WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«Номер соглашения о предоставлении субсидии (государственного контракта) 14.581.21.0016 Название проекта Разработка методов, технологий и платформ для исследований ...»

Аннотация проекта (ПНИЭР), выполняемого в рамках ФЦП «Исследования и

разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014 – 2020 годы»

Номер соглашения о предоставлении субсидии (государственного контракта)

14.581.21.0016

Название проекта

Разработка методов, технологий и платформ для исследований

функционирования нервных систем на основе создания высокоразрешающей

информационной модели кортикальных структур мозга

Тематическое направление Науки о жизни Исполнитель федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского" Цели и задачи исследования Цель проекта - разработка высокоразрешающей информационной модели кортикальных структур мозга, представляющей собой программный комплекс «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы/мыши», способной заложить основу трансляционных исследований в области функционирования ЦНС млекопитающих, а также базу для формирования нового класса стратегических технологий – искусственных когнитивных систем.

Задачи:

1 Разработать программный комплекс «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы/мыши» на основе сверхбольшого высокодоступного цифрового каталога, содержащего структурные, функциональные данные, и результаты исследований аллокации новой когнитивной информации в нейроны кортикальной колонки (выполняемых в рамках ПНИ-1).



2 Создать генноинженерные конструкции для специфического мечения астроцитов в кортикальных колонках мозга крысы/мыши.

3 Разработать методику для определения роли астроцитов в синапсе и симуляции синапса и его активности с применением ПО и алгоритмов, обеспечивающих моделирование передачи нервного импульса в сверхбольших нейроглиальных сетях (разрабатываемых в рамках ПНИ-2).

4 Разработать методику формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro.

5 Разработать методы исследования функционирования нервных систем на основе разработанного 3D Атласа.

Достижение целей обеспечивается использованием результатов ПНИ, выполняемых в 2015-2016 гг.:

ПНИ-1 «Разработка модели распознавания и фиксации новой информации в кортикальной микроколонке» (соглашение 14.607.21.0017) ПНИ-2 «Разработка технологий для репрезентации функций кортикальных структур in silico» (соглашение 14.608.21.0001) Актуальность и новизна исследования Изучение механизмов работы мозга является в области наук о жизни одним из приоритетных направлений, представляет огромный интерес для разработки новых терапевтических стратегий для диагностики и лечения неврологических и нейродегенеративных заболеваний. Понимание фундаментальных принципов обработки информации в мозге позволяет говорить о возможностях создания новых информационных технологий, использующих принципы работы систем мозга в задачах обработки данных,управления и навигации робототехнических систем.

На сегодняшний день разработан и коммерчески доступен ряд 3D атласов головного мозга млекопитающих, однако существующие 3D атласы не позволяют рассмотреть весь спектр взаимодействий, происходящих на клеточном уровне. Ключевое внимание уделяется в основном нейронам, осуществляющим функции передачи сигналов, кодирования и декодирования информации и др. Однако в последние годы растущий интерес исследователей вызывают глиальные клетки (астроциты). Данный проект направлен на получение большого массива экспериментальных данных, их анализ и моделирование с использованием суперкомпьютерных технологий, включая использование математических моделей, описывающих взаимодействие нейронов и глии в кортикальных колонках.





В результате будет сформирована электронная база и на ее основе создан 3D атлас, описывающий взаимодействие нейронов и глии в кортикальных колонках мозга. 3D атлас будет представлять собой программный комплекс, построенный на основе высокоразрешающей модели кортикальных структур мозга.

Полученные данные могут быть легко интегрированы в уже существующие международные проекты 3D атласов головного мозга и существенно увеличивать их информативность.

Описание исследования При проведении работ на втором и третьем этапах ПНИЭР использовался комплекс междисциплинарных методов и подходов, необходимых для решения поставленных задач.

В частности, задача по определению транскрипционного профиля генной экспрессии клеток коры головного мозга проводилось с помощью данных полногеномного секвенирования технологией NGS (Illumina). Картирование 100 нуклеотидных ридов со спаренными концами, полученными на Illumina, было произведено относительно референсного генома крысы [http://rgd.mcw.edu] с использованием программы TopHat. Для оценки качественных и количественных характеристик астроцитарных генов использовали метод полуколичественной полимеразной цепной реакции (полуколичественный ПЦР). Для определения локализации экспрессируемых клетками генов применялась гибридизация insitu или FISH.

При производстве вирусных конструктов, вошедших в состав набора реагентов для трансфекции астроцитов использовались молекулярно-биологические методики, для сборки вирусов использовалось два типа плазмид: шаттл и хелпер. Шаттл-вектор несет последовательности промотора, генов интереса и маркеров экспрессии. Хелперные плазмиды кодируют большую часть генома аденовируса. В качестве хелперной плазмиды использовалась плазмида pBHG10. Тестирование эффективности трансдукции астроцитов разработанными конструктами осуществлялось с помощью астроцитарных культур, полученных из коры больших полушарий мыши.

При исследовании структуры глиальных связей в кортикальных колонках головного мозга мыши применялось несколько методик биологического имиджинга, в том числе метод фМРТ. Была проведена оптогенетическая стимуляция астроцитов и измерение интенсивности BOLD-сигнала.

Эксперименты были проведены на высокопольном магниторезонансном томографе Agilent Technologies DD2-400 9.4 T (400 MHz) с объемной вертикальной катушкой M2M (Н1). Также были проведены иммуноцитохимические и электронномикроскопические исследования срезов коры больших полушарий головного мозга мыши.

Также была разработана методика формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro на матриксах-носителях (скаффолдах) на основе модифицированного хитозана.

Для создания трехмерных конструктов заданной архитектоники применялся метод двухфотонной полимеризации с помощью второй гармоники фемтосекундного лазера «ТЕМА-100» (Авеста проект, Россия).

На третьем этапе выполнения проекта при проведении исследовательских испытаний экспериментального образца набора реагентов для трансфекции астроцитов in vivo вирусный препарат инъецировался в кору головного мозга.

Регистрация экспрессии флуоресцентных белков проводилась при помощи мультифотонной лазерной микроскопии.

Для исследований изменений в - и -адренергических, пуринергических и Gбелок зависимых сигнальных путях in vitro в трансфецированных генетическими конструкциями клетках были использованы первичные астроцитарные культуры. С помощью методов метода локальной фиксации потенциала и кальциевого имиджинга регистрировалась функциональная активность трансфецированных клеток при активации исследуемых каскадов.

При проведении исследовательских испытаний экспериментальных образцов трехмерных нейронглиальных культур был применен кальциевый имиджинг с применением лазерной флуоресцентной конфокальной микроскопии и окрашивания метаболически активных клеток красителем Oregon Green 488, организация синаптических контактов исследовалась с помощью методов иммуногистохимии и электронной микроскопии.

При разработке методики определения роли астроцитов в синапсе и симуляции синапса и его физиологической активности на основе существующих экспериментальных данных была предложена и исследована модель синаптического контакта с учетом воздействия астроцита. Разработанная модель тройственного синапса описывает динамику высвобождения нейропередатчика, динамику мембранного потенциала постсинаптического нейрона (на основе биофизической модели нейрона Ходжкина-Хаксли), динамику внутриклеточной концентрации Са2+ в астроците (на основе биофизической модели астроцита Уллаха) и высвобождения глиапередатчика.

Исследовано два эффекта воздействия астроцита на синапс: пресинаптическое подавление высвобождения нейропередатчика и усиление постсинаптического тока. На основе предложенной модели были изучены механизмы двунаправленной астроцитарной регуляции частоты генерации электрических сигналов нейронами в зависимости от состояния активности нейронной сети.

Результаты исследования Работы по проекту за отчетный период выполнены полностью.

В ходе выполнения работ в 2016 году (этапы 2 и 3) были получены следующие результаты:

1. Проведены исследования нейро-, глиотрансмиттерных и рецепторных транскрипционных профилей клеток кортикальных микроколонок головного мозга. Проанализировано более 60000 генов. Детально изучены гены, кодирующие нейро- и глио-трансмиттеры. Выявлено три гена, имеющие статистически значимые отличия в уровне экспрессии в стволе головного мозга и коре полушарий: Slc6a9, Slc6a11, Gabra, Gabrg1, Grm3 и Slc6a1.

2. Проведена оценка качественных и количественных характеристик транскрипционного (экспрессионного) профиля астроцитов канонических микроколонкок коры головного мозга. Выявлены гены с высокой экспрессией;

гены, экспрессия которых характерна для астроцитов; продемонстрированы отличия уровней экспрессии генов астроцитов коры в сравнении с генами астроцитов ствола мозга; охарактеризованы гены астроцитов, кодирующие белки с различной локализацией в клетке и различными функциями.

3. Разработан и изготовлен набор реагентов для трансфекции астроцитов (ЭО НРТА) в кортикальных микроколонках головного мозга. В состав НРТА входят 5 аденовирусных векторных конструктов для трансфекции астроцитов: AVVsGFAP-ChR2-Venus, AVV-sGFAP-opto1AR –YGP, AVV-sGFAP-opto21AR –YGP, AVVsGFAP-Case12, AVV-sGFAP-DREADD-GFP.

4. Исследована с помощью биологического имиджинга (в том числе фМРТ и иммуногистохимии) и описана структура глиальных связей в кортикальных колонках мозга крысы / мыши. Показано наличие различных астроцитарных связей в сети микроколонки – от единично расположенных клеток звездчатого типа до синцития.

5. Разработана методика формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro.

6. Получены экспериментальный образцы трехмерной нейронглиальной культуры клеток (ЭО ТНКК) с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro. Подтверждено формирование морфологически и функционально полноценный нейроглиальных сетей в трехмерных культурах.

7. Разработан и согласован состав программного комплекса «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши». Разработана номенклатура разработки программных компонентов комплекса «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши».

8. Разработаны программы и методики испытаний ЭО НРТА.

9. Проведены исследовательские испытания экспериментального образца набора реагентов для трансфекции астроцитов in vivo. Продемонстрирована экспрессия соответствующих флуоресцентных белков, продемонстрированы функциональные ответы трансфецированных клеток на опто- и хемогенетическую стимуляцию.

10. Исследованы изменения в - и -адренергических, пуринергических и Gбелок зависимых сигнальных путях in vitro в трансфецированных генетическими конструкциями клетках.

11. Разработаны программы и методики испытаний ЭО ТНКК.

12. Проведены исследовательские испытания ЭО ТНКК. Зарегистрирована соответствующая этапу онтогенеза культуры спонтанная кальциевая активность.

13. Проведена оценка организации синаптического контакта в трехмерном скаффолде. С помощью иммуноцитохимического окрашивания и электронной микроскопии показано формирование зрелых синапсов в ТНКК.

14. Разработана методика определения роли астроцитов в синапсе и симуляции синапса и его физиологической активности.

Практическая значимость исследования Область применения полученных результатов – биомедицинские исследования и разработки в области изучения мозга. Применение разрабатываемого продукта возможно как при проведении фундаментальных нейробиологических исследований, так при разработке новых терапевтических стратегий при профилактике и коррекции различных заболеваний нервной системы.

3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши (ЗD Атлас) предназначен для получения полных структурных (анатомических) данных, функциональных: качественных и количественных характеристик транскрипционного (экспрессионного) профиля астроцитов; данных о физиологической активности астроцитов, нейро-, глиотрансмиттерного и рецепторного профилей; данных о структуре глиальных связей в кортикальных колонках головного мозга. 3D Атлас должен позволять осуществлять симуляцию экспериментов – моделирование активирования/ингибирования астроцитарных внутриклеточных каскадов (- и -адренергических / пуринергических / G-белок зависимых), моделирование функционального ответа нейронов, симуляцию синапса и его физиологической активности с применением программного обеспечения и алгоритмов, обеспечивающих моделирование передачи нервного импульса в сверхбольших нейроглиальных сетях.

Разрабатываемый 3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши может быть использован в трансляционных исследованиях в области функционирования центральной нервной системы млекопитающих (нейробиологических, фармакологических, токсикологических и иных исследований), а также послужит базой для формирования нового класса стратегических технологий – искусственных когнитивных систем.

3D Атлас, представляя собой интерактивную базу данных о структурной и функциональной организации кортикальных колонок, будет способствовать созданию программных комплексов тестирования фармакологических воздействий на межклеточную сигнализацию в мозге. Разработка таких комплексов крайне важна для медицинских приложений и будет являться

Похожие работы:

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный университет им. А.М. Горького» ИОНЦ «Толерантность, права человека и предотвращение конфликтов, социальная интеграция людей с ограничен...»

«Норман Уокер Система здоровья Нормана Уокера Серия «Классика оздоровления. Теория и практика (Вектор)» Текст предоставлен издательством http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=10697465 Система здоровья Нормана Уокера: Вектор; СанктПетербург; 2013 ISBN 978-5-9684-1148-8 Аннотация В данный сборник вошли работы Н. Уокер...»

«ISSN 2411-5355 СПЕЦВЫПУСК, 2015 Выходит ежемесячно с 2015 г. Журнал для заказчиков и поставщиков 100 ответов на самые актуальные вопросы заказчиков и поставщиков о закупках Издается медиагруппой «Актион» gzakypki.ru Оформите СПЕЦВЫПУСК, 2015 _КОНКУРЕНТНЫЕ ЗАКУПКИ По результатам электронного аук...»

«Станислав Матвеев СЕКРЕТЫ ФЕНОМЕНАЛЬНОЙ ПАМЯТИ Методы запоминания информации МОСКВА УДК 159.953.4 ББК 88.3 М33 Матвеев С. М33 Секреты феноменальной памяти: Методы запоминания информации / Станислав Матвеев. — М.:...»

«Принципы организации и критерии качества колоноскопии, выполняемой с целью скрининга колоректального рака Проект рекомендаций Российского эндоскопического общества для врачей-эндоскопистов, гастроэнтерологов, тера...»

«Глава 4 ДЕТЕРМИНИЗМ И ВЕРОЯТНОСТЬ Одной из фундаментальных онтологических идей, положенных в основу классического естествознания его создателями (Г. Галилей, И. Ньютон, И. Кеплер и др.), была концепция детерминизма. Эта концепция заключал...»

«ИЕРЕЙ ОЛЕГ ДАВЫДЕНКОВ Иерей Олег Давыденков СЕВИР АНТИОХИЙСКИЙ Севир (Seofpoq), будущий патриарх Антиохийский, родился в г. Созополисе в Писидии. Богословская ориентация его се­ мьи была антихалкидонитская...»

«ПРАВИТЕЛЬСТВО МОСКВЫ ДЕПАРТАМЕНТ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ И ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ГОРОДА МОСКВЫ ПРАВИЛА СОЗДАНИЯ, СОДЕРЖАНИЯ И ОХРАНЫ ЗЕЛЕНЫХ НАСАЖДЕНИЙ ГОРОДА МОСКВЫ Утверждены постановлением правительства Москвы от 10 сентября 2002 г. № 743-ПП в редакции постановления Правительства Москвы от 11 мая 2010 г. № 386-П...»

«Августин, блж. Исповедь Книга 1 I. 1. Велик Ты, Господи, и всемерной достоин хвалы; велика сила Твоя и неизмерима премудрость Твоя. И славословить Тебя хочет человек, частица созданий...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.