого аденозина пептидил-тРНК и сложноэфирная связь между остатками пептидила и тРНК разрывается. В отличие от реакции транспептидации, где связь атакуется аминогруппой аминоацил-тРНК, которая является сильным нуклеофилом, реакция гидролиза пептидил-тРНК осуществляется слабым нуклеофилом – атомом кислорода молекулы воды. Спонтанный гидролиз пептидил-тРНК происходит очень медленно: в прокариотической рибосоме один раз в 14 часов (Zavialov et al., 2002). При наличии RF 1-го класса в А-сайте скорость Рис. 1.6. Общая схема реакции транспептидации (А) и реакции гидролиза пептидил-тРНК (Б) в пептидилтрансферазном центре.

реакции гидролиза значительно возрастает. Эксперименты in vitro показали, что в прокариотическом терминационном комплексе константа скорости реакции высвобождения полипептида составляет 0,5-1,5 в секунду (Zavialov et al., 2002). Очевидно, что в процессе терминации трансляции в ПТЦ какимто образом должна происходить координация и активация молекулы воды.

Что обеспечивает такую координацию и активацию, какова роль ПТЦ и RF 1го класса в механизме реакции гидролиза пептидил-тРНК, до сих пор достоверно неизвестно.

Во второй половине 1960ых и 1970е годы механизм формирования пептидной связи изучался в модельных системах, состоящих из рибосомы (или ее большой субчастицы), fMet-тРНК, ионов Mg2+ и K+/NH4+, пуромицина или ацетона/этанола/метанола (Caskey et al., 1971). Эти и другие эксперименты привели к появлению концепции о том, что реакция транспептидации в рибосоме осуществляется при непосредственном участии ПТЦ. Появление кристаллической структуры 50S субъединицы рибосомы позволило довольно подробно охарактеризовать структурные и функциональные особенности ПТЦ (Hansen et al., 2002a; Hansen et al., 2002b;

Nissen et al., 2000a; Polacek and Mankin, 2005; Schmeing et al., 2002). Было установлено, что ПТЦ играет роль в формировании пептидной связи не за счет кислотно-основного катализа реакции, а, скорее, посредством уменьшения энтропии транспептидазной реакции, координируя в пространстве все ее компоненты (Bieling et al., 2006; Rodnina et al., 2007;

Schmeing et al., 2005).

Так как реакция терминации трансляции также происходит в ПТЦ, наиболее распространена гипотеза о том, что непосредственным катализатором реакции гидролиза пептидил-тРНК служит 23S рРНК ПТЦ.

Главным аргументом в пользу этой гипотезы являются результаты экспериментов, которые показали наличие гидролиза fMet-тРНК как в прокариотических, так и в эукариотических рибосомах, в отсутствии RF 1-го класса и стоп-кодона мРНК в А-сайте, но в присутствии деацилированной тРНК и 30% ацетона (Caskey et al., 1971). Однако описанная модельная система далека от природной, во-первых, из-за присутствия 30% ацетона. Вовторых, концентрация ионов Mg2+ в ней была слишком высока. И, в-третьих, в описанной системе в А-сайте, который в норме занят либо аминоацилтРНК, либо пептидил-тРНК, находилась деацилированная тРНК, а в Р-сайте находился fMet-тРНК, в то время как при терминации его постоянно занимает пептидил-тРНК с длинной полипептидной цепью. Более того, так как в описанной модельной системе терминация трансляции проходила без участия стоп-кодонов мРНК, вряд ли можно приравнивать ее к физиологической. Следует отметить, что в отсутствие 30% ацетона или деацилированной тРНК в А-сайте рибосома сама по себе была неспособна осуществлять гидролиз сложноэфирной связи в fMet-тРНК (Caskey et al., 1971). В случае, если в А-сайте находится стоп-кодон, деацилированная тРНК не вызывает реакцию гидролиза (Zavialov et al., 2002).

Тем не менее, очевидно, что структура ПТЦ очень важна для терминационного процесса. Было предположено, что некоторые из высококонсервативных нуклеотидов ПТЦ (А2602, U2585, U2506, A2451 и С2063, нумерация соответствует 23S рРНК E. coli) вовлечены в реакцию терминации (Polacek et al., 2003; Youngman et al., 2004).

Замены нуклеотидов С2063, А2451, U2585 и U2506 оказывают лишь умеренное влияние на гидролиз пептидил-тРНК (Polacek et al., 2003;

Youngman et al., 2004). Наиболее сильное влияние на процесс терминации оказывали мутации нуклеотида А2602, которые приводили к потере способности терминационного комплекса гидролизовать пептидил-тРНК, не оказывая при этом значительных эффектов на пептидилтрансферазную реакцию (Brunelle et al., 2006; Polacek et al., 2003; Youngman et al., 2004).

Такой эффект мутации А2602 наблюдался как в присутствие RF 1-го класса в А-сайте, так и в описанной выше модельной системе без участия факторов терминации, но в присутствии деацилированной тРНК в А-сайте и 30% ацетона (Caskey et al., 1971; Polacek et al., 2003). Мутации U2585 в рибосомах E. coli также приводили к снижению скорости высвобождения пептида, однако в меньшей степени, чем мутации А2602 (приблизительно в 40 раз и в 350 раз, соответственно) (Youngman et al., 2004). На основе анализа данных мутационного исследования была выдвинута гипотеза о том, что RF 1-го класса индуцируют гидролиз пептидил-тРНК посредством реориентирования А2602 в ПТЦ, который в результате этого становится способен активировать молекулу воды (Polacek and Mankin, 2005). В позиционировании А2602 также принимает участие U2585 – второй наиболее подвижный нуклеотид в ПТЦ (Schmeing et al., 2002). Согласно этой модели RF 1-го класса играют регулирующую роль, а непосредственно катализ гидролиза пептидил-тРНК осуществляется самой рибосомой.

Позднее Trobro and Aqvist (2007) на основе данных молекулярного моделирования предложили другую гипотезу о роли нуклеотида А2602 в процессе терминации трансляции. В описанной ими модели А2602 выполняет функцию стабилизации структуры GGQ мотива RF1 за счет формирования водородных связей между адениновым остатком А2602 и атомами основной цепи остатков и абсолютно Gly229 Gln230 – консервативных остатков GGQ-мотива (Trobro and Aqvist, 2007).

Координация же молекулы воды осуществляется атомами боковой цепи Gln230.

Однако результаты недавних исследований, проведенных Amort et al.

(2007), опровергают обе этих гипотезы. Тщательное исследование рибосом, содержащих мутации в 23S рРНК, показало, что отсутствие азотистого основания или замена нуклеотида на его дезоксирибозный аналог в консервативных положениях А2602, U2585, U2506, A2451 и С2063 не препятствует гидролизу пептидил-тРНК (Amort et al., 2007). По-видимому, описанное ранее влияние замены нуклеотидов в положениях А2602 и U2585 на реакцию гидролиза пептидил-тРНК объясняется конформационными нарушениями в ПТЦ, так как при последующей замене мутированных нуклеотидов на их аналоги без азотистых оснований терминационная активность восстанавливается. Тем не менее, для сохранения как RFзависимого, так и RF-независимого (под действием деацилированной тРНК) гидролиза пептидил-тРНК абсолютно необходима целостность рибозного кольца в положении 2602 (Amort et al., 2007). Единственным атомом в остатке рибозы 2602, способным выполнять функцию координации и активации молекулы воды, является несущий неспаренный электрон атом О4’. Однако, это маловероятно, принимая во внимание слишком большое расстояние между ним и аминогруппой пептидил-тРНК. Amort et al. (2007) предположили, что А2602 играет роль «молекулярного переключателя», который регулирует специфичность ПТЦ либо к формированию пептидной связи, либо к реакции гидролиза пептидил-тРНК в зависимости от того, находится ли в А-сайте аминоацил-тРНК или RF 1-го класса. В ответ на связывание RF 1-го класса в А-сайте происходит смещение А2602, которое позволяет молекуле воды попасть в активный сайт.

Следует также отметить, что для RF-зависимого пептидил-тРНК гидролиза важны комплементарные взаимодействия между G2252 23S рРНК и С74 тРНК в Р-сайте, которые, однако, не влияют на реакцию транспептидации (Feinberg and Joseph, 2006). Возможно, образование комплементарной пары С74-G2252 обеспечивает правильную ориентацию пептидил-тРНК относительно фактора терминации 1-го класса.

Таким образом, вопрос какая функциональная группа ответственна за координацию молекулы воды и катализ гидролиза пептидил-тРНК остается открытым. Помимо ПТЦ, эту роль могут выполнять либо сами RF 1-го класса, либо 2’-гидроксил нуклеотида А76 пептидил-тРНК. Установлено, что А76 пептидил-тРНК играет важную роль в реакции транспептидации (Weinger et al., 2004). Результаты исследований позволили предложить модель механизма формирования пептидной связи в рибосоме, в которой 2’гидроксил А76 служит передатчиком протона, принимая протон аминогруппы и передавая его на атом О3’ пептидил-тРНК (Changalov et al., 2005). Возможно ли, что реакция гидролиза пептидил-тРНК протекает по сходному механизму, остается неизвестным.

1.5.2. Роль факторов терминации трансляции первого класса в реакции гидролиза пептидил-тРНК Полученные кристаллические структуры комплексов прокариотической рибосомы с RF1 и RF2 (Petry et al., 2005), а также результаты криоэлектронной микроскопии (Klaholz et al., 2003; Rawat et al., 2003) показали, что факторы терминации трансляции 1-го класса взаимодействуют как с декодирующим сайтом, так и с ПТЦ. С ПТЦ взаимодействует петля молекулы RF 1-го класса, содержащая универсальный мотив Gly-Gly-Gln (GGQ), которая сближена с нуклеотидами А2602, U2506, А2451 и C2063 23s рРНК (нумерация по E. coli) (Petry et al., 2005). Трипептидный мотив GGQ является абсолютно консервативным для всех RF 1-го класса, несмотря на их происхождение и специфичность к тому или иному стоп-кодону (рис. 1.7) (Frolova et al., 1999). Это единственный участок первичной структуры, общий для всех факторов терминации трансляции, как для RF1/RF2 прокариот и митохондрий, так и для eRF1 эукариот и aRF1 архебактерий, что свидетельствует о его уникальной роли в процессе терминации трансляции.

В eRF1 человека мотив GGQ находится в петле, входящей в состав Мдомена, который структурно имитирует акцепторный конец молекулы тРНК (Ito et al., 1996; Song et al., 2000). Было предположено, что мотив GGQ в функциональном отношении можно приравнять к универсальному мотиву 3’ССА тРНК (Frolova et al., 1999). Таким образом, вероятнее всего, именно минидомен GGQ является участком RF 1-го класса, принимающим участие в гидролизе пептидил-тРНК. Данные мутационного анализа подтверждают это предположение. Мутации любого из двух глицинов в мотиве GGQ вызывают потерю RF-активности in vitro в эукариотах (Frolova et al., 1999; Seit-Nebi et al., 2001) и прокариотах (Mora et al., 2003a; Shaw and Green, 2007; Zavialov et al., 2002), появление летального фенотипа дрожжей in vivo (Song et al., 2000).

Так, например, мутанты GAQ RF1 и RF2 были на 4-5 порядков менее эффективны в терминационной реакции, чем белки дикого типа, в то время как их способность связываться с рибосомой не изменялась (Zavialov et al., 2002). Замены любого из двух глицинов мотива GGQ в eRF1 человека приводили к полной потере способности фактора вызвать гидролиз пептидил-тРНК, и также, как и в случае с прокариотами, не влияли на способность фактора связываться с рибосомой (Frolova et al., 1999). У дрожжей in vivo летальными были замены любого из аминокислотных остатков GGQ (Song et al., 2000).

До сих пор не выяснено какая роль в реакции гидролиза пептидилтРНК принадлежит каждому из аминокислотных остатков трипептида GGQ.

Предполагают, что наличие двух глицинов подряд обеспечивает поддержание специфической структуры петли, что в свою очередь важно для правильного позиционирования фактора в ПТЦ (Shaw and Green, 2007;

Trobro and Aqvist, 2007). Конформация глутамина, согласно полученной

–  –  –

Б RF2 Salmonella typhimurium (238) DLRIDVYRASGAGGQHVNRTESAVRITHI RF2 Escherichia coli (238) DLRIDVYRTSGAGGQHVNRTESAVRITHI RF2 Haemophilus influenzae (238) DLRIDVYRASGAGGQHVNKTESAVRITHM RF2 Bacillus subtilis (237) DIKVDTYRASGAGGQHVNTTDSAVRITHL RF1 Haemophilus influenzae (222) DLRIDTYRSSGAGGQHVNTTDSAVRITHI RF1 Mycoplasma pneumoniae (222) DLRVDTYRASGAGGQHVNRTESAVRITHL RF Mycoplasma capricolum (223) DLRIDTYRASGAGGQHVNTTDSAVRITHL RF1 Pseudomonas aeruginosa (223) DLRVDTYRSSGAGGQHVNKTDSAVRITHI RF2 Staphylococcus aureus (238) DITVDTFRASGAGGQHINKTESAIRITHH RF2 Rhodopirellula baltica (196) DVREDTYRASGAGGQHVNKTDSAIRLTHI RF2 Yersinia pestis (239) DLRIDVYRASGAGGQHVNKTESAVRITHI RF2 Yersinia enterocolitica (238) DLRIDVYRASGAGGQHVNKTESAVRITHI RF2 Ehrlichia ruminantium (122) DLRIDTYRASGAGGQHVNKTESAVRITHI RF1 Rhodopirellula baltica (223) DYRKDFFGASGPGGQHVNKTDSAVRLTHH RF1 Staphylococcus aureus (219) DLKIDTYRSSGAGGQHVNTTDSAVRITHL RF1 Yersinia pestis (221) DLRIDTFRSSGAGGQHVNTTDSAIRITHI RF2 Lactobacillus delbrueckii (237) DLRIDVYRSSGAGGQHINKTSSAVRITHI RF1 Salmonella enterica (221) DLRIDTFRSSGAGGQHVNTTDSAIRITHL RF2 Rodococcus sp. (235) DVRVDVYRSSGPGGQSVNTTDSAVRLTHI RF1 Ehrlichia ruminantium (221) DLRIDVYRSSGPGGQSVNTTDSAVRITHI RF1 Bacillus subtilis (219) DIRVDTFASSGPGGQSVNTTMSAVRLTHL RF1 Mycoplasma pulmonis (224) DLKIDTFRSSGAGGQSVNTTDSAVRITHI RF2 Corynebacterium diphtheriae (235) EVRVDVYRSSGPGGQSVNTTDSAVRLTHI RF1 Tropheryma whipplei (217) EIRIDVFRSSGPGGQSVNTTDSAVRITHL RF1 Mycobacterium leprae (226) DLRIDVYRSSGKGGQGVNTTDSAVRITHL RF1 Rodococcus sp.

(224) DLRIDVYRSSGKGGQGVNTTDSAVRITHL RF1 Corynebacterium diphtheriae (221) DLRVDVYRSSGKGGQGVNTTDSAVRITHL RF1 Clostridium perfringens (220) DIKIDVFRASGNGGQCVNTTDSAVRITHL RF1 Clostridium botulinum (219) DLRIDVYRASGHGGQCVNTTDSAVRITHL RF1 Streptococcus mutans (222) DLRVDIYHASGAGGQNVNKVATAVRIIHL RF2 Streptococcus mutans (196) DIKMDTFRSGGAGGQNVNKVSTGVRLTHI Рис. Множественное выравнивание аминокислотных 1.7.

последовательностей минидомена GGQ эукариотических (А) и прокариотических (Б) факторов терминации трансляции. Белым на черном фоне выделены абсолютно консервативные аминокислотные остатки, черным на сером фоне выделены полукончервативные аминокислотные остатки.

кристаллической структуре eRF1 человека, стабилизируется формированием ряда водородных связей с другими консервативными аминокислотными остатками минидомена GGQ (Song et al., 2000). Атомы боковой цепи Gln185 (нумерация соответствует eRF1 человека) образуют водородные связи с гуанидиновой группой Arg189, атомы основной цепи которого, в свою очередь, формируют водородную связь с гидроксильной группой Ser186.

Song et al. (2000) предположили, что глутамин мотива GGQ выполняет функцию координации молекулы воды в ПТЦ для гидролиза пептидил-тРНК.

Это предположение, однако, не подтвердилось в последующих опытах in vitro с использованием мутантных форм eRF1 человека. В экспериментах, проведенных Seit-Nebi et al. (2001), замена Gln185 на глицин или аргинин приводила к снижению RF-активности лишь на 50%. Авторы предположили, что роль Gln185 заключается в поддержании пространственной структуры минидомена. Позже было обнаружено, что большинство замен глутамина мотива GGQ прокариотических факторов RF1 и RF2 также не приводят к полной потере RF-активности фактора in vitro (Mora et al., 2003a; Shaw and Green, 2007). Однако, следует отметить, что in vivo RF1 и RF2, содержащие замены глутамина в GGQ-мотиве, оказались неспособны компенсировать соответствующие термочувствительные мутанты (Mora et al., 2003a). Таким образом, в исследованиях in vivo любые замены глутамина в мотиве GGQ как прокариотических (Mora et al., 2003a), так и эукариотических RF 1-го класса (Song et al., 2000) оказываются летальными. В чем причина расхождения результатов in vivo и in vitro пока остается невыясненным.

Было обнаружено, что остаток глутамина в составе мотива GGQ метилирован в положении N5 в факторах RF1 и RF2 E. сoli (Dincbas-Renqvist et al., 2000), в eRF1 S. cerevisae (Heurgue-Hamard et al., 2005) и в факторе Mrf1p дрожжевых митохондрий (Polevoda et al., 2006), и это метилирование важно для поддержания RF-активности. Метилтрансфераза, ответственная за метилирование RF 1-го класса у E. coli, кодируется геном hemK, расположенным по ходу транскрипции гена prfA, кодирующего фактор RF1 (Heurgue-Hamard et al., 2002; Nakahigashi et al., 2002). В цитоплазме S.

сerevisae метилирование глутамина мотива GGQ eRF1 осуществляет белок YDR140w (Heurgue-Hamard et al., 2005). Интересно, что HemK и YDR140w практически не имеют сходства в первичной структуре. Кроме того, выявлено, что для метилирования eRF1 S. cerevisae необходимо присутствие eRF3 (Heurgue-Hamard et al., 2005). Возможно, связывание с eRF3 вызывает такие конформационные перестройки в eRF1, в результате которых глутамин мотива GGQ становится доступным для действия метилтрансферазы.

Известно, что метилглутамин в клетках встречается очень редко. К настоящему моменту, помимо RF 1-го класса, описан только один случай такой модификации. Это метилирование Gln150 в рибосомальном белке L3 E. coli (Lhoest and Colson, 1977), которое, как предполагают, важно для правильной сборки рибосомы. Какую функциональную роль играет метилирование глутамина мотива GGQ до сих пор не выяснено.

В недавнем исследовании, проведенном Shaw and Green (2007), изучалась селективность реакции гидролиза пептидил-тРНК к молекуле воды как нуклеофилу. В качестве конкурентного нуклеофила авторами использовался гидроксиламин. Было установлено, что реакция гидролиза связавшейся с рибосомой пептидил-тРНК может идти с участием других нуклеофилов, однако, в случае, если в А-сайте находиться RF1, реакция становиться селективной к молекуле воды. По-видимому, в результате взаимодействия RF 1-го класса с рибосомой другие нуклеофилы, помимо воды, не могут участвовать в реакции гидролиза. Возможно, это происходит по причине стерического конфликта с нуклеофилами превышающими воду по размерам, либо в результате специфических взаимодействий с молекулой воды. Интересно, что некоторые замены глутамина мотива GGQ вызывали явное снижение селективности к воде. Мутанты GGG, GGA и GGS, хотя и оказывали лишь умеренное влияние на уровень гидролиза пептидил-тРНК in vitro, приводили к существенному повышению уровня аминолиза под действием гидроксиламина. В то же время, такие мутанты как GGW, GGK и GGL, сохраняющие RF-активность, не вызывали снижения селективности реакции. Авторы считают, что это объясняется наличием у триптофана, лизина и лейцина длинных боковых цепей, сходных по размеру с боковой цепью метилированного глутамина, которые формируют своего рода «карман» для молекулы воды. На основании полученных результатов авторы высказали предположение о том, что функциональная роль RF 1-го класса в гидролизе пептидил-тРНК складывается из двух компонентов. Во-первых, он индуцирует конформационные перестройки в ПТЦ для оптимального позиционирования сложноэфирной связи пептидил-тРНК. Во-вторых, он контролирует специфичность реакции, не допуская участия в ней какоголибо другого нуклеофила, помимо воды.

Суммируя все вышесказанное, необходимо отметить, что к настоящему моменту не предложено достоверной модели катализа реакции гидролиза пептидил-тРНК в рибосоме. До сих пор не достигнута определенность в вопросе о том, кто является непосредственным катализатором реакции и какова роль каждого аминокислотного остатка минидомена GGQ RF 1-го класса в этом процессе. Очевидно, что механизм реакции RF-зависимого гидролиза пептидил-тРНК требует дальнейшего изучения.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

–  –  –

2.1.2. Среды Для выращивания бактерий E. coli использовали полноценную среду LB, содержащую (г/л): дрожжевой экстракт – 5, бакто-триптон – 10, NaCl – 10.

Для получения агаризованных сред добавляли агар до концентрации 1.5%.

Концентрация антибиотиков в среде составляла (мкг/мл): ампициллина (Ap)

– 100 и канамицина (Km) – 40.

Для получения белков, меченных стабильными изотопами Nи С, бактерии E. coli выращивали на минимальной среде М9. Для приготовления 1 л минимальной среды М9 в воде растворяли 6 г Na2HPO4, 3 г KH2PO4, 0.5 г NaCl и 1 г NH4Cl, доводили pH до 7.4 и автоклавировали. После этого в среду добавляли MgSO4 до конечной концентрации 1мМ, CaCl2 до конечной концентрации 0,1 мМ, тиамин до конечной концентрации 1 мМ и C6H12O6 до конечной концентрации 0,4%. Концентрация антибиотиков в среде составляла (мкг/мл): ампициллина (Ap) – 100 и канамицина (Km) – 40.

2.1.3. Реактивы В работе использовали реактивы следующих фирм: триптон, дрожжевой экстракт, агар – "Difco"(США); агароза, Triton X-100, – "Sigma" (США);

акриламид и метиленбисакриламид, бромистый этидий, IPTG, ЭДТА, SDS, ДТТ дезоксинуклеозидтрифосфаты, наборы

– "Serva" (Германия);

полинуклеотидов – стандартов молекулярных весов для электрофореза ДНК, гликоген – "Fermentas" (Литва); трис, ацетаты калия, аммония и натрия, имидазол – "Merck" (Германия); персульфат аммония и ТЕМЕD "Bio-Rad" (США); глицерин – "ICN" (США), -меркаптоэтанол – фирмы "FERAK" (Германия); набор белков-стандартов молекулярных весов для белкового электрофореза "New England Biolabs" (США); смола для металл-аффинной хроматографии – "Ni-NTA Superflow" фирмы "Qiagen" (Германия). 15NH4Cl и Все остальные C6H12O6 – "Cambridge Isotope Laboratory" (США).

использованные в работе реактивы были отечественного производства квалификации о.с.ч.

40S и 60S субъеденицы рибосом из ретикулоцитов кролика были любезно предоставлены Еленой Алкалаевой (Институт Молекулярной Биологии им. Энгельгардта РАН, Москва).

2.1.4. Ферменты В работе использовали следующие ферменты: эндонуклеазы рестрикции

–Bst98I, NdeI, XhoI фирм "Fermentas", "Promega" и "New England Biolabs";

ДНК-полимеразы: Taq – "Fermentas", HiFi – "Sileks, Pfu Turbo - "Stratagene" (США). ДНК-лигаза фага T4 и РНКаза А фирмы "Fermentas".

–  –  –

2.2. Методы исследований 2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из E.coli Плазмидную ДНК выделяли по методу Бирнбойма (Birnboim, 1983) с модификациями. Бактериальные клетки из 3 мл культуры E. coli, выращенной до ранней стационарной фазы роста в среде с соответствующим антибиотиком, собирали центрифугированием. Осадок суспендировали в 200 мкл раствора, содержащего 25 мМ трис-HCl, рН 8.0, 10 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл РНКазы А. К суспензии добавляли равный объем раствора, содержащего 0.2 М осторожно перемешивали и NaOH, 1% SDS, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем к смеси добавляли 300 мкл 3 М ацетата калия, рН 5.2, осторожно перемешивали и выдерживали во льду в течение 5 мин. Осветленный лизат, полученный после центрифугирования смеси, переносили в другие пробирки и депротеинизировали фенолом, насыщенным трис-HCl, рН 8.0, и смесью фенол:хлороформ ДНК осаждали добавлением объема (1:1). 0.7 изопропилового спирта. После отмывки 70% и 96% этанолом препарат ДНК растворяли в 50 мкл воды.

2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле Анализ рестрикционных фрагментов ДНК и плазмид проводили в 0.7-1% агарозных гелях в горизонтальных (8-12 см2) блоках при напряженности электрического поля не более 5 В/см. В качестве электрофоретического буфера использовали трис-ацетатный буфер (0.04 М трис-ацетат, 0.002 М ЭДТА, pH 8.0). После электрофоретического разделения ДНК гель окрашивали бромистым этидием и визуализировали в проходящем УФ-свете.

2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили стандартными методами, описанным в руководстве Сэмбрука с соавт.

(Sambrook et al., 1989), при оптимальной для каждого фермента температуре инкубации и составе буфера, рекомендованных фирмой-изготовителем.

Лигирование фрагментов ДНК с векторными плазмидами, линеаризованными соответствующими эндонуклеазами рестрикции, проводили при 16оС в течение 14 часов в буфере для ДНК-лигазы фага Т4 (50 мМ трис-HCl, pH 7.8; 10 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ; 1 мМ АТФ; 25 мг/мл БСА).

По окончании реакции лигазу инактивировали инкубацией смеси в течение 20 мин при 65оС.

2.2.4. Трансформация E. coli плазмидной ДНК Трансформацию бактерий E. coli проводили по методу Манделя и Хига (Mandel and Higa, 1970) c модификациями. Для получения компетентных клеток в пробирку с 5 мл среды LB вносили 100 мкл ночной культуры.

Клетки выращивали при 37оС с аэрацией до достижения оптической плотности ОD600=0.6. Культуру охлаждали во льду в течение 5 мин. После 4оС.

чего бактерии осаждали центрифугированием при Клетки суспендировали в 1 мл охлажденного во льду стерильного раствора, содержащего 50 мM CaCl2, 10 мM трис-HCl, pH 8.0. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 30 мин, осаждали центрифугированием при 4оС и суспендировали в 200 мкл охлажденного во льду стерильного раствора 50 мM CaCl2, 10 мM трис-HCl, pH 8.0. К полученным компетентным клеткам добавляли ДНК в лигазном буфере или в воде. Смесь инкубировали в ледяной бане в течение 30 мин и затем подвергали тепловому шоку при 42оС (2 мин.). К клеткам добавляли 800 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37оС. Трансформирующую смесь высевали на соответствующие селективные среды и выращивали при 37оС.

2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР проводили на приборе MyCycler фирмы "Bio-Rad" (США) в 50 мкл смеси, содержащей однократный буфер для соответствующей ДНКполимеразы, рекомендованный фирмой-поставщиком, 240 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 0.4 мкМ 5'- и 3'-концевых праймеров, 10нг матричной ДНК, ед. акт. ДНК-полимеразы. После 100 2.5 предварительной денатурации при 95оС в течение 3 мин следовали 25 циклов: денатурация – 95оС, 30 сек.; отжиг – 30 сек. при температуре, соответствующей среднему значению плавления), Tm (температура рассчитанной для каждого из пары используемых в данной реакции 5'- и 3'концевых праймеров с помощью компьютерной программы "Omiga 2.0" (Oxford Molecular Ltd.); синтез – 72оС, от 30 сек. до 2 мин. в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента ДНК.

2.2.6. Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраймера" Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраймера" (Sarkar and Sommer, 1990) проводили в две стадии. На первой стадии проводили ПЦР с помощью праймера, комлементарного 5'-концу гена, и 3'-концевого "мутагенного" праймера, несущего требуемую замену нуклеотидов. При этом уникальный сайт для рестриктазы имел только один праймер – комплементраный гена. ПЦР-фрагмент ДНК очищали и 5'-концу использовали в следующей стадии в качестве "мегапраймера". На второй стадии проводили ПЦР с использованием праймера, комплементраного 3’концу гена и имеющего уникальный сайт для рестриктазы, и полученного в качестве комплементраного гена. После "мегапраймера" 5'-концу проведения ПЦР полученный фрагмент ДНК очищали, последовательно обрабатывали соответствующими рестриктазами и лигировали с заранее подготовленным вектором, обработанным теми же рестриктазами. После трансформации клеток E. coli лигированной смесью отбирали отдельные клоны, выделяли плазмидную ДНК и подтверждали присутствие требуемой замены секвенированием.

2.2.7. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе После электрофореза агарозный гель (0.8-1,5 %) окрашивали раствором бромистого этидия для визуализации фрагментов ДНК. Нужную полосу вырезали из геля скальпелем под УФ-светом ( = 320 нм) и помещали в пробирку. Выделение фрагментов ДНК из геля проводили с помощью набора фирмы «GE Healthcare» (Великобритания) согласно прилагаемой методике.

2.2.8. Сверхэкспрессия в E. coli и выделение мутантных форм eRF1 человека Для экспрессии генов факторов терминации трансляции эукариот использовали конструкцию на основе вектора pEТ23b(+) и штамм E. сoli BL21(DE3)pUBS520. Для препаративного выделения белков к 100-200 мл культуры E. coli, выращенной до ОD600=0.5 при 37оС с аэрацией на среде LB, содержащей соответствующие антибиотики, добавляли IPTG до конечной концетрации 0.1-1мМ, и растили культуру еще 4 – 16 часов с аэрацией при температуре от 18 до 25оС. Клетки собирали центрифугированием при 4500 g, осадок ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 100 мМ KCl, 1% Triton X-100, 10% глицерин, 1 мг лизоцима, 0.1 мМ PMSF. Лизат выдерживали во льду 30 мин, после чего клетки разрушали ультразвуком на приборе Sonifier 250 фирмы "Branson" в течение 2 мин при 50% мощности импульсов. Лизат центрифугировали при 8000g 30 мин при 4°С. К супернатанту добавляли 300 мкл 50% суспензии смолы Ni-NTA Superflow, уравновешенной буфером "W" (50 мМ трис-HCl, рН 7.5, 100 мМ KCl, 10% глицерин, 5 мМ -меркаптоэтанол, 10 мМ имидазол). Раствор со смолой перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и переносили в колонку со стеклянным фильтром. Смолу с адсорбированным белком промывали 3 раза 10 мл буфера "W". Элюцию белка проводили 3 раза по 0.5 мл буфера "W", содержащим 100 мМ имидазола. Присутствие белка во фракциях определяли на спектрофотометре по поглощению при 280 нм.

Фракции, содержащие белок, диализовали против буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7.5, 100 мМ KCl, 5 мМ -меркаптоэтанола и 5% глицерин, 12 час при 4оС. Белок дочищали с помощью ионообменной хроматографии, используя систему Великобритания).

AKTA («GE Healthcare», Диализованные фракции наносили на колонку HiTrap HP SP объемом 1 мл («GE Healthcare», Великобритания). Введение раствора белка в колонку проводили в буфере «А» (50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 5 мМ -меркаптоэтанол, 100 мМ KCl, 5% глицерин) при скорости потока 1 мл/мин. Перед введением колонку уравновешивали буфером «А». Белок элюировали линейным градиентом KCl от 100 мМ до 1 M в буфере «А» объемом 20 мл и собирали фракции по 1 мл. Скорость потока при элюции составляла 1 мл/мин.

Пиковые фракции диализовали против буфера, содержащего 50 мМ трисHCl, рН 7.5, 100 мМ KCl, и 0,1 мМ ЭДТА, 12 час при +40С. Чистоту белка определяли электрофорезом в денатурирующем 12% ПААГ с 0.1% SDS.

Диализованный белок хранили замороженым при –70°С. Концентрацию белка определяли по поглощению в УФ.

2.2.9. Сверхэкспрессия в E. coli и выделение изолированного М-домена eRF1 человека и его мутантной формы G183A, меченных стабильными изотопами 15N и 13С Для экспрессии генов М-домена и его мутантной формы G183A фактора терминации трансляции eRF1 использовали конструкцию на основе вектора pEТ23b(+) и штамм E.

сoli BL21(DE3)pUBS520. Для получения белков, меченных стабильными изотопами 15N и/или 13С, клетки E. coli выращивали на минимальной среде М9, в которой в качестве единственного источника азота был использован NH4Cl и/или в качестве единственного источника углерода была использована глюкоза C6H12O6. Для препаративного получения белка 1 мл культуры E. coli выращенной на среде LB до ОD600=1 переносили в 50 мл среды М9 и растили 12 часов при 37°С с аэрацией.

Клетки собирали центрифугированием при 1500 g, переносили в 1 л среды М9 и растили еще 4-6 часов при 37°С с аэрацией до ОD600=1. Затем добавляли IPTG до конечной концетрации 1мМ, и растили культуру еще 16 30оС.

часов с аэрацией при температуре Клетки собирали центрифугированием при 4500 g, осадок ресуспендировали в 50 мл раствора, содержащего 25 мМ калий-фосфатного буфера, pH 6,9, 100 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1 мг лизоцима, 0.1 мМ PMSF. Лизат выдерживали во льду 30 мин, после чего клетки разрушали ультразвуком на приборе Sonifier 250 фирмы "Branson" в течение 2 мин при 50% мощности импульсов. Лизат центрифугировали при 8000g 30 мин при 4°С. К супернатанту добавляли 600 мкл 50% суспензии смолы Ni-NTA Superflow, уравновешенной буфером "W" (25 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6.9, 100 мМ NaCl, 5 мМ меркаптоэтанол, 10 мМ имидазол). Раствор со смолой перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин и переносили в колонку со стеклянным фильтром. Смолу с адсорбированным белком промывали 3 раза 10 мл буфера "W". Элюцию белка проводили 3 раза по 0.5 мл буфера "W", содержащим 100 мМ имидазола. Присутствие белка во фракциях определяли на спектрофотометре по поглощению при 280 нм. Фракции, содержащие белок, диализовали против буфера, содержащего 20 мМ калий-фосфатного буфера, pH 6,9, 50 мМ NaCl, 5 мМ -меркаптоэтанола, 12 час при 4оС. Белок дочищали с помощью ионообменной хроматографии, используя систему Великобритания). Диализованные фракции AKTA («GE Healthcare», наносили на колонку HiTrap HP SP объемом 1 мл («GE Healthcare», Великобритания). Введение раствора белка в колонку проводили в буфере «А» (20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6.9, 5 мМ -меркаптоэтанол, 50 мМ при скорости потока мл/мин. Перед введением колонку NaCl) 1 уравновешивали буфером «А». Белок элюировали линейным градиентом NaCl от 50 мМ до 1 M в буфере «А» объемом 20 мл и собирали фракции по 1 мл. Скорость потока при элюции составляла 1 мл/мин. Пиковые фракции диализовали против буфера, содержащего 20 мМ калий-фосфатный буфера, рН 6.9, 1 мМ -меркаптоэтанол, 100 мМ NaCl, 12 час при +40С. Чистоту белка определяли электрофорезом в денатурирующем 12% ПААГ с 0.1% SDS. Диализованный белок хранили замороженым при –70°С. Концентрацию белка определяли по поглощению в УФ.

2.2.10. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ Чистоту выделенных белков анализировали в 12% ПААГ, содержащим 0.1% SDS. В качестве электрофоретического буфера использовали трисглициновый буфер с SDS (25 мМ трис, 250 мМ глицин и 0.1% SDS, pH 8.3).

Образцы наносили на гель в буфере, содержащим 50 мМ трис-HCl, pH 6.8, 100 мМ -меркаптоэтанола, 1% SDS, 0.01% бромфеноловый синий и 20% глицерина, предварительно выдержав на водяной бане 5 мин при 100°С.

После электрофоретического разделения белков гель окрашивали раствором 0.25% Кумаси синего R250 и визуализировали в белом свете.

2.2.11. Измерение спектров ЯМР и их анализ Спектры ЯМР были измерены В.И. Польшаковым (Центр магнитной томографии и спектроскопии МГУ, Москва) и Б. Бирдсалл (Национальный институт медицинских исследований, Лондон) на спектрометрах Varian INOVA 600 МГц и 800 МГц и Bruker Avance 600 МГц, оборудованных криодатчиками тройного резонанса для регистрации резонанса ядер 1H и возбуждения ядер Nи C. Измерения проводились на образцах М-домена eRF1 человека и его мутантной формы G183A объемом 300-600 мкл и концентрацией белка в растворе 0.5-0.8 мМ. Для измерения спектров ЯМР использовали раствор, содержащий 20 мМ калий-фосфатного буфера при pH

7.0 и 50 мМ NaCl. Были измерены следующие двумерные (2D) и трехмерные (3D) спектры ЯМР при температурах 5С и 25С: 2D DQF-COSY, NOESY, TOCSY, [15N,1H] HSQC, [13C,1H] HSQC, 3D [15N,1H] HSQC-NOESY, [13C,1H] NOESY-HSQC, [13C,1H] HSQC-NOESY, HCCH-TOCSY, HNHA, HNHB, и HNCA, HNCO, HN(CO)CA, CBCANH, CBCA(CO)NH, HBHANH, HBHA(CO)NH. Преобразование спектров ЯМР осуществляли с помощью программного пакета nmrPipe (Delaglio et al., 1995). Для визуализации и анализа спектров ЯМР использовали программы nmrDraw (Delaglio et al., и Сан Франциско, США;

1995) Sparky (Goddard & Kneller, Для последовательного отнесения http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky).

сигналов основной цепи были использованы следующие спектры: HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNHAHB и HBHA(CO)NH (Bax and Grzesiek, 1993). Отнесения для алифатических боковых цепей были получены из спектров 3D HCCH-TOCSY, HNHB, [15N,1H] NOESY-HSQC и [13C,1H] NOESY-HSQC. Ограничения на межъядерные расстояния были N,1H и 13 С,1H-NOESY, записанных при получены из анализа 3D спектров 25С и 5С. Для определения ориентационных ограничений были измерены остаточные константы диполь-дипольного взаимодействия (ОКДДВ) 1DNH между ядрами 15N и 1H амидных групп белка в разбавленных (5%) растворах жидких кристаллов, образованных смесями додецилового эфира пентаэтиленгликоля с гексанолом и/или октилового эфира (C12E5) пентаэтиленгликоля (C8E5) с октанолом ((Ruckert and Otting, 2000). В указанных анизотропных средах остаточные квадрупольные расщепления ядер дейтерия составляли 28 и 27 Гц при 25 и 10оС соответственно.

Величины 1DNH были определены из 2D спектров IPAP-HSQC (Ottiger et al.,

1998) путем вычитания величин расщепления сигналов 15N-1H, измеренных в анизотропных и изотропных средах.

2.2.12. Расчет структуры Анализ спектров был выполнен с использованием программ и AUTOASSIGN (Zimmerman et al., 1997) Sparky (http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky) на графических станциях SGI Octane2 и Octane в Центре магнитной томографии и спектроскопии МГУ (Москва).

После интегрирования кросс-пиков ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) соответствующие протон-протонные межъядерные расстояния были сгруппированы в 4 подгруппы с верхними пределами 2.5, 3.5, 4.5 and

5.5. Допустимые пределы диэдральных углов и были получены из C’, 1H 1HN и 15 анализа величин химических сдвигов Nс C, C, использованием программы TALOS (Cornilescu et al., 1999).

Стереоспецифическое отнесение сигналов H и pro-R/pro-S метильных групп аминокислотных остатков Val и Leu вместе с ограничениями на диэдральные углы 1 были получены с помощью программы AngleSearch (Polshakov et al., 1995).

Для расчета начальной структуры белка однозначно определенные ЯЭО были использованы в качестве исходной группы экспериментальных ограничений в итерационной процедуре (Nilges et al., 1997) с использованием программного пакета ARIA-CNS (Linge et al., 2003). Расчет структуры выполнялся с помощью метода молекулярной динамики с наложенными экспериментальными ограничениями. После получения семейства начальных структур было проведено их уточнение, для чего были добавлены дистанционные ограничения, соответствующие внутримолекулярным водородным связям и ориентационные ограничения, полученные из величин остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия 1DNH. Амидные протоны белка, участвующие в образовании водородных связей, были идентифицированы в спектрах NOESY после растворения белка в D2O.

Акцепторы соответствующих водородных связей были определены из числа близко расположенных карбонильных групп в семействе начальных структур. Были использованы по два дистанционных ограничения для каждой водородной связи: rNH···O 2.4 и 2.4 rN···O 3.4. На заключительной стадии определения структуры белка все экспериментально измеренные ограничения на расстояния, диэдральные углы и 1DNH были использованы в протоколе медленного отжига (simulated annealing protocol) расчета по методу молекулярной динамики с использованием программы XPLOR-NIH (Schwieters et al., 2003). 20 пс траектории молекулярной динамики при 1500К с последующей стадией охлаждения от 1500 до 10К той же длительности (1000 шагов по 0.2 пс) были использованы в протоколе расчета. Лучшие 25 из 50 рассчитанных структур были выбраны с использованием в качестве основного критерия минимума энергии экспериментальных ограничений.

Анализ качества рассчитанных структур выполнен с помощью программ AQUA, PROCHEK-NMR (Laskowski et al., 1996), MolMol (Koradi et al., 1996) и InsightII (Accelrys Software Inc).

2.2.13. Анализ динамических свойств

Измерения скоростей продольной (спин-решеточной) релаксации R1 были выполнены в псевдо-3D эксперименте ЯМР с релаксационными задержками 8.6 мс, 24.7 мс, 48.6 мс, 96.9 мс, 193.2 мс, 345.7 мс, 498.2 мс,

594.5 мс, 795.2 мс, 1196.4 мс и 1597.7 мс. Измерения поперечной (спинспиновой) релаксации R2 были проведены в аналогичном эксперименте с релаксационными задержками 8.

5 мс, 17.1 мс, 25.6 мс, 34.1 мс, 42.6 мс, 51.2 мс, 59.7 мс, 68.2 мс, 76.7 мс, 93.8 мс и 119.4 мс. Насыщение ядер 1H в течение 4с было использовано при измерении гетероядерных эффектов Оверхаузера N{1H}. Значения R1 и R2 вместе с их стандартными отклонениями были получены из анализа изменения интегральных интенсивностей сигналов методом нелинейной регрессии. Значения ЯЭО 15N{1H} рассчитаны с учетом уровня фонового шума и проверены с использованием двух измерений экспериментальных данных. Экспериментальные величины релаксационных N{1H}) параметров и ЯЭО были проанализированы с (R2, R1 использованием безмодельного формализма Липари и Сзабо движения молекул (Lipari and Szabo, 1982) с расширением, включающим более медленные внутренние движения (Clore et al., 1990b) и учетом вклада Rex в скорость поперечной релаксации за счет конформационного обмена (Clore et al., 1990a). Все расчеты были выполнены с использованием программы RelaxFit (Polshakov et al., 1999) и TENSOR-2 (Dosset et al., 2000). Величина и параметры аксиально симметричного тензора вращательной диффузии были рассчитаны методом Монте-Карло.

2.2.14. ЯМР-титрование субчастицами рибосом Для титрования 40S и 60S субъединицами рибосом использовали образцы М-домена eRF1, меченного стабильными изотопами 15N, в диапазоне концентраций от 30 до 200 мкM и объемом 600 мкл. Титрование проводили при молярных соотношениях 60S субчастицы рибосом с М-доменом eRF1 1:15000, 1:9000, 1:8000, 1:7500, 1:5000, 1:4500, 1:4250, 1:4000, 1:3500, 1:2500 и 1:2000. Титрование проводили как добавляя 60S субчастицы рибосом к образцу М-домена, так и наоборот: добавляя М-домен к 60S. В качестве контроля на специфичность взаимодействия проводили титрование Мдомена 40S субъединицами рибосомы, которые добавляли в молярных соотношениях 40S/М-домен 1:3500, 1:1750. Влияние ионной силы раствора на взаимодействие М-домена с 60S субъединицами оценивали с помощью постепенного увеличения концентрации NaCl в конечной смеси от 50 мМ до 75 мМ. Все спектральные измерения проводили при температурах 25C и 5C. Для мониторинга изменения ширины резонансных линий использовали N-1H HSQC (Bodenhausen and Ruben, 1980). Преобразование спектры спектров ЯМР осуществляли с помощью программного пакета nmrPipe (Delaglio et al., 1995). Для определения интегральной интенсивности сигналов определяли параметры гауссовой формы линии разрешенных сигналов в спектрах HSQC методом нелинейной регрессии с использованием стандартных алгоритмов программы Sparky (Goddard & Kneller, СанФранциско, США; http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky). Для визуализации полученных результатов использовали программы молекулярной графики InsightII (Accelrys, США) и VMD (Humphrey et al., 1996). Для расчета молекулярной поверхности белка, доступной для растворителя, использовали программу InsightII и алгоритм Конноли (Connolly, 1983).

2.2.15. Определение активности eRF1 Определение активности мутантных форм eRF1 проводилось Е.З.

Алкалаевой (Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН, Москва) с помощью реконструированной системы трансляции in vitro согласно методу описанному Alkalaeva et al. (2006).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение структуры М-домена eRF1 человека в растворе Структура M-домена eRF1 человека в растворе была определена методом ЯМР. Основные этапы работы включали: (а) получение образцов белка, меченного стабильными изотопами 15N и 13C; (б) измерение серии 2D и 3D спектров ЯМР; (в) отнесение сигналов 1H, 13 15 Cи N в спектрах ЯМР белка; определение ограничений на межъядерные расстояния, (г) диэдральные углы и пространственную ориентацию химических связей из спектров ЯМР; и (д) расчет семейства структур белка методом молекулярной динамики с использованием указанных экспериментальных ограничений.

Отнесение сигналов было выполнено как для дикой формы белка, так и для функционально неактивного мутанта Gly183Ala. Методы ЯМР были также использованы для определения динамических свойств белковой цепи Mдомена eRF1 в растворе.

3.1.1. Отнесение сигналов атомов основной белковой цепи и боковых цепей аминокислотных остатков M-домена Отнесения были выполнены для всех наблюдаемых сигналов основной цепи М-домена eRF1 человека и более 95% от общего числа сигналов атомов боковых цепей. Для отнесения сигналов была использована стандартная стратегия, основанная на использовании 3D гетероядерных экспериментов ЯМР (см. главу «Материалы и методы»). Следует отметить, что на спектрах, измеренных при температуре 298К, сигналы амидных протонов основной белковой цепи для аминокислотных остатков (а.о.) фрагмента 177-187 (т.е.

петли, содержащей мотив GGQ) отсутствовали. Так, на спектре 15N,1H-HSQC, записанном при 298К, не удалось обнаружить сигналов амидных протонов Gly181, Gly183 и Gly184, вследствие быстрого обмена их амидных протонов с водой. Несмотря на то что, сигналы амидных протонов основной белковой цепи для Gln185 не детектировались, на спектре 15N-HSQC были обнаружены и отнесены сигналы его амидных протонов боковой цепи. Тем не менее, все отсутствующие при 298К сигналы петли 177-187 удалось обнаружить и отнести на спектрах 15N-HSQC, измеренных при температурах 288К и ниже (рис. 3.1). Отнесения сигналов петли 177-187 при температуре 278К были выполнены с помощью 3D спектров HNCA и 15N-NOESY-HSQC.

Рис. 3.1. Область глицинов спекрта 1H, 15 N-HSQC М-домена eRF1 человека, записанного при температуре 278К. Нумерация а.о. соответствует eRF1.

Химические сдвиги 1H, 15 N и 13C M-домена eRF1 были депонированы в базу данных BioMagResBank (http://www.bmrb.wisc.edu) под кодом BMRBОпределение вторичной и третичной структуры М-домена eRF1 человека Анализ спектров ЯМР, измеренных при температурах 278 и 298К, позволил получить ограничений на межъядерные расстояния, торсионные углы и ориентацию связей N-H (табл. 3.1.). Для этого были применены стандартные методы двойного и тройного резонанса ЯМР с использованием как немеченого препарата М-домена eRF1, так и меченного N/13C. Большинство ограничений на стабильными изотопами N или межядерные расстояния было получено из спектров NOESY (спектров ядерного эффекта Оверхаузера - ЯЭО), записанных при 298К. Для тех остатков, сигналы которых отсутствовали при этой температуре, а также для некоторых других, претерпевающих быстрые внутримолекулярные движения, ограничения ЯЭО получали из спектров, измеренных при 278К.

Для большинства аминокислотных остатков М-домена количество контактов ЯЭО, приходящееся на один аминокислотный остаток, составляло от 20 до

40. Однако, для остатков участка 178-184 и некоторых других, также находящихся в подвижных петлях, это количество было заметно меньше (см.

рис. 3.2).

Для определения ориентационных ограничений были измерены остаточные константы диполь-дипольного взаимодействия (ОКДДВ) 1DNH N и 1H амидных групп белка. Всего было измерено 59 между ядрами величин ОКДДВ при 298К, лежащих в диапазоне от -47Гц до +37 Гц, и 61 значение ОКДДВ при 283K в диапазоне от -52 Гц до +38 Гц.

На основе всех полученных данных было рассчитано семейство из 25 структур ЯМР (рис. 3.3.). Из рассчитанных 25 конформеров определена репрезентативная структура, дающая наименьшую сумму среднеквадратичных отклонений (RMSD) координат тяжелых атомов полипептидной цепи (С, C и N) при суперпозировании на нее всех остальных членов семейства. Величина такого среднеквадратичного отклонения не превышала 0.9.

Рис. 3.2. Гистограмма распределения числа ЯЭО на каждый аминокислотный остаток M-домена eRF1. Синим цветом показаны ЯЭО внутри одного остатка;

бирюзовым – ЯЭО между соседними остатками; желтым – ЯЭО между остатками, удаленными друг от друга по белковой цепи от 2 до 5 а.о.; красным цетом показаны более дальние ЯЭО.

Если исключить из анализа наименее структурированный фрагмент 175-189, значение RMSD координат атомов остальной белковой цепи не превышает 0.4, что соответствует структуре высокого разрешения. На карте Рамачандрана в благоприятной области находится 89,9% аминокислотных остатков всего семейства структур и ни одного остатка в запрещенной области (рис. 3.4). Координаты атомов 25 рассчитанных структур и экспериментальные ограничения, использованные в расчетах были депонированы в банк белковых структур (Protein Data Bank) под кодом 2HST.

Таблица 3.1.

Статистические параметры расчета структуры M-домена eRF1.

–  –  –

Рис. 3.3. Структура М-домена eRF1 человека в растворе. Стереоизображение семейства 25 рассчитанных структур (показаны красным цветом), суперпозированные по тяжелым атомам основной цепи. При суперпозиции не учитывался плохо структурированный участок петли GGQ (а.о. 175-189). Синим цветом, для сравнения, показана структура М-домена eRF1 человека в кристалле, суперпозированная на репрезентативную структуру белка в растворе.

Рис. 3.4. Карта Рамачандрана (торсионные углы и основной цепи белка) для всего семейства 25 конформеров М-домена eRF1 человека в растворе. Остатки глицинов показаны в виде треугольников, все остальные аминокислотные остатки

– в виде квадратов.

3.1.3. Анализ структуры М-домена eRF1 человека Топология М-домена eRF1 человека представляет собой -ядро,

-листами формируемое пятью параллельными, так и (как антипараллельными), окруженное четырьмя -спиралями: 1-4 (рис. 3.5).

Лист 3 и наиболее длинная спираль 1 характеризуются наличием резких изгибов в области а.о. 168-169 и 195-196, соответственно. Спираль 1 начинается с С-конца петли GGQ (а.о. 175-189) и ведет к листу 4. Структура содержит несколько петель, самой длинной из которых является GGQ-петля.

Петля между спиралью 1 и листом 4 имеет конформацию, подобную двум антипараллельным -листам с перегибом в положении Gly216.

Структура изолированного М-домена eRF1 человека в растворе близка к установленной ранее структуре в кристалле в составе целого eRF1 (Song et al., 2000), однако далеко ей не идентична (рис. 3.3). Величина RMSD для атомов белковой цепи (С, N, O и С) при суперпозиции 25 структур ЯМР на структуру в кристалле составляет Значение при 3.8±0.2. RMSD аналогичной суперпозиции наиболее структурированных участков (а.о. 144и 200-272) намного меньше и составляет 2.7±0.1. Наиболее заметны различия в ориентации GGQ-петли и ее переходе в спираль 1.

Достоверность ориентации петли GGQ в полученной нами структуре основана на использовании ограничений констант остаточного дипольD(15N,1H), дипольного взаимодействия экспериментальные значения которых хорошо согласуются с рассчитанными исходя из полученных структур.

Рис. 3.5. Топология репрезентативной структуры М-домена eRF1 человека с указанием элементов его вторичной структуры.

Рис. 3.6 Значения RMSD координат атомов основной цепи (C, C и N) Мдомена eRF1 человека, полученные при суперпозиции фрагментов из 5 а.о. каждого конформера семейства 25 структур в растворе на соответсвующие фрагменты в кристаллической структуре М-домена в составе целого eRF1 человека. На графике показаны значения RMSD для центрального а.о. в фрагменте и величина их стандартных отклонений.

При попарном сравнении фрагментов длиной по 5 аминокислотных остатков структуры М-домена в растворе с кристаллической (рис. 3.6) обнаружены также различия в геометрии участков 194-197, 213-219, 237-245 и 258-260. Все перечисленные участки, кроме 194-197, соответствуют петлям, соединяющим элементы вторичной структуры. Аминокислотные остатки 194-197 расположены на изгибе спирали 1 и в кристаллической структуре eRF1 человека не видны (Song et al., 2000). Таким образом, различия между структурой М-домена eRF1 в кристалле и его структурой в растворе заключаются преимущественно в ориентации петель и -спиралей относительно -ядра белка. Они могут быть обусловлены вероятными эффектами кристаллической упаковки, влиянием соседних С- и N-доменов на структуру М-домена в составе целого eRF1 в кристалле и/или неточностью определения координат некоторых участков белка из-за низкого разрешения кристаллической структуры eRF1. Следует отметить, что около 2.8% аминокислотных остатков eRF1 в кристаллической структуре находятся в запрещенных областях карты Рамачандрана (Song et al., 2000).

3.1.4. Влияние замены G183A в М-домене eRF1 В дополнение к определению структуры М-домена eRF1 человека дикого типа был проведен анализ структуры мутанта G183A. Из функциональных исследований (Frolova et al., 1999) известно, что замена G183A в белке eRF1 приводит к полной потере его активности. Сравнение спектров М-домена дикого типа и его мутантной формы G183A, записанных при температуре 298К, показало, что химические сдвиги абсолютного большинства сигналов М-домена дикого типа и мутанта G183A идентичны (рис. 3.7). Важным отличием стало обнаружение на спектре N-HSQC мутанта G183A помимо сигналов амидных протонов Ala183 (точки мутации) также сигналов соседних аминокислотных остатков, которые при температуре 298К не детектировались на спектре N-HSQC белка дикого типа. Сравнение со спектром N-HSQC М-домена, записанным при 278К показало, что химические сдвиги сигналов His180, Gly184 и Gly181 мутанта G183A и белка дикого типа отличаются незначительно, что указывает на небольшое (или его отсутствие) влияние данной мутации на конформацию петли GGQ. В то же время, мутация G183A вызывает существенное снижение скорости обмена амидных протонов с водой и/или ограничение подвижности GGQ-петли, что приводит к появлению сигналов петли 177-187 на спектрах, записанных при 298К. Кроме того, на спектре N-HSQC мутанта G183A были обнаружены два других сигнала, отсутствовавших на спектре белка дикого типа при 298К – Gly216 и Asn262.

Рис. 3.7. Наложение спектров 1H,15N-HSQC М-домена eRF1 человека (красный цвет) и его мутантной формы G183A (синий цвет), записанных при температуре 298К. Обозначены а.о., видимые на спектре мутантной формы, но отсутствующие на спектре белка дикого типа.

3.1.5. Геометрия петли GGQ Петля GGQ является наиболее неупорядоченной частью молекулы Мдомена eRF1. Однако, поскольку именно этот участок наиболее важен в функциональном отношении, его структура представляет особенный интерес.

Как уже было отмечено выше, при температуре 298К на спектрах, измеренных для М-домена eRF1, сигналы амидных протонов участка 177-187 белковой цепи отсутствовали. Тем не менее, их удалось детектировать и отнести в спектрах мутантной формы М-домена Gly183Ala, а также в спектрах М-домена, измеренных при температуре ниже 288К. Наиболее вероятной причиной такого исчезновения сигналов при 298К является быстрый обмен амидных протонов с водой. Существует две вероятные причины такого быстрого обмена: (а) данный участок белковой цепи координирует одну или несколько молекул воды (Jeffrey, 1997); (б) локальная величина pH данного участка белка превышает 8, что приводит к ускоренному обмену HN с водой за счет основного катализа (Molday et al., 1972). Область петли GGQ имеет положительный заряд, благодаря наличию в ней большого количества положительно заряженных аминокислот (Lys171, Lys178, Lys179, His180, Arg182, Arg189, Arg192 и Arg193). Одним из возможных последствий этого может быть повышение локального уровня pH. Тем не менее, замена G183A, не влияющая на распределение заряда в минидомене GGQ и, следовательно, на значение локального pH, вызывает значительное снижение скорости обмена амидных протонов. Это свидетельствует о том, что наиболее вероятной причиной быстрого обмена амидных протонов в GGQ-петле является координация молекулы (или молекул) воды. Таким образом, возможно, утрата мутантом G183A RFактивности объясняется именно потерей им способности координировать воду.

Для того, чтобы выполнять функцию координации молекулы воды, петля GGQ должна обладать специфической геометрией, в которой ее карбонильные и/или амидные группы ориентированы таким образом, чтобы

–  –  –

А Б Рис. 3. 8. (А) Расчетная наиболее энергетически выгодная структура минидомена GGQ, соответствующая репрезентативной структуре петли 175-189.

(Б) Гипотетическая модель координации молекулы воды в GGQ-петле.

они могли образовывать водородные связи с водой. Выбор репрезентативной конформации петли GGQ (участок 177-188) проводился на основе анализа всех конформаций, встречающихся в полученном семействе 25 структур ЯМР (табл. 3.2). Было определено репрезентативное значение каждого из торсионных углов основной цепи ( и ) и каждого торсионного угла 1 боковых цепей. Во многих случаях эти репрезентативные значения были близки к средним величинам в семействе структур. В других случаях, когда эти значения формировали два или несколько кластеров, в качестве репрезентативного, выбирали значение из наиболее населенного кластера.

Полученные значения были использованы для расчета модели структуры петли 177-188. (рис. 3.8А). Величина RMSD при суперпозиции атомов основной цепи (С, N, O и С) данной модели на соответствующую часть семейства структур ЯМР составляет При аналогичной 1.32±0.35.

суперпозиции на репрезентативную структуру семейства величина RMSD снижается до 1.02.

На репрезентативной структуре GGQ-петли карбонильные группы Gly183 и Gly184 практически параллельны друг другу и их геометрия позволяет формировать водородные связи с координируемой молекулой воды. На рисунке 3.8Б показана модель координации GGQ-петли с молекулой воды. Такая модель не является единственно возможной.

Амидные группы тех же аминокислотных остатков, Gly183 и Gly184 также практически параллельны друг другу и направлены в противоположную карбонильным группам сторону петли. Такая геометрия позволяет и этим группам формировать водородные связи с акцепторами, которыми могут быть атомы кислорода молекулы воды или, например, нуклеотидные основания тРНК. Очевидно, что экспериментально обнаружить такую молекулу воды методом ЯМР, и тем более измерить время ее жизни в координированном состоянии невозможно, ввиду быстрой динамики GGQпетли. Результаты анализа параметров релаксации ядер N (см. ниже) позволяют предполагать, что время жизни этой координированной молекулы воды не может превышать нескольких нс. Вместе с тем, при связывании с рибосомой и формировании терминационного комплекса, eRF1 подвижность белковой цепи М-домена должна снижаться и, в таком случае, время жизни молекулы воды в координированном состоянии может оказаться достаточным для ее участия в реакции гидролиза.

3.1.6. Динамика основной цепи М-домена eRF1 Экспериментально были получены значения скоростей продольной (R1) и поперечной (R2) релаксации, значения ЯЭО N амидных групп, измеренные при 278К, а также расчетные значения параметра порядка S2 (рис. 3.9). Величина времени корреляции вращательной диффузии c была рассчитана из отношений R2/R1 (Kay et al., 1989). Первоначально для анализа было выбрано 101 из 120 аминокислотных остатков, для которых были измерены значения R2 и R1 и значения которых лежали в пределах одного стандартного отклонения от соответствующих средних величин. Далее была выбрана группа 65-ти а.о., для которых величина отношения R2/R1 лежала в пределах одного стандартного отклонения. Величина c, рассчитанная для этой группы а.о. составила 20.2 ± 0.8 нс при 273K и 11.5 ± 0.5 нс при 293K. В дальнейших расчетах значение времени корреляции вращательной диффузии было принято как постоянная величина при анализе релаксационных данных.

Отношение главных осей тензора вращательной диффузии D/D = 1.8 ± 0.1, параметры порядка S2 для а.о. структурированной части белковой глобулы лежат в диапазоне 0.8 ± 0.2, время корреляции быстрых внутримолекулярных движений f составляет 20 ± 5 пс, время корреляции более медленных движений s составляет 1 ± 0.1 нс.

Рис. 3.9. Параметры релаксации ядер N амидных групп белковой цепи Mдомена eRF1, измеренные при 18.7T (800 МГц протонного резонанса) и 278K. R1 cкорость продольной релаксации; R2 - скорость поперечной релаксации; NOE N{1H}; S2 - параметры порядка;

величина гетероядерного эффекта Оверхаузера скорость химического обмена, обусловленная конформационными Rex – перегруппировками, протекающими в мс шкале времени.

Рис. 3.10. Представление белковой цепи M-домена eRF1 человека в виде трубки, ширина которой соответствует относительной амплитуде внутренних движений белковой цепи. А. Быстрые движения (от пс до нс): ширина пропорциональна величине 1-S2, где S2 – параметр порядка, рассчитанный из релаксационных экспериментов. Б. Медленные конформационные (мс) перегруппировки: ширина цепи пропорциональна величине Rex – увеличения скорости поперечной релаксации за счет химического обмена.

Наибольшей амплитудой движений, происходящих в шкале времени от пс до нс в М-домене eRF1 обладает GGQ-петля (рис. 3.10). Кроме того, в спектрах 15N-HSQC, измеренных при 278К, аминокислотные остатки Gly181, и Gly184 наблюдаются в виде групп сигналов различной Gly183 интенсивности, что свидетельствует о существовании данного фрагмента белковой цепи в виде смеси конформеров, переходящих друг в друга в шкале времени от мс и выше. Эти факты указывают на сложный характер динамики GGQ-петли, включающей как быстрые движения белковой цепи, так и более медленные конформационные перестройки.

Вторым наиболее подвижным фрагментом (исключая N-концевой участок) М-домена оказалась петля, находящаяся на противоположном мотиву GGQ конце длинной спирали 1. Эта относительно короткая петля (а.о. 215-223) претерпевает как быстрые (в шкале времени порядка 1 нс), так и более медленные (миллисекундные) движения.

Многие РНК- и ДНК-связывающие белки характеризуются наличием участков с высокой подвижностью (Baleja et al., 1992; Privalov et al., 1999;

Williamson et al., 1999), которая может облегчать их правильное связывание с лигандом. Таким образом, подвижность петель 175-189 и 215-223 в составе М-домена, возможно, играет роль в поддержании конформационной пластичности белка для его эффективного связывания с рибосомой. Вместе с тем, обращает на себя внимание тот факт, что петля 215-223 располагается на стыке М- и N-доменов eRF1 и с GGQ петлей ее разделяет длинная спирали

1. Можно предположить, что в результате узнавания N-доменом стопкодона происходит изменение конформации петли 215-223. Длинная спираль 1 при этом играет может играть роль медиатора терминационного сигнала, способствуя последующему изменению конформации петли GGQ и правильному позиционированию ее в ПТЦ.

Еще одной подвижной частью молекулы, претерпевающей движения как в пс-нс, так и в мс шкале времени является начало спирали 4, которая располагается на стыке М-домена и С-домена в молекуле eRF1. Вероятнее всего, причиной подвижности данного участка является отсутствие С-домена в исследованном белке.

3.2. Изучение взаимодействия между М-доменом eRF1 человека и рибосомами эукариот Поскольку М-домен eRF1 вовлечен в гидролиз пептидил-тРНК, который происходит в ПТЦ большой субчастицы рибосомы (Frolova et al., 1999; Seit-Nebi et al., 2001; Song et al., 2000), логично предположить, что он может связываться с рибосомой. Результаты биохимических исследований подтверждают это предположение. Недавно было показано, что способность фактора eRF1 индуцировать GTPазную активность eRF3 in vitro сохраняется при удалении N-домена, то есть при использовании МС-домена, вместо целого белка (Дубовая et al., 2006). Стимуляция GTPазной активности eRF3 возможна только при образовании тройного комплекса eRF3-eRF1-рибосома (Frolova et al., 1996; Hauryliuk et al., 2006), то есть МС-фрагмент eRF1 способен эффективно связываться с рибосомой. С-домен eRF1 не вносит существенного вклада в связывание белка с рибосомой, так как in vitro RFактивность фактора сохраняется в отсутствии C-домена (Frolova et al., 2000).

Таким образом, совокупность имеющихся данных позволяют предполагать, что М-домен eRF1 способен связываться с большой субчастицей рибосомы.

Для проверки этого предположения мы провели изучение способности изолированного М-домена eRF1 человека специфично связываться с 60S субчастицей рибосомы, используя методы ЯМР. Нами был использован подход, успешно применявшийся ранее рядом исследователей для определения интерфейса взаимодействия факторов инициации трансляции IF1 (Sette et al., 1997) и IF3 (Sette et al., 1999) с 30S субъединицами рибосомы E.coli.

3.2.1. Определение способности М-домена eRF1 человека специфично связываться с 60S субчастицами рибосом Мониторинг взаимодействия M-домена eRF1 с 60S субчастицами рибосом показал, что при молярном соотношении белка к рибосоме более 5000:1 видимых изменений в интенсивности и ширине сигналов белка в Рис. 3.11. Фрагмент спектра 15N-1H HSQC М-домена eRF1 человека в присутствии 60S субъединиц рибосомы эукариот. (А) Раствор белка в отсутствии 60S субъединиц рибосомы эукариот. (Б) Соотношение рибосома/белок 1:4500. (В) Соотношение рибосома/белок 1:4250. (Г) Соотношение рибосома/белок 1:4000.

Кружками отмечены исчезающие сигналы или сигналы тех аминокислотных остатков, интенсивность которых уменьшается на порядок при взаимодействии белка с рибосомой.

Таблица 3.3 (см.

ниже). Относительная интегральная интенсивность сигналов аминокислотных остатков M-домена eRF1 при взаимодействии его с 60S субъединицей рибосомы эукариот при различных соотношениях рибосомы и белка.

За единицу принята интенсивность тех же сигналов белка в отсутствии рибосомы.

Жирным шрифтом отмечены а.о., для которых наблюдается наиболее заметное уменьшение интенсивности сигналов. Нумерация а.о. соответствует полноразмерному белку eRF1 человека. В таблице приведены данные только для тех а.о., интегральная интенсивность сигналов которых в спектрах HSQC может быть достоверно измерена.

–  –  –

спектрах не наблюдается. При последующем увеличении HSQC концентрации 60S субъединиц интенсивность сигналов белка уменьшалась, и степень такого уменьшения соответствовала изменению молярного соотношения белок/рибосома в растворе. При молярных соотношениях белка к рибосоме менее 3000:1 наблюдается практически полное уширение всех сигналов и их фактическое исчезновение из спектров HSQC. Наиболее значимые изменения в спектрах происходили в довольно узком диапазоне соотношений белка и 60S субъединиц рибосом от 4500:1 до 4000:1 (табл.3.3).

N-1H HSQC М-домена Так, на рис. 3.11 представлены фрагменты спектра eRF1 в отсутствии рибосомы (рис. 3.11А) и при дальнейшем титровании белка 60S субъединицами рибосомы (рис. 3.11Б). В указанном выше диапазоне соотношения концентраций белка и рибосомы наблюдается снижение интенсивности большинства сигналов М-домена. Для некоторых сигналов M-домена eRF1 такое изменение интенсивности оказывается чрезвычайно заметным. Так, в спектрах смеси белка и рибосомы в соотношениях 4000:1 (рис. 3.11В) и 4250:1 (рис. 3.11Г) ряд амидных сигналов белка вообще отсутствует (их резонансные положения в спектрах отмечены кружками).

Ранее спектроскопия ЯМР уже использовалась рядом исследователей для определения интерфейса взаимодействия рибосомальных белков с субъединицами рибосомы (Sette et al., 1999; Sette et al., 1997). Для успешного применения методов ЯМР необходимо существование быстрого (в шкале времени ЯМР) равновесия между свободной и связанной с рибосомой формами белка. Наблюдаемые сигналы ЯМР в этом случае содержат усредненную информацию, как о свободной, так и о связанной форме; при этом вклад каждой из форм пропорционален их содержанию в смеси. В том случае, когда измеряемый спектральный параметр связанной формы белка значительно отличается от аналогичного параметра свободной формы, даже небольшое содержание связанной формы может существенно изменить наблюдаемый параметр. В этом случае удается использовать значительный молярный избыток белка по отношению к рибосоме. В работе (Paci et al.,

1985) авторы предполагали, что основным параметром, изменение которого определяет принадлежность а.о. к интерфейсу взаимодействия белокрибосома, является химический сдвиг. Однако расчеты показывают, что при тысячекратных избытках белка по отношению к рибосоме даже значительное изменение химического сдвига, происходящее при связывании белка, не способно объяснить наблюдаемое уменьшение интенсивности сигнала. Мы полагаем, что главным фактором в данном случае является изменение параметров релаксации ядер, прежде всего существенное увеличение скорости поперечной релаксации R2 (Luginbhl and Wthrich, 2002). Для субъединиц рибосомы, молекулярная масса которых измеряется миллионами Дальтон, время корреляции вращательной диффузии может составлять сотни нс, вследствие чего скорости поперечной релаксации ядер могут достигать нескольких сотен Гц. В этом случае импульсные последовательности ЯМР, основанные на переносе намагниченности посредством спин-спинового взаимодействия между ядрами, оказываются неэффективными, что приводит к исчезновению сигналов в спектрах. Аминокислотные остатки белка, находящиеся в непосредственном контакте с рибосомой, в этом случае будут в полной мере испытывать указанные эффекты. Для более удаленных остатков такой эффект может быть менее выражен вследствие внутренней подвижности белковой цепи, приводящей к уменьшению R2 по мере удаления аминокислотных остатков от интерфейса взаимодействия с рибосомой. Вместе с тем, если подвижность участка белка мала (например, для -листовых фрагментов), то существенное падение интенсивности может наблюдаться и для аминокислотных остатков, расположенных не на поверхности белка, а в таком жестком фрагменте.

При молярном соотношении М-домена и 60S субъединиц ниже 3000:1

происходит практически полное исчезновение сигналов на спектре HSQC.

Однако, при дальнейшем постепенном увеличении ионной силы раствора путем изменения концентрации NaCl (от 50 до 75 мМ) наблюдается восстановление интенсивности сигналов в спектрах. Увеличение ионной силы раствора уменьшает прочность связывания белка с субъединицей рибосомы и, тем самым, приводит к высвобождению связанного белка.

Постепенное восстановление интенсивности сигналов в спектрах также наблюдалось с течением времени: через 5 часов после добавления 60S субъединиц к М-домену спектры HSQC были практически идентичны контрольным спектрам белка без добавления рибосом. Наиболее вероятным объяснением такого эффекта является процесс разрушения 60S субчастиц рибосом во времени. Эффект изменения интенсивностей сигналов в спектрах HSQC обратим - при добавлении М-домена eRF1 к смеси белка с 60S субъединицами рибосомы, в спектре HSQC которого практически полностью отсутствовали сигналы, вновь наблюдалось их появление. Обратное титрование 60S субъединиц М-доменом вызывает аналогичный эффект уменьшения интенсивности сигналов при тех же молярных соотношениях, которые были найдены и в случае прямого титрования.

Добавление к раствору М-домена 40S субъединиц рибосом в молярных соотношениях белок/рибосома 3500:1 и даже 1750:1 не приводит к какимN-1H HSQC. В то же время, при либо видимым изменениям в спектрах добавлении 60S субчастиц уменьшение интенсивности сигналов амидных протонов М-домена, вызванное его связыванием с высокомолекулярными частицами, наблюдается уже в молярных соотношениях белок/рибосома 4500:1, а в растворе белка и 60S субчастиц с молярным соотношением 3000:1 практически все сигналы белка исчезали (табл. Эти данные 3.3).

свидетельствуют о специфичности связывания М-домена eRF1 с 60S субчастицами.

–  –  –

домена eRF1 при титровании его 60S субъединицами рибосомы. Следует отметить, что мониторинг изменения интенсивности был выполнен только для хорошо разрешенных сигналов, однако количество амидных сигналов, хорошо разрешенных в спектрах HSQC, составляет около 70% от их общего числа, поэтому данную выборку можно считать репрезентативной. Видно, что при увеличении содержания 60S субъединиц рибосомы от 0.022% (соотношение белок/рибосома 4500/1) до 0.025% (4000/1) интенсивность всех сигналов белка уменьшается. Однако для одних сигналов белка такое изменение интенсивности является относительно небольшим, а для других выражено существенно более заметно.

Рис. 3.12. Молекулярная поверхность, доступная растворителю, для Мдомена eRF1 человека, построенная с использованием алгоритма Конноли Темным цветом показаны аминокислотные остатки, (Connolly, 1983).

интенсивность которых изменяется наибольшим образом при взаимодействии белка с 60S субъединицей рибосомы Так, например, для сигналов концевых остатков гистидина (His6) уменьшение интенсивности мало, в отличие от сигналов аминокислотных остатков F146, Q162, L169, H170 и других, выделенных в табл. 3.3 жирным шрифтом.

Большинство из аминокислотных остатков, интенсивность сигналов амидных протонов которых максимально снижается вследствие взаимодействия белка с 60S субчастицами рибосомы, расположены на поверхности белка и сосредоточены, преимущественно, на одной ее полусфере (рис. 3.12).

Уменьшение интенсивности сигналов F146, V225 и L226, расположенных не на поверхности белка, а в его -ядре, может быть обусловлено их малой подвижностью и близостью к интерфейсу взаимодействия с рибосомой.

–  –  –

На рис. 3.13А показано строение M-домена eRF1 человека в виде комбинации элементов вторичной структуры. Аминокислотные остатки, испытывающие наибольшее влияние рибосомы в экспериментах по титрованию отмечены шарами вокруг атомов углерода C. Обращает на себя внимание тот факт, что большинство таких остатков расположены на длинной -спирали 1. Два других кластера таких аминокислотных остатков располагаются в районе короткой спирали 2 (а.о. 233-235) и на стыке спирали 3 и листа 5 (а.о. 250 и 251). Можно предполагать, что именно эти участки белка, и, прежде всего, спираль 1, участвует во взаимодействии Mдомена eRF1 c 60S субчастицей рибосомы эукариот. В результате исследования динамических свойств М-домена eRF1 человека, нами уже было сделано предположение о том, что спираль 1 участвует в передаче терминационного сигнала от связавшегося со стоп-кодоном N-домена к GGQ-петле М-домена (см. выше). Вполне вероятно, что до узнавания стопкодона спираль 1 может находиться в такой конформации, которая не позволяет ей эффективно связаться с соответствующим сайтом 60S субчастицы рибосомы. После декодирования N-доменом стоп-кодона и последующих конформационных перестроек в N-домене eRF1 может происходить изменение конформации и петли 215-223, находящейся на стыке N- и M-доменов. Спираль 1 является структурным фрагментом, соединяющим петлю 215-223 с петлей GGQ (см. выше). В ответ на изменение конформации петли 215-223 конформация спирали 1 может изменяться таким образом, что ее связывание с сайтом в 60S субчастице становиться возможным. В результате такого функционального связывания может происходить правильное позиционирование петли GGQ в ПТЦ, что в свою очередь приводит к инициации гидролиза связи пептидил-тРНК.

Приведенная гипотеза основана на приведенных выше экспериментальных наблюдениях, однако, ее строгое доказательство еще требует проведения дальнейших углубленных исследований.

Интересно, что длинная -спираль, подобная 1, существует в домене 3 факторов терминации трансляции прокариот RF1 и RF2, который содержит GGQ-петлю и взаимодействует с большой субъединицей рибосомы (Petry et al., 2005; Vestergaard et al., 2001). Кроме того, такая же спираль есть в центральном домене гомологичного eRF1 белка Dom34, который тоже связывается с большой субчастицей рибосомы (Graille et al., 2008). Несмотря на практически полное отсутствие структурной гомологии между факторами эукариот и прокариот (Vestergaard et al., 2001), положение этой длинной спирали совпадает. Так, наложение координат атомов С спирали 1 Mдомена eRF1 на аналогичные координаты RF1 в терминационном комплексе рибосомы Thermus thermophilus (Petry et al., 2005) показывает близкую ориентацию длинной -спирали по отношению к GGQ петле и почти точное совпадение положения трипептидных фрагментов GGQ в прокариотическом и эукариотическом белках (рис. 3.14).

Рис. 3.14. Наложение координат атомов C структуры M-домена eRF1 человека в растворе (показана синим цветом) на координаты атомов C кристаллической структуры RF1 в терминационном комплексе рибосомы Thermus thermophilus (Petry et al., 2005) (показана красным цветом). Для суперпозиции двух белков использован фрагмент длинной -спирали в каждом из них (1 для eRF1). Атомы C строго консервативного трипептидного фрагмента GGQ показаны в виде шаров.

Такое структурное сходство может говорить об общих функциональных свойствах данного участка факторов терминации трансляции 1-го класса прокариот и эукариот. Таким образом, вполне вероятно, что предложенный механизм передачи сигнала может оказаться справедливым и для прокариотических факторов терминации. Следует отметить, что показанное на рисунке 3.14 структурное соответствие эукариотического и прокариотического факторов в виде близкого пространственного совпадения положений длинной -спирали и трипептида GGQ наблюдается только для структуры M-домена eRF1 в растворе, полученной в настоящем исследовании. Попытка наложения кристаллической структуры eRF1 на структуру RF1 в терминационном комплексе рибосомы Thermus thermophilus оказывается менее удачной.

Отмеченные выше достоверные различия между ориентацией GGQ петли Мдомена eRF1 в растворе и кристалле играют ключевую роль в корректном пространственном наложении эукариотического и прокариотического белков.

3.2.3. Влияние замены G183A на связывание М-домена eRF1 человека с 60S субчастицами рибосом Для изучения взаимодействия функционально неактивного мутанта G183A M-домена eRF1 c 60S субъединицами рибосом мониторинг изменения интенсивности сигналов в спектрах HSQC проводился в растворах белок/рибосома при их молярных соотношениях 8000:1, 5000:1, 4000:1, 3000:1 и 1500:1. Уменьшение интенсивности сигналов в спектрах HSQC наблюдалось лишь при увеличении относительной концентрации 60S субъединиц рибосомы к белку более 0.025% (т.е. при соотношениях белок/рибосома 4000:1, 3000:1 и 1500:1). При этом в спектре раствора Mдомен eRF1/рибосома 4000:1 наблюдалось изменение интенсивности лишь для нескольких сигналов (табл. 3.4). При соотношении белок/рибосома 3000:1 таких сигналов насчитывалось немногим более десяти. В число Таблица ниже). Интегральная интенсивность сигналов 3.4 (см.

аминокислотных остатков мутанта G183A M-домена eRF1 при взаимодействии его с 60S субъединицей рибосомы эукариот при различных соотношениях рибосомы и белка, нормированная на интенсивность тех же сигналов в отсутствии рибосомы.

Жирным шрифтом отмечены а.о., для которых наблюдается наиболее заметное уменьшение интенсивности сигналов. Нумерация а.о. соответствует полноразмерному белку eRF1 человека. В таблице приведены данные только для тех а.о., интегральная интенсивность сигналов которых в спектрах HSQC может быть достоверно измерена.

–  –  –

аминокислотных остатков, интенсивность амидных протонов основной белковой цепи которых изменяется наибольшим образом, входят Ala 183, Gly 184, Ser 186, Thr 208, Gly 216, Thr 234, Ser 239. Для Arg 198, Asn 220 и Arg 245 наблюдается также уменьшение интенсивности сигналов NH боковых цепей аминокислотных остатков. Следует отметить, что даже при соотношении белок/рибосома в спектрах удается наблюдать 1500:1 значительное число сигналов мутантной формы G183A M-домена eRF1, что отличает ее от дикой формы белка, для которого уже при соотношении белок/рибосома 3000:1 в спектрах HSQC отсутствовали практически все сигналы.

Добавление к раствору мутантной формы М-домена eRF1 G183A 40S субъединиц рибосом в молярных соотношениях белок/рибосома 3500:1 и даже 1750:1, так же как и в случае с белком дикого типа, не приводило к каким-либо видимым изменениям в спектрах 15N-1H HSQC.

Сравнение результатов изучения взаимодействия 60S субъединиц рибосомы с M-доменом eRF1 человека дикого типа и с мутантом G183A позволяет сделать ряд выводов. Во-первых, мутант G183A характеризуется, как и дикий тип белка, специфическим связыванием с 60S частицами рибосомы. Во-вторых, прочность такого взаимодействия с рибосомой для мутанта оказывается существенно ниже, чем для белка дикого типа.

Невозможно выполнить точную количественную оценку степени уменьшения константы связывания белка с рибосомой, вызванного мутацией, однако, сам факт такого уменьшения не вызывает сомнения. Если при соотношении M-домена eRF1 с рибосомой 4000:1 интенсивность большинства сигналов белка существенно падала, то для мутанта G183A аналогичное изменение интенсивностей сигналов амидных протонов достигалось лишь при соотношении 1500:1, т.е. при почти трехкратном увеличении концентрации рибосомы. В-третьих, для мутанта G183A меняется и список аминокислотных остатков, подверженных влиянию рибосомы. Число таких остатков для мутанта G183A меньше, чем для белка дикого типа. Рис. 3.13Б иллюстрирует расположение аминокислотных остатков, наиболее заметно меняющих свою интенсивность при титровании мутанта G183A 60S субъединицами рибосомы. Заметно, что геометрия взаимодействия мутанта G183A несколько отличается от белка дикого типа.

В частности, для мутантной формы не наблюдается кластеризации взаимодействующих аминокислотных остатков на длинной 1-спирали.

Структурные исследования (см. выше) показали, что мутация G183A не приводит к заметному изменению структуры М-домена но eRF1, ограничивает конформационную подвижность Можно GGQ-петли.

предполагать, что такое ограничение подвижности петли не позволяет реализовать более прочное связывание М-домена с 60S субчастицей рибосомы через спираль 1, и, таким образом, препятствует правильному позиционированию М-домена в рибосоме.

3.3. Функциональная роль аминокислотных остатков минидомена GGQ Результаты проведенных нами структурных исследований позволили предположить, что минидомен GGQ непосредственно вовлечен в механизм гидролиза пептидил-тРНК, осуществляя функцию координации молекулы воды, которую выполняют два консервативных остатка глицина в мотиве GGQ. Возможно, что вклад минидомена GGQ в процесс гидролиза этим не ограничивается и включает участие в катализе реакции каких-либо его функциональных групп. Чтобы проверить эту гипотезу необходимо было провести функциональный анализ аминокислотных остатков, входящих в состав минидомена GGQ. Для этого методом сайт-направленного мутагенеза были получены различные мутантные формы eRF1 человека, содержащие точечные замены в области минидомена GGQ. Полученные мутантные форма анализировали с помощью разработанной в нашей лаборатории модифицированной реконструированой системы трансляции in vitro, которая предоставляет возможность оценки влияния введенных мутаций на RFактивность eRF1, связывание его с предтерминационным комплексом и способность вызвать его конформационные перестройки.

3.3.1. Анализ первичной структуры минидомена GGQ факторов терминации трансляции 1-го класса Минидомен GGQ содержит высокий процент инвариантных и полуконсервативных аминокислотных остатков (рис. 3.15). Такая высокая консервативность может быть обусловлена в большей степени функциональной ролью этих аминокислотных остатков, чем их участием в образовании трехмерной структуры, так как обычно одиночные замены в петлевых участках белка не приводят к существенным изменениям стабильности белка и его конформации. Следует отметить, что, наряду с другими аминокислотными остатками, минидомен содержит GGQ инвариантные His и Ser (в eRF1 человека положения 180 и 186, соответственно), абсолютной консервативностью которых также характеризуются некоторые классы гидролаз (Dodson and Wlodawer, 1998;

Polgar, 2005). Так, на основе данных рентегноструктурного анализа и мутационных исследований было установлено, что в активный центр пептидил-тРНК гидролаз E. coli входят остатки Asn10, His20 и Asp93 (Schmitt et al., 1997). При этом предполагается, His20 выполняет в реакции гидролиза пептидил-тРНК функцию каталитического основания (Goodall et al., 2004).

Так как eRF1 ответственен за протекание такой же, с химической точки зрения, реакции, можно предположить, что его консервативный His180 выполняет сходную функцию. Кроме того, наличие рядом консервативных остатков Gly также является характерной чертой строения активных центров гидролаз (Dodson and Wlodawer, 1998; Polgar, 2005).

Таким образом, анализ первичной структуры GGQ-петли позволил предположить, что может обладать свойствами гидролазы и eRF1 непосредственно участвовать в реакции гидролиза сложноэфирной связи в пептидил-тРНК в пептидил-трансферазном центре рибосомы.

А Б Рис. 3.15. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей минидомена GGQ эукариотических (А) и прокариотических (Б) факторов терминации трансляции первого класса. Белым на черном фоне выделены абсолютно консервативные аминокислотные остатки, черным на сером фоне выделены полуконсервативные аминокислотные остатки. Над последовательностью показаны элементы вторичной структуры. Звездочками помечены позиции, в которые вводились замены (см. Табл.1).

–  –  –

Для проверки этой гипотезы и установления роли отдельных аминокислотных остатков минидомена GGQ в гидролизе пептидил-тРНК нами проводился анализ мутантных форм eRF1 человека, содержащих замены в следующих позициях: Asp175, Lys178, Lys179, His180, Gly181, Gly183, Gly184, Gln185, Ser186 и Arg189. Полученные мутантные белки исследовали на их способность связываться с предтерминационным комплексом (pre-TC) и вызывать конформационные перестройки, а также определяли их RF-активность (табл.3.5).

3.3.2. Связывание мутантных форм eRF1 с предтерминационным комплексом и их способность вызывать конформационные перестройки Способность вызывать конформационные перестройки eRF1 предтерминационного комплекса (pre-TC) и связывание с ним без индукции последних отражают два различных типа связывания фактора: (а) функционально значимое связывание, в результате которого происходят конформационные изменения в pre-TC, и при котором eRF1 активируется и вызвает гидролиз пептидил-тРНК, и (б) связывание, которое не вызывает указанных изменений и отражает способность фактора связываться с рибосомой.

В целом, исследованные нами мутации оказывают гораздо менее значимый эффект на связывание eRF1 с pre-TC, по сравнению с их влиянием на способность вызывать конформационные перестройки (табл.3.5). Это означает, что данные мутации не вызывают нарушения в структуре белка и не влияют на узнавание им стоп-кодона. Замены в положениях Asp175, Gly181 и Gln185 не оказывают существенного влияния как на связывание, так и на конформационные перестройки pre-TC. Мутантные формы eRF1 по Lys178 и Lys179 сохраняют способность к связыванию и индукции конформационных перестроек в том случае, если происходит замена на положительно заряженные аминокислотные остатки. При замене Lys178 на фактор перестает вызывать конформационные перестройки, а Asp связывание его с pre-TC падает примерно на 50%. Наиболее значительное влияние на способность вызывать конформационные изменения pre-TC оказывают замены в положении Arg189. При замене этого остатка на Ala или Gln способность вызывать конформационные перестройки практически исчезала, тогда как связывание указанных мутантных форм eRF1 сохранялось на уровне 80%. Только при замене аргинина на положительно заряженный лизин индукция конформационных перестроек сохранялась примерно на 50%. Возможно, инвариантные Arg189, Lys179 и Lys178 участвует во взаимодействии GGQ-петли с отрицательно заряженной пептидил-тРНК и/или 28S рРНК.

3.3.3. Анализ RF-активности мутантных форм eRF1 Замены вариабельных аминокислотных остатков Asp175 и Gly181 не оказывали влияния на RF-активность. eRF1, содержащий мутации в положениях Lys178 и Lys179, сохранял RF-активность только в случае замены на положительно заряженный аргинин. Остальные мутантные по этим позициям eRF1 теряли активность либо полностью, либо частично.

Схожие результаты получены и при замене Arg189. Мутации Arg189Ala и Arg189Gln приводили к потере как способности вызывать конформационные перестройки, так и гидролизовать пептидил-тРНК. Сохраняющая положительный заряд мутация Arg189Lys также вызывала снижение активности, однако, в меньшей степени.

Все полученные замены в положении His180 приводили к полной инактивации eRF1. Такой же эффект вызывали замены в положениях Gly183 и Gly184, что подтверждает данные, полученные ранее (Frolova et al., 1999).

Кроме вышеперечисленных остатков, для поддержания функциональной активности eRF1 необходимы Gln185 и Ser186. Замены этих инвариантных аминокислотных остатков даже на химически близкие (Gln185Asn, Ser186Thr) приводили к значительной потере активности. Следует отметить, что замены в положениях His180, Gly183, Gly184, Gln185 и Ser186 не влияют на связывание eRF1 с pre-TC, кроме мутации Gly184Ser, приводящей к уменьшению уровня связывания до 65% от исходного. Можно предполагать, что эффект мутации Gly184Ser связан с потерей подвижности GGQ-петли и невозможностью ее корректного позиционирования в PTC.

3.3.4. Возможный механизм гидролиза пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы эукариот На основании полученной нами трехмерной структуры М-домена eRF1 и функционального анализа мутантных форм eRF1 можно предложить следующий вероятный механизм гидролиза пептидил-тРНК в ПТЦ, в котором eRF1 играет роль катализатора (рис. 3.16).

На первой стадии формируется водородная связь между карбонильным атомом кислорода пептидил-тРНК и NH2-группой Gln185. Другая водородная связь формируется между ОН-группой Ser186 и N3-атомом имидазольного кольца His180. Затем происходит атака карбонильной группы субстрата активированным серином (рис. 3.16а). NH2-группа Gln185 выступает в качестве электрофила и действует как активатор субстрата. Действительно, при замене Gln на содержащие NH2- или NH-группы Asn, Arg или Gly мутантные формы eRF1 частично сохраняют RF-активность, тогда как замена Gln185 на аминокислотные остатки, не имеющие амидных групп (Glu, Ile) приводит к полной потере RF-активности белка (табл. 3.5). Song et al. (2000) предполагали, что роль глутамина в мотиве GGQ заключается в координации молекулы воды, однако как наши данные, так и данные, полученные раннее (Seit-Nebi et al., 2001) не поддерживают эту гипотезу. Seit-Nebi et al. (2001), исходя из данных о влиянии замен Gln185 на RF-активность фактора eRF1 человека, в свою очередь, предположили, что функция данного аминокислотного остатка состоит в поддержании правильной конформации петли GGQ. Однако в нашем исследовании замены Gln185 не приводили к изменению способности фактора вызывать конформационные перестройки.

–  –  –

Рис. 3.16. Предполагаемая схема катализа реакции гидролиза пептидил-тРНК в PTC фактором терминации eRF1.

(а) Формирование водородной связи между карбонильным атомом кислорода пептидил-тРНК и NH2-группой Gln185 и между ОН-группой Ser186 и N3-атомом His180.

(б) Формирование тетраэдрического интермедиата между активированным Ser186 и пептидил-тРНК и последующая нуклеофильная атака оксианионом интермедиата сложноэфирной связи между тРНК и пептидом.

(в) Формирование ацил-энизимного интермедиата и высвобождение тРНК.

(г) Атака молекулой воды, активированной His180, карбонильной группы ацилэнзима.

(д) Формирование второго тетраэдрического комплекса.

(е) Разрыв сложноэфирной связи между пептидилом и Ser186 и возвращение минидомена GGQ в исходное состояние.

Это свидетельствует в пользу того, что конформация петли 177-187 при замене Gln185 не нарушается.

На следующей стадии происходит образование тетраэдрического оксианионного интермедиата после чего происходит (рис. 3.16б), нуклеофильная атака сложноэфирной связи между тРНК и пептидильным остатком, активированным атомом кислорода в тетраэдрическом интермедиате. В результате образуется ацилэнзим (рис. 3.14в), который гидролизуется молекулой воды, координируемой, как можно предположить из данных структурного анализа (см. выше), остатками Gly183 и Gly184.

Координируемая двумя остатками глицина молекула воды вероятно активируется путем формирования водородной связи с His180, за счет чего происходит увеличение ее нуклеофильного потенциала (рис. 3.16г).

Активированная молекула воды атакует центральный карбонильный атом сложноэфирной связи в ацилэнзиме, в результате чего образуется второй тетраэдрический интермедиат. Разрыв сложноэфирной связи приводит к высвобождению полипептида, а минидомен GGQ возвращается в свое первоначальное состояние (рис. 3.16д и 3.16е).

Данная схема хорошо согласуется с описанными выше результатами по утрате функциональной активности мутантными формами eRF1.

Единственным исключением стала мутация Ser186Ala (табл. 3.5), которая не привела к полной потере гидролитической активности. Можно предположить, что в мутанте Ser186Ala функциональную роль Ser186 берет на себя какая-либо другая химическая группа, находящаяся поблизости кислород карбонильной группы основной цепи) либо (например, дополнительная молекула воды, которая может располагаться в полости, образованной вследствие малого размера боковой цепи аланина.

Согласно полученной нами пространственной структуре М-домена eRF1 в растворе His180 и Ser186 находятся на противоположных сторонах GGQпетли и расстояние между их боковыми цепями слишком велико для формирования водородной связи между ними и переноса протона (рис. 3.17).

Однако сближение боковых цепей His180 и Ser186 может происходить за счет высокой пластичности и подвижности GGQ-петли, а также вследствие вероятного изменения конформации GGQ-минидомена после передачи терминационного сигнала от N-домена посредством длинной спирали 1.

Таким образом, можно предположить, что eRF1 может находиться в клетке в двух различных конформациях – каталитически активной и неактивной.

Подобное переключение каталитического центра в активное состояние уже было описано для целого ряда ферментов (см. например, (Botos et al., 2005).



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Федеральное агентство по образованию РФ Беловский институт (филиал) государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский государственный университет» Кафедра общественных наук Утверждаю Директор БИФ КемГУ, Адакин Е.Е. _ «_»_200_г.ПРОФЕССИОНАЛ...»

«ИНСТРУКЦИЯ (алгоритмы) ПО ДЕЙСТВИЯМ ПРИ ВОЗНИКНОВЕНИИ ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЙ Настоящая инструкция определяет действия работников в случае возникновения на территории университета и за ее пределами чрезвычайных ситу...»

«835 УДК 577. 152.1. : 616.323.4 Применение ионообменной хроматографии для очистки глутатионредуктазы из печени крысы в условиях нормы, при токсическом гепатите и введении тиоктовой кислоты Агарков А.А., Попова Т.Н. Семенихина А.В. ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет», Воронеж Аннотация Проведена очистка глутатион...»

«Юрий Федоров КАЗАХСТАН: В ПРЕДЧУВСТВИИ НЕСТАБИЛЬНОСТИ Стратегическое значение Казахстана выходит за рамки Центральной Азии. Эта страна является значимым поставщиком нефти на европейский и китайский рынки1. Еще важнее, что Казахстан представляет своего рода стратегический буфер, разделяющий Россию и с...»

«А.К. Заикин 4. Fayers M. Elimination Tournaments Requiring a Fixed Number of Wins [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.maths.qmul.ac.uk/~mf/papers/meko.pdf, свободный. Яз. англ. (дата обращения 09.02.2011).5...»

«Преподобный Иоанн Дамаскин Философские главы Оглавление I. О познании II. Какая цель этого произведения? III. О философии IV. О сущем, субстанции и акциденции V. О звуке VI. О разделении VII. О том, что по природе существует прежде VIII. Об определении IX. О роде X. О виде XI. Об индивиде XII. О разности X...»

«Высшее образование Серия основана в 1996 г. В.И. Фомичев Международная ТОРГОВЛЯ 2-е издание, переработанное и дополненное Рекомендовано Министерством общего и профессионального образования Российской Федерации в качестве уче...»

«Ж.М. Юша СВАДЕБНАЯ ОБРЯДНОСТЬ ТУВИНЦЕВ: ТРАДИЦИИ И ИННОВАЦИИ Цель статьи – рассмотрение традиционной свадебной обрядности, определение роли и места вербального компонента в структуре данных ритуалов, а также анализ их функционирования на современном этапе. В к...»

«МИНОБРНАУКИ РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» Факультет лингвистики и словесности «УТВЕРЖДАЮ» Декан факультета лингвистики и словесности _ С.Г. Агапова...»

«Отбор проб для лабораторных исследований Пробы необходимо брать немедленно, сразу же после обнаружения признаков применения бактериологического оружия, и прежде всего из тех мест, где наиболее вероятно быстрое обнаружение примененного возбудителя (остатки боеприпасов, капли жидкости, порошковидные вещества и...»

«ISSN 2076-2429 (print) 67 Праці Одеського політехнічного університету, 2013. Вип. 1(40) ISSN 2223-3814 (on line) С.Г. Антощук, д-р техн. наук, проф., УДК 004.932.72’1 Н.А. Годовиченко, магистр, Одес. нац. политехн. ун-т АНАЛИЗ ТОЧЕЧНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ИЗОБРАЖЕНИЯ В СИСТЕМЕ «МОБИЛЬНЫЙ ВИРТУАЛЬНЫЙ ГИД»...»

«П. Л. КАРАБУЩЕНКО СТАНДАРТНАЯ МОДЕЛЬ ЭЛИТОГЕНЕЗА: ДНК ЭЛИТЫ, ПДК ЭЛИТНОСТИ И КПД ЭЛИТИЗАЦИИ Чаще всего элиты мы оцениваем не по содержанию (внутреннему качеству, свидетельствующему о ее достоинстве), а по форме (статусу, который носит преимущественно фо...»

«Октябрина Алексеевна Ганичкина Александр Владимирович Ганичкин Моим цветоводам Серия «Октябрина Ганичкина советует» http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=6299238 О.Ганичкина, А.Ганичкин. Моим цветовода...»

«Анжела 18.05.2013 17:12 ЗАОЧНОЕ РЕШЕНИЕ ИМЕНЕМ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ДД.ММ.ГГ Люберецкий городской суд Московской области в составе: председательствующего судьи Журавлевой И.А., при секретаре  Пи...»

«Проект ЦЕНТРАЛЬНЫЙ БАНК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (БАНК РОССИИ) «_»2016 г. №-П г. Москва ПОЛОЖЕНИЕ О требованиях по расчету норматива достаточности собственных средств (капитала) профессиональными участниками рынка ценных бумаг, имеющими лицензию на осуществле...»

«Н.М. ВЕЛИКАЯ ПРОБЛЕМЫ КОНСОЛИДАЦИИ ОБЩЕСТВА И ВЛАСТИ ВЕЛИКАЯ Наталия Михайловна — кандидат социологических наук, доцент Российского государственного гуманитарною факультета. Социально-политическое развитие современного российского общества характеризуется существенным преобладание...»

«5 (18) апреля Священномученик Николай (Симо) Священномученик Николай родился 6 декабря 1875 года в городе Аренсбурге Эстляндской губернии в семье священника Адама Симо; в 1888 году отец Адам был назначен в эстонский приход, открывшийся при Андреевском соборе в Кронштадте. В...»

«Author: Штыров Валерий Яковлевич Обратное дерево игроков  Обратное дерево игроков1Таблица 1R ABCD1bac 2acb 3cba     Пусть дана таблица 1, определяющая игру А игроков D и R, которая представляет для обоих игроков черный ящик с входами для D 1,2,3 и для R А,В,С. В качестве выхода выступают данные ячейки, на которой пересекаются выборы игроков....»

«Динамика и структура государственного долга Тверской области. Аналитическая записка.В соответствии со статьей 99 Бюджетного кодекса Российской Федерации: 1. Государственный долг субъекта Российской Федерации совокупность долговых обязательств субъекта Российской Федерации.2. Государственный долг с...»

«Сентября 15 (28) Преподобноисповедник Игнатий (Бирюков) Преподобноисповедник Игнатий (в миру Иван Адрианович Бирюков) родился 25 мая 1865 года в городе Бирюче Воронежской губернии в семье крестьян Адриана Павловича и Екатерины Николаевны Бирюковых. Кроме крестьянских рабо...»

«Из решения Коллегии Счетной палаты Российской Федерации от 16 мая 2003 года № 17 (342) “О результатах тематической проверки правильности исчисления, полноты и своевременности уплаты налоговых, таможенных и других обязательных платежей в федеральный бюджет, с...»

«Петр Александрович ПОПОВ Система «Здоровые суставы и позвоночник». Микрогимнастика доктора Попова АСТ Москва УДК 615.8 ББК 53.54 П58 Попов, Петр Александрович Система «Здоровые суставы и позвоночник». П58 Микрогимнастика доктора Попова / Петр Александрович Попов — Москва: АСТ, 2014. — 240 с. Впервые о методе доктора Поп...»

«34 Этнографическое обозрение № 2, 2006 ЭО, 2006, № 2 © А. Зелькина УЧЕНИЕ КУНТА-ХАДЖИ В ЗАПИСИ ЕГО МЮРИДА Братство (араб, тарика) Кадирийя традиционно играет огромную роль как в религиозной, так и в социальной жизни Северо-Восточного Кавказа, в особенности в Чечне и Ингушетии. Наряду с тарикатом Накшбандийя сеть кадирийских отделений (араб, ви...»

«Глава 1 Советское образование на пороге перемен (Данная глава написана российскими авторами) Задача настоящего раздела состоит в выделении наиболее значимых проблем, как внешних, так и внутренних, чисто образовательных, которые стали причиной крупномасштабных преобразова...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.