WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ IN VITRO Препринт 88.3 Киев ЮНЕСКО АКАДЕМИК НАУК УКРАИНСКОЙ ССР Комиссия Институт ботаники им. Н. Г. Холодного ...»

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ IN VITRO

Препринт 88.3

Киев

ЮНЕСКО АКАДЕМИК НАУК

УКРАИНСКОЙ ССР

Комиссия Институт ботаники

им. Н. Г. Холодного

Украинской ССР

по делам ЮНЕСКО

методы культивирования

РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ IN VITRO

Препринт 8 8. 3 Киев УДК 5 8 1.1

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ IN VITRO - Киев,

1988. 3 7 с. - (Препринт / АН УССР, Институт ботаники; 8 8.3 ) Зубко Михаил К онстантинович, Кириченко Игорь Владимирович, К уксова В алери я Бори совн а, Махорина Ольга К онстантиновна, Сахно Людмила А лексан дровна, Сидоров Владимир А натольевич, Скаржинс кая Марина В с ев о л о д о вн а, Юзефович Лариса В и к тор овн а.

В р аб о те подробно изложены основные принципы и техника ку ль­ тивирования i n v i t r o растительны х к л е т о к, п ро то п л асто в, пыльников и микроспор, а также микроклонального размножения на примерах важнейших модельных и сельск ох озяй ствен н ы х об ъ ек тов.

Для сп еци али стов в об л асти биотехнологии р астен ий.

(С ) И нститут ботаники АН УССР, 1988 ВВЕДЕНИЕ Культивирование растительны х к л е то к, тканей и органов in v itro к настоящему времени п ревр ати л ось в разветвленную и много­ плановую отр асл ь экспериментальной биологии. Новейшие достижения в области м у т а ге н е за, клеточной и ген ети ческой инженерии во мно­ гом определены развитием культуральных м ето д о в. На современном этапе эти методы призваны сы грать немаловажную роль в разви тии биотехнологии. Круг растен и й, доступных для манипуляций in v i t r o, постоянно расш иряется и в недалеком будущем о х в а ти т в о е х о з я й с т ­ венно-важные объекты.



Основные направления культуральной работы с растениями вклю­ чают микроразмножение, ан д р о г е н е з, культивирование клеток- про­ дуцентов ценных соединений, получение сомаклональных в а р и а н то в, соматическую гибридизацию, генетическую трансформацию, а также чисто академические исследования по цитологии, ге н е ти к е, физиоло­ гии и биохимии растен ий.

При п одготовке настоящ его препринта авторы р ук о вод ство вал и сь стремлением в небольшом объеме изложить основные принципы и прие­ мы, принятые в практике культивирования р асти тел ь н о го м атери ала i n v i t r o. М надеем ся, что при всей лаконичности э т а р аб о та буд ет ы полезной для многих начинающих и сследовател ей в данной о б л асти.

Из различных модификаций каждого м етода з д е с ь приведены т е, к о т о ­ рые чаще в с е г о применяются сотрудниками отд ел а цитофизиологии и клеточной инженерии И нститута ботаники им. Н.Г. Холодного АН УССР.

Авторы будут благодарны з а критические зам ечан ия и ценные советы по поводу настоящей работы.

ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ ВЫРАЩИВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ

КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

Культивирование изолированных клеток и тканей растений в у с ­ ловиях i n v i t r o - метод сохран ен и я жизнеспособности и размножения орган ов или их ч а с т е й, у ч а с тк о в тканей и отдельных клеток вне ор­ ган и зм а. Выращиваемые, i n v i t r o клетки и ткани являю тся биологи­ ческой моделью, на которой в контролируемых усл ови ях, близких в некоторых отношениях к естествен н ы м, п р е д став л я е тся возмож ность изучения механизмов межклеточных взаи м одей стви й, к о н т ак то в, их регуляторн ой роли. Освобождение клетки из-под влияния к орреляти в­ ных с в я зе й и зави си м остей м атеринского организма яв л я е тся научной основой м етод а изучения ее различных потенциальных возм ож ностей.

Практически в с е методические приемы культуры тканей i n v i t r o основы ваю тся на трех основных принципах:

- изолирование э к с п л а н т а т а (к л е т к а, кусочек ткан и, о р ган ) от основн ого м атерин ского р ас тен и я ;

- помещение э к с п л а н та та в контролируемые, тщательно подобранные у сл о ви я ;

- соблюдение стер и л ьн о сти выращиваемого м атер и ал а.

В настоящ ее время м етод культуры клеток и тканей in v i t r o широко прим еняется для решения многих фундаментальных воп росов ф изиологии, цитологии и ген ети к и растений / 1, 3, 4/.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

–  –  –

Перед выполнением операций в ламинарном боксе необходимо под­ готови ть его к р а б о т е. Для э т о г о используют стерилизацию у л ь т р а ­ фиолетом в течение 30 мин с последующим протиранием рук и рабочих поверхностей 7 0 - 9 6 % этанолом. Основное требование к проведению вс е х манипуляций - соблюдение условий с т ер и л ь н о сти, поэтому для работы необходимо иметь предварительно выдержанные ( 2 - 2, 5 ч а с а при температуре 1 8 0 - 2 1 0 ° ) в сушильном шкафу инструменты и п осуду.

Кроме суховоздушного способа посуду можно с т е р и л и з о в а т ь а в т о к л а вированием в течение 25 мин при 1 - 1,2 а т м. Непосредственно перед работой инструменты погружают в этанол и прожигают рабочие по­ верхности в пламени спиртовки. Грязную посуду моют де тер ген т о м, за те м тщательно промывают проточной водой и споласкивают ди сти л­ лятом. Сильно загрязненную посуду ц елесообразно мыть хромовой смесью. Вымытую посуду высушивают в сушильном шкафу. Чистую п о су ­ ду хранят в закрытых шкафах, в ч и стоте, не допускающей з а г р я з н е ­ ния даже следами химических ве щ е ств.

Стерилизация исходного растительного м атер иал а включает с л е ­ дующие операции:

- погружение в 70% этанол на 1-2 мин. для семян, на 2 0 сек для л и сть е в ;

- погружение в диоцид на 1 5-30 мин. для семян, на 6 мин. для л и с т ь е в. Диоцид г о т о в я т, р ас тво р я я отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиний хлорида в горячей воде (около 300 мл), смешивая полученные раствори и доводя объем жидкости до 1 л; добавляют несколько капель д е т е р г е н т а Твин-80. Диоцид х р а ­ нят в плотно закрытой колбе в темноте;

- многократная промывка м атериала стерильной ди стиллирован­ ной водой.

Приготовление питательных с р е д. Растворы макро- и микросолей го т о в я т со гл а сн о прописям, взвешивая и р ас тво р я я отдельно каждую навеску в новой порции бидистиллированной воды.

Растворы фитогормонов го т о в я т следующим образом:

- ауксины: 2, 4 -Д, ИУК, НУК, ИМК, пиклорам - растворяют 100 мг ве щ е ств а в 0, 5 - 2 мл эт а н о л а, подогреваю т, добавляют воды до 100 мл (концентрация 1 м г/м л );

- цитокинины: Кин, З е а, БАП - растворяю т в небольшом объеме 0,5 Н HCI, подогревают, добавляя соответствующий объем воды;

- АБК - растворяю т в 70# этан о л е, доводя до нужного объема водой ;

- ГК - р астворяю т в в о д е ;

- витамины: тиамин НС1 (В 1 ), пиридоксин НС1 (В 6 ), никотино­ в а я к и сл о та (Р Р ), аскорби н овая ки сл ота (С ), ф олиевая к и слота (В0 ), биотин (К ), парааминобензойная к и сл ота, холинхлорид, С а-п а н то т ен а т, цианкобаламин ( В ^ ), рибофлавин (В ^ ) - растворяю т в воде (кон центраци я I мг/мл или 0,1 м г /м л ).

Вое добавки необходимо хран ить в холодильнике при тем перату­ ре + 4 ° не больше м есяц а. Растворы витаминов можно зам ораж ивать и хран ить в небольших к о л и ч е ств а х.

После введен и я в ср ед у в с е х компонентов добавляю т воду до нужного объем а и доводят pH (обычно 1Н КОН). Среды г о т о в я т жидкие и твердые (а г а р и зо в а н н ы е ). Среды стерилизую т автоклавированием ( в течение 2 0 -25 мин при 0,8 - 1 а т м. и 1 2 0 °С ); жидкие среды, с о ­ держащие в е щ е с т в а, разрушающиеся при н агреван и и, стерилизую т фильтрованием ч ер ез мембранные фильтры / 1 - 3 /. В сл у чае заражения среды также необходимо п р о авто к л ави р о вать и затем тщательно вы­ мыть посуду / 3 /.

С о ста в наиболее ч ас то используемых ср ед / 3 / приведен в т а б л. I. Сокращения: 2,^ - Д - 2, 4 - дихлорйеноксиуксусмая к и слота, НУК - наф тилуксусная к и с л о та, ИУК - индолилуксусная к и сл о та, ИМ - индолилмасляная к и с л о та ; Кин - кинетин, Зеа - зе а ти н, К БАП - бензиламинопурин, АБК - аб сц и зо вая к и сл о та, ГК - ги бберелл о вая к и с л о та.





Получение каллусной тк ан и. Для индуцирования каллусной ткани стерильны е л и сть я, черешки и се гм ен та стебл ей нарезаю т и помещают на питательную с р е д у. Каллусную ткан ь можно индуцировать из любо­ го о р га н а и ткани р ас тен и я, но у сп ех за в и си т от ви да растен ия и ткани. При этом клетки р астен и й, находящиеся на крайней стадии дифференциации под во зд ей стви ем индукторов клеточных делений аукси н ов и цитокининов, п ереходят в дедифференцированное с о с т о я ­ ние и возобн овл яю т меристематическую а к т и в н о с т ь. После о б р а зо в а ­ ния к а л л у с а в асеп ти ч еск и х услови ях его отделяют и помещают на новую агари зованную питательную ср е д у,* п олу ч ается стери льн ая к у л ьту р а каллусной ткан и, ее можно поддерживать в культуре н е о г­ раниченно д о л го е вр ем я, периодически р азд ел яя на фрагменты и пе­ ресаж ивая на новую с р е д у. Для индукции каллу сооб разован и я сл е д у е т и с п о л ь зо в а т ь питательные среды с высоким (д о 1 0 -к р а тн о го ) с о о т ­ ношением ауксин :цй токи нин.

–  –  –

Клеточные с у с п е н зи и. Растительные суспензионные культуры с о ­ с т о я т из одиночных клеток и клеточных а г р е г а т о в, растущих в а эр и ­ руемой жидкой питательной сред е определенного с о с т а в а. Для выра­ щивания клеточных суспензий используются в основном те же пита­ тельные ср еды, что и для каллусных к у льту р. Создан ряд ср ед, предназначенных непосредственно для выращивания суспензионных культур / з /.

Основным способом получения суспензионных культур яв л яе тся помещение ку соч к а к а л л у с а в перемешиваемую жидкую ср е д у. В редких случаях используют эксплантаты тканей, стерильные проростки, ко­ торые в жидкой с р ед е дедифференцируются и образуют к ал л у с, р а с п а ­ дающийся в конечном итоге на отдельные клетки. Иногда суспензи он­ ную культуру инициируют определенным количеством г о м о ге н а та ткани, содержащего живые и разрушенные клетки.

Для получения высокодиспергированной суспензионной культуры важное значение имеет тип исходной каллус ной ткани. Оптимальной с ч и т а е т с я каллу сная ткань рыхлого типа.

Аэрация культур в жидкой среде об есп ечи вается следующими сп особами:

- выращиванием кусочков к а л л у с а на мостиках-поддержках из фильтровальной бумаги;

- культурой к ле то к, погруженных в жидкую питательную среду на к а ч а л к а х ротационного или шейкерного типа и роллерах (накопи­ тельное к у ль ти ви р о в а н и е );

- выращиванием клеток в жидкой питательной среде в к у л ь ти ва ­ торах и ферментерах путем барботажа или барботажа в сочетании с механическим перемешиванием (непрерывное культи ви рование).

Основное к оличество р а б о т, выполненных на су сп е н зи ях, по­ священо изучению их р о с т а и метаболизма в накопительной к у ль ту р е.

Р о ст клеточной популяции в цикле выращивания накопительной куль­ туры выражается Б -образной кривой» Цикл р о с т а изм еряется в р е м е ­ нем до выхода культуры в стационарную фазу» В процессе су б к ул ьти­ вирования клетки проходят последовательно следующие фазы: I ) л а ­ тентную или л а г - ф а з у ; 2)экспонеицйальную (логарифмическую) ф а зу ;

3 ) линейную ф а зу ; 4 ) стационарную ф а зу ; 5 ) фазу гибели к л е т о к.

Обычно накопительные суспензии культивируют до стационарной фазы р о с т а, что в большинстве сл у чаев с о с т а в л я е т дл ительность пассаж а.

2 1 - 2 8 дней и популяцию из 1 0 ^ - 5 ЛО^ к л е то к /м л. Концентрация к л е ­ ток в мл суспензии - плотность клеточной популяции - один из ва ж ­ нейших показателей состояния клеточной системы в су с п е н зи и. Коли­ чество клеток в миллилитре диссоциированной суспензии о п р ед е л я е т­ с я общепринятым способом - подсчетом после нанесения на с е тк у счетной камеры (Г о р я е в а или Ф у к са - Р о зен т а л я ) / 1 4 /.

Регенерация р астен ий. Получение р ас тен и й -р еген ер ан тов из культивируемых протоп ластов, клеток, тканей я в л я е т с я наиболее трудной за д а ч ей, стоящей перед экспериментатором.

При индукции о р г а н о г е н е за в культурах тканей различают две фазы этого п роцесса. Первая ф а з а - дедифференциации, в о время к о ­ торой происходит превращение специализированной клетки в к ал л у с ную. Необходимым условием для дедифференциации я в л я е т с я помещение изолированной ткани, на агаризованную или жидкую ор'-яу, содержащую элементы питания и гормональные факторы. В последующей ф а зе с*обственно дифференциации происходит формирование з а ч а т к о в ор га н о в.

Как правило, спонтанный или индуцированный морфогенез наблю­ д а е т с я у недавно введенных в культуру т к а н е й.

В большинстве сл у ­ чаев сп особн ость к ор ган оген езу т е р я е тся в ходе многократных пе­ р е с а д о к. Способность к о р ганогенезу прогрессивно уменьшается у тканей, изолированных от верхушки до основания с т е б л я. Тенденция к о р га н оге н езу снижается также при многократных п ер есад к ах к а ллу о а, причем способн ость к образованию корней с о х р а н я е т с я более длительное врем я. Растени я-регенеранты, полученные из многократно пересаживаемых тканей, обычно слабые. При длительном культивиро­ вании изменяется число хромосом, что приводит к эуплоидии и анэуплоидии, возникают разнообразные хромосомные нарушения.

Споообнооть соматических клеток растений к регенерации цело­ го растен ия я в л я е тся основой использования культуры клеток и т к а ­ ней в прикладных целях. Органогенез и р егенерация растений используютоя для клонирования ценного м атер и а л а, для получения.больших пбпуляций растений из одной генетической линии. Органоге­ нез гаплоидных клеток пыльцы или каллусов п озв ол я ет получить гаплоидные р астения / З, I I, 14, 1 9 /.

МУ1КР0КЛ0НАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ Микроклональное размножение - это м ассо вое бесполое разм но­ жение в культуре i n v i t r o, при котором получаемые р астен ия иден­ тичны исходной родительской форме.

От традиционных методов р а з ­ множения растений оно отличается рядом особенностей:

1) получением большого числа копий из минимального к оли чест­ в а исходного материала;

2 ) получением, в зависимости от целей исследования, как г е ­ нетически однородного м а тер и ал а, так и сомаклональных в а р и а н т о в ;

3 ) возможностью отбирать i n v i t r o растительный материал о интересующими и сследователя признаками;

4 ) возможностью получения безвир усного посадочного м атериал а при использовании в к а ч е с т в е эк с п л а н т а т а апикальных меристем й, при необходимости, проведении термотерапии i n v i t r o ;

5 ) возможностью в е с т и размножение растений на протяжении ц е­ лого г о д а, так как их рост и разви тие i n v i t r o практически не з а в и с я т от сезонных изменений / 3, 18, 3 3 /.

Впервые микроклональное размножение было осуществлено M o r e l в раб отах на орхидее Cymbidium / 2 8 /. Модификации этой методики в настоящее время широко используются для м ассо во го размножения ор­ хидных в коммерческих целях, а также в п ро и зв одстве у таких к у л ь ­ ту р, как картофель, земляника, гв о з д и к а.

M urashige / 2 9 / разделил в е с ь процесс микроклонального р а з ­ множения на три стадии:

1 ) инициация асептической культуры;

2 ) индукция множественных побегов при повторных п асси ровани­ ях на ср ед е для размножения;

3 ) подго товка сформировавшихся i n v i t r o растений к выоадке в п оч ву.

В целом метод микроклонального размножения основан на инду­ цированном цитокининами р азрастан и и верхушечных и пазушных мери­ ст ем, каждая из которых д а е т начало очагу п о б е г о в. После формиро­ вания о ч а га его разделяют на более мелкие группы п о б е го в, переко­ ся т на свежую ср ед у, и процесс п о в то р я етс я.

Скорость микроклонального размножения ва р ь и р у ет в зависимос­ ти от вида р астен ия, но ч асто возможно получать из единичной почки до нескольких миллионов растений в год / 1 2 /.

Основными факторами, оказывающими влияние на процеос микроклонального размножения, являются тип э к с п л а н та та, с о с т а в пита­ тельных ср ед и условия культивирования.

Исходным материалом могут служить верхушечные и пазушные ме­ ристемы с т е б л я, ’'ОЛОДЫе ли сть я, элементы соцветия и ц ве тк а, лу к о­ виц и клубнелуковиц. Идеальным материалом для получения множест­ венных побегов являются апикальные и пазушные почки здоровых и активно растущих растен ий.

В к а ч е с т в е питательных сред в большинстве случаев используют различные модификации среды Мурасиге-Скуга, хотя некоторые группы растений могут иметь индивидуальные потребности в питательных в е ­ щ ест ва х. Культуры могут р ас ти на агаризованных или на жидких пи­ тательных ср ед ах на мостиках из фильтровальной бумаги.

В зависи м ости от комбинаций условий культивирования исходной ткани ( с о с т а в питательных с р ед, тем пература, свето вой режим) мож­ но в ы з в а т ь р азви ти е пазушных почек, индуцировать появление а двен­ тивных почек или стеблевых побегов непосредственно из клеток э к с ­ п л а н т а т а или из к а л л у с а.

Для индукции множественных побегов i n v i t r o в к а ч е с т в е эк с ­ п л а н т а т а обычно используют верхушечные и пазушные почки. В то же время широкое применение нашла к ультура меристем. D odds и R o b e r t s / 1 2 / подчеркивают различие понятий "апикальная меристема" и " с т е б л е в о й а п е к с ", определяя апикальную меристему как у часток с т е б л е в о г о а п е к с а, расположенный дистально по отношению к наибо­ лее молодому листовому примордию и составляющий в среднем 80 мм в длину. Несмотря на некоторые трудности в работе (необходимость манипулирования миниатюрными эксплантатами, низкий процент выжи­ вания i n v i t r o ^ культуры апикальных меристем широко используются для с о зд а н и я р а с ти т ел ь н о го м атериала, свободного от п а т о г е н о в.

В ряде сл у чаев эффективным способом размножения i n v i t r o мржет служить соматический эм б ри оген ез, т. е. процесс формирования зародышеподобгшх стру к ту р (эм бр и ои дов), развивающихся из сомати­ ческой клетки и способных д а в а т ь начало целому растению. Сомати­ ческий эмбриогенез может быть индуцирован двумя различными путя­ ми: прямым и непрямым. В ходе прямого эмбриогенеза соматические зародыши формируются непосредственно в ткани эк с п л а н та та без про­ лиферации к а л л у с а. Сформировавшиеся таким образом растения иден­ тичны родительской форме.

Непрямой путь соматического эмбриогене­ з а с в я з а н с формированием эмбриоидов из дедифференцированных к алдусных клеток и включает следующие этапы:

I ) индукция проомбриогенной кал)тусной массы;

2 ) р азвитие эмбриоицоь из проэмбриоген них клеток;

3 ) прорастание эмбрииидов и формирование растений / 1 8 /.

Среди растений, регенерировавших путем непрямого с о м а т и ч е с ­ кого эм бриогенеза, нередко встречаются формы, отличающиеся от ис­ ходных. Возникающие таким образом сомаклоналыш е варианты могут быть использованы в дальнейшей селекционной р а б о т е.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

–  –  –

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Стерили зация р астительного материала проводится по с т а н д а р т ­ ной методике.

Вег е тативное размножение in vitro _на примере ви ногр ада Простерилизованные зеленые побеги ви ногр ада р а з р е за ю т на ч е ­ ренки длиной 3-5 мм с одной пазушной.почкой и помещают в пробирки или колбы со средой Мурасиге-Скуга* Для подавления бактери ального заражения в культуре in vitro на первом этапе культивирования можно вводить в с о с т а в питательных сред антибиотик, например, кароенициллин. Ра с твор антибиотика предварительно стерилизуют ч е ­ рез мембранный фильтр и добавляют в питательную ср е д у, охлажден­ ную до 4 0 ° (J.

Культивирование проводят на св ету при температуре 25--28°С« Черенки укореняются и дают побеги л течение 3 - 4 недель после в в е ­ дения в культуру. Полученные побеги можно размножать путем ч е р е н ­ кования и выращивать на безгормональннх ср ед ах или среп чх, с о д е р ­ жащих низкие концентрации ауксинов ( 0, 1 - 0, 2 м г/л ИУК) Ускоренное микрокдональное размножение включает несколько этапов.

1. Индукция адвентивных почек.

Верхушечные и пазушные почки простерилизованных побегов по­ мещают В колбы Эрленмейера в 5 мл жидкой питательной среды Мурао и г е - С к у г а, Уайта или Гамборга с бензиламинопурином (БАЛ) в кон­ центрации ^ - 6 м г/л и культивируют на св ету при 2 5 - 2 8 °С в течение 2 - 3 н е д ел ь. Обычно* эт о го времени достаточно для снятия апикально­ го доминирования. Начинается интенсивная пролиферация адвентивных почек.

2. Формирование п о б е г о в.

После 2 - 3 недель культивирования эксплантаты переносят на жидкую питательную среду то г о же с о с т а в а, но с пониженным с о д ер ­ жанием БАП (до 2 м г / л ). На этой среде через 1,5 - 2 недели начина­ е т с я интенсивное образование п о б его в. Пассирование на свежую с р е ­ ду проводят каждые две недели.

3. Укоренение побегов и формирование растений.

Сформировавшиеся побеги вычленяют из пролиферирующих э к с ­ п л а н та то в и пересаживают в отдельные пробирки на твердую среду Мурасигв-Скуга о низкими концентрациями ИУК ( 0, 1 - 0, 2 м г / л ) для у кор енения. Полностью сформировавшиеся растения высаживают в поч­ ву.

К у льту ра меристем В стерильных условиях под бинокулярной лупой из верхушечных почек вычленяют мериотемы величиной до I мм, о тс е к а я скальпелем примордиальные листочки. Изолированные таким образом меристемы п ер еносят на жидкую или твердую питательные среды, содержащие I г / л б а к то -т р и п т о н а ( в культуральные пробирки или чашки Петри диаметром 40 м м ). Меристемы инкубируют при 25-26°С с 12-часовым фотопериодом и интенсивностью освещения 150 лк в первый месяц культивирования и 50 0 лк на протяжении вто р о г о м есяц а. Сформиро­ вавшиеся из меристем побеги длиной до 3 см переносят в пробирки на среду для укоренения.

Соматический эмбриогенез Для успешной регенерации растений путем соматического эмбрио­ г е н е з а необходима п о сл ед о ва те л ь н а я омена следующих стадий культи­ вировани я.

I. Индукция проэмбриогенной каллусной массы.

После стерилизации растительный материал (л и с т ь я, черешки, !*• междоузлия) помещают в чашки Петри на среду М урасиге-Скуга, с о ­ держащую 2,А-Д ( 1 - 2 м г / л ) и БАП ( 6, 1 - 2 м г / л ). Культивируют в тем­ ноте при 27°С в течение 1-2 м есяцев.

2. Развитие эмбриоидов.

Образовавшийся Каллус помещают на среду того же с о с т а в а, с о ­ держащую, однако, вместо 2,А -Д нафтилуксусную кислоту (НУК) в концентрации 2 м г / л. Культивируют в темноте при 2 7 ° 0, п роизводя пассажи на свежую среду раз в месяц. При выращивании в этих у с л о ­ виях начинается формирование эмбриоидов.

3. Прорастание эмбриоидов и формирование растен ий.

Зрелые. эмбриоиды пересаживают на безгормональную среду Мура­ с и ге-С к у г а и выращивают на с в е т у, В ряде сл у чаев 'нормальное р а з ­ витие растений может быть стимулировано предварительным охлажде­ нием эмбриоидов при 4°С в течение 2 - 0 недель.

КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ

Ку;;ьт.пн1роБпн;1е in v i t r o микроспор и пальников п озволяет получать гаплоид.Jio р а щ е н и я - и гаплоидные калпусные ткани. Это явлен ие, получившее назв ание ан д р о г ен ез, п р е д ст ав л яе т большой ин­ терес для генетики и селекции, так как у гаплоидов легче выявить

•и ото б р а т ь ценные мутации, а с помощью колхицина из них можно по­ лучить диплоидные р ас тен и я. Пыльцевые зе р н а, запрограммированные на о б р а зо ва н и е г а м е т, в условиях культуры in v i t r o переключаются о частичной, синхронностью на процессы, свойственные вегетативной к л е т к е. Гаплоиды могут быть использованы в исследованиях по г е н е ­ тике сельск охозяй ственны х растений: определения взаимодействия г е н о в, определения к оли чества г е н о в, а тчкке харсктеоо их взаи м од е й с тви я.

Гаплоидные растения или кле.точные линии получены у более, чем 2 0 0 видов растений.

О получении гаплоидной ткани из пыльников и регене­ рации гаплоидных проростков впервые сообщили Guha и Maheshwari / 1 6 /. Дальнейшее р азви тие э т о т метод получил в работе супругов Нич / 3 2 /, которым удалось получить большое количество гаплоидных растений т а б а к а.

В услови ях культуры индукция р о ста микроспор и образование эмбриоидов может происходить двумя способами - прямым эмбриогене­ зом и непрямым путем - через образование каллуса и индуцирования в нем о р г а н о г е н е з а. В обоих случаях это происходит совершенно о т ­ лично от т о г о, как это осущ ествляется i n v i v o. Образование гам ет пооле 1-2 делений блокируется, в то время как в е г е т а т и в н а я к летка де л и т ся подобно з и г о т е и д а е т начало эмбрионам.

Более желателен путь* прямого а н д р о г е н е за, при котором микро­ сп ор а в е д е т с е б я подобно з и г о т е и проходит целый ряд этапов эм­ б р и о г е н е з а, вплоть до об разо ван и я на пыльнике растеньиц* В сл учае непрямого а н д р о г е н е за микроспора д а е т начало к аллусу, в котором на этой же ср ед е начинается образование эмбриоидов.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

–  –  –

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТ®

Изолированные протопласты, представляющие собой к л е т к и б е з оболочки, широко используются в физиологии, г е н е т и к е, биохимий, биофизике и вирусологии растений / 3 4 / * Для их получения применяют энзиматический метод, разработанный в лаборатории Э.К оки нга в 1960 г, / 8 /. Особую важность п риобретает использование п ро топ лас­ тов для реконструкции р ас ти тель н о го генома - в исследованиях по соматической гибридизации, по переносу субклеточных ч а с т и ц ;и ген­ ной инженерии растений / 2, V * Подобные исследования возможны., б лагодаря способности растительных протопластов в культуре,,форми­ р о в а т ь полноценные растен ия, что впервые д о казан о в 197Г г., / 3 7 / * На сегодняшний день выделение про топ ластов, их культивирование и регенерация целых растений успешно осущ ествляется для нескольких де сятк о в ви дов, относящихся, главным о б ра зо м, к о е м е й с т в у п а с л е ­ новых / 2 /.

Исходным материалом для выделения протопластов могут быть различные части растений - л и сть я, корни, семядоли, гипокотили, лепестки ц ве тк ов, пыльцевые з е р н а, а также каллусные к у льтивируе­ мые клетки / 3 5 /. Важнейшим требованием при р аб о те я в л я е тс я соблю­ дение стер ильности. Поэтому наличие асептических культур значи­ тельно упрощает опыты.

Клеточная оболочка растений п ре д ст ав л е н а главным образом целлюлозой, гемицеллюлозой и пектиновыми вещ ествам и. Поэтому для ее деградации используют ферментативные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пекти наз.

В настоящем протоколе приводится техника работы с протоплас­ тами т а б а к а и картофеля, однако экспериментальные приемы, описы-, ваемые з д е с ь, применимы при работе с другими культурами. "...,

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1. Асептические растения или каллуоные культуры.

2. Стерильная посуда и инструменты?

- чашки Петри (б см и ТО см в д и а м е т р е );

- колбы Эряенмейера (н а 50 мл);

- пастеровски е пипетки;

- колбочки со стеклянными воронками и иайлоновыми фильтрами (диаметр пор ’на фильтре - около 60 мкм).;

~ мерные пипетки или наконечники на I мл и 10 мл;

- центрифужные пробирки на 10 мл;

- мембранные фильтры фирмы " М і і і і р о г е " (США) с диаметром пор 0, 2 2 мкм или 0,4Г мкм;

- шприц с насадкой для фильтров " М і і і і р о г е " ;

- пинцеты, скальпели или ле зв и е на держ ателе.

–  –  –

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Приготовление ферментных р ас тво ров и ферментация тканей Ферментные растворы лучше готови ть непосредственно перед опытом или з а сутки до опыта. Растворы целесообразно отцентрифуг и р о в а т ь для осаждения нерастворимых частиц в течение 10-15 мин при 2 т ц с. об/мин. После доведения pH растворы при помощи шприца с насадкой фильтруют ч ер ез фильтр " м і і і і р о г е " в колбочки (по 7 - Ю мл в каждую).

Для ферментации используют, молодые ли стья та б ак а или к а р т о ­ феля. После перенесения на поверхность стерильной чашки листья нарезаю т узкими полосками или "елочкой" при помощи скальпеля ( л е з в и я ), после ч его их с р а зу же помещают на поверхность фермент­ ного р а с т в о р а. I г листовой ткани вполне до статочно для фермента­ ции в 10 мл ферментного р а с т в о р а. Ферментацию проводят в термо­ с т а т е при 2 8 - 3 0 °С в течение 1 5 - 1 8 ч а с о в.

Если нужно получить протопласты из суспензионной культуры, ее предварительно осйждают любым способом (центрифугирование или ф и л ь тр о в а н и е ), затем переносят в ферментный р ас тво р (до 2 г на 10 мл ферментного р а с т в о р а ). Каллусные ткани, растущие па а г а р е, п ер еносят в чашку с ферментной смесью при помощи ск а л ь п е л я. Дли­ те л ь н о с т ь ферментации за в и с и т от консистенции тканей, концентра­ ции ферментов, с о с т а в а ферментных р а с т в о р о в, температуры инкуба­

–  –  –

2Г Еслй ферментацию проводят в течение ночи, лучше и спользовать ме­ нее концентрированные смеси, если в течение рабочего дня - более концентрированные.

Каллуоная ткань картофеля ферментируется в тех же см е сях, что и табачные. Для ферментации сл еду ет бр ать овежий и мягкий каллуо, который ’’р ассы п ается" в ферментной смеси.

Для мезофилла картофеля можно применять см е сь, состоящую из 1$ С еН иХ узРп, 0, 5 $ Масегаве и 0, 1 $ В г 1 з е 1 а я е.

Выделение и культивирование протопластов Содержимое колбочки или чашки после инкубации фильтруют че­ рез воронку с найломовым фильтром в пустую колбочку. Остатки тка ней листа остаютоя на фильтре, в колбочке оказываются изолирован ные протопласты. Суспензию их перенооят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 3 мин при I тыо-об/мин. Жизнеспособ­ ные. протопласты всплывают на п овер хность, их можно легко с о б р ат ь пастеровской пипеткой и перенести в пробирку, до половины за п о л ­ ненную средой */-5. Центрифугируя в этой среде 1-2 мин при 700 об/мин, осаждают протопласты, отмывая их таким образом от ос татк ов ферментного р а с т в о р а. Отмывку обычно осуществляют дважды.

Осадок протопластов ресуспендируют в небольшом количестве ( 0, 5 ' мл) среды К-3 (в сл учае т а б а к а ) или среды ИБЭ (для к а р т о ф е­ л я ), после чего пипеткой аккуратно выливают на чашку Петри ( 6 - 1 0 см в ди а м е тр е), содержащую со о тв етс тве н н о 6 -1 0 мл идентич­ ной среды. Оптимальная плотность вы сева протопластов с о с т а в л я е т примерно Ю 3 клеток в I миллилитре. Плотность определяется при помощи камеры Горяева или Ф у к са-Р о зен таля.

Культивирование протопластов проводят на рассеянном св ету или в терм остате при температуре 26 ~ 2 8 0С. Качество протопластов и контроль их деления у с т а н а в л и в а е т с я при помощи инвертированно­ г о микроскопа,

• Через 10 -2 0 дней культивирования протопласты образуют коло­ нии-агрегаты клеток, соединенных между собой достаточно прочно.

Они видимы невооруженным глазом и выглядят светлыми комочками. 8 это время сл еду ет их р азб а в и т ь свежей средой в несколько р а з.

Технически это выполняют следующим образом: набирают пипеткой с широким кончиком культуру и р азн о ся т по нескольким чашкам со све жей средой. Цо истечении еще д в у х-тр ех недель культивирования колонии можно реген ерировать до целых растений.

регенерацию т а б а к а можно осуществить г.а среде ПМ ОГ\.регене­ рацию картофеля - п оследовательно на ср ед ах з е м и вн -3 * культивирование протопластов можно осущ ествлять независимо от оо~ вещения, для регенерации об язательн о нужен с в е т.

Таблица 4 Используемые среды

–  –  –

Методы культивирования клеток и протопластов растений р а з р а ­ ботаны в основном для м ассового культивирования, т. е. выращивания больших количеств клеток в общем объеме питательной среды. Между тем, п оявляется в с е больше р аб о т, где рещающую роль в у сп ехе э к с ­ перимента играет индивидуальное' культивирование или культивирова­ ние небольшого числа клеток в микрообъеме среды. Такой подход применяется для культивирования гибридных продуктов / 5 /, инъеци­ рованных протопластов / 9 /, а иногда и сп ользу ется в сочетании с методом культуры-няньки / Г З /. Культивирование небольших количеств клеток в микрообъеме питательной среды имеет и определенную с а ­ мостоятельную ценность как инструмент изучения жизнедеятельности клеток и проведения важных морфологических.наблюдений / 2 0 / ; еще более это относится к индивидуальному культивированию, В последнее время, в раб отах по слиянию протопластов р а с т е ­ ний, в с е чащр проводятся попытки добиться направленного слияния, т * е в максимального выхода бинарных гетерокарионов / б, 3 8 - 4 1 / - При этом исследователи сталкиваются с о значительными трудностями, и • Получаемые результаты часто неоднозначны / 4 1 /. Слияние п реселектированных протопластов с последующим индивидуальным культивиро­ ванием полученного про ду к та.яви лось бы элегантным и логически обоснованным завершением такого рода попыток. Эта технология, особенно эффективная при использовании электрослияния / 2 2, 4 4 /, д е л а е т ненужным поиск селективных маркеров и п озв ол я ет р а б о т а т ь о протопластами почти любых видов растений.

Первым препятствием при р азр а б о тк е методов индивидуального культивирования явилось то о б с т о я т е л ь с т в о, что протопласты и клетки растений в культуре хорошо расту т только т о г д а, к о г д а плотность их высева превышает некоторую критическую. Возможное объяснение этого состои т в том, что при низкой плотности клеток происходит избыточная диффузия в среду промежуточных продуктов их м етаболизма. Когда концентрация метаболитов в клетке у п адет ниже определенного уровня, к ле тк а может погибнуть / 1 7, цит, по 2 1 / * Таким ббразом, для успешного разви тия отдельной клетки нуж­ но сохранить тот же объем среды, который приходится на нее в мас­ совой к у льту р е. Обычно протопласты растений культивируют при плотности 10 - 10 ^/ м л. Поэтому индивидуальную культуру протоплас­ тов сл е д у е т ве сти в микрокаплях объемом 10 -Г 00 нанолитров.

Су Н '-: ТПуГ'Г и другой подход, который можно было бы использо­ И вать дл i разработки молода индивидуального культивирования. Если клетки гибнут ю - з ч избыточной диффузии промежуточных, метаболитов в питательную с р о д у, то, добавив в среду эти метаболиты, можно добиться р оста клеток при очень низкой плотности. Успех этог-о подхода был показан Као и K ic h a y lu k на протопластах и клетках V i c ia Ьн jncUui.3 / 2 1/.. 1 этом случае можно било бы обойтись без культивировании в микрокаплях i Очевидно также, что данный подход менее универсален, чем культивирование в микрокаплях, т. к. проме­ жуточные метаболиты, диффузия которых из клетки определяет успех культивирования, у протопластов разных видов растений могут, в о ­ обще го в о р я, быть разными.

Метод индивидуального культивирования протопластов и клеток растений в микрокаплях нанолитрового объема был разработан коор et- а К, / 2 з / и впоследствии ими же улучшен / 2 4 /. Состоит он в оле-* дующем: на покровное стекло наносят при помощи микропипетки, у п ­ равляемой компьютером, микрокапли 2 М р а с т в о р а сахарозы объемом Т мкл. Затем стекло силиконизируют, а са х а р о зу удаляют промывани­ ем с т е к л а в в о д е. На м еста прежнего расположения сахарозы наносят микрокапли парафинового масла ( I мкл), под которые затем вносят микрокапли питательной среды для протопластов или к леток. Объем микрокапель среды со ставл ял от 8 до 1 00 нл, в зависимости от вида культивируемых к леток. В микрокапли питательной среды вносят по I протопласту или к л е тк е. Все эти операции производят также при помощи компьютера. Скорость рассаживания с о с т а в л я л а не менее 30 протопластов в ч а с. -При культивировании в микрокаплях делилось 60 -90$ изначально посаженных клеток т а б а к а.

Нами разрабо тан метод индивидуального- культивирования, по­ зволяющий достичь примерно таких же р е зу л ь т ат о в при использовании гор а зд о более простой технологии. Для протопластов т а б ак а с к о ­ рость рассаживания по микрокаплям с о с т а в л я е т 5 0-1 0 0 протопластов в ч ао, эффективность деления 7 0 - 8 0 $.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1. Оборудование и реактивы для ведения культуры протопластов по стандартным методикам.

2. Материалы, оборудование и.реактивы для индивидуального культивирования:

- ламинарный бокс (у с т а н о в к а обеспыливания УО-БГ или ан ало­ гичный;

- инвертированный микроскоп;

- манипулятор Фонбрюнна (и з комплекта микроманипуляторов КМ-2);

- прибор для вытягивания капилляров ПВК-1;

- микрокузница МЭ-^;

- микроаппликатор;.

- стеклянные трубки и тефлоновый шланг различного диаметра, держатели каппиляров’ из комплекта КМ-2;

- парафиновое или вазелиновое масло.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

При подготовке опытов особое внимание сл еду ет обратить на чистоту посуды и р е а к ти в о в. Все среды желательно профильтровать, чтобы удалить мелкие частички, могущие за с о р и ть микропипетку. Для соблюдения стерильности работы нужно проводить в ламинарном бо к се, куда помещается воя у с т а н о в к а.

I. Подготовительные операции

Выделение п р о то п л а ст о в. Проводится по стандартным методикам.

Изготовление микропипеток. На микрокузнице МЭ-4 тонкостенные капилляры диаметром 1,5 мм вытягивают до диаметра около 100 мкм.

Кончик микропипетки изгибают. Капилляры вытягивают из стеклянной трубки на приборе ПВК-1.

Приготовление м а с л а. Парафиновое или вазелиновое масло з а л и ­ вают в делительной воронке деионизированной водой (проводимость не выше 0, 3 микросименс) в соотношении I : I — х 2 • Воронку в с т р я х и ­ I вают до получения тонкой эмульсии и оставляют в вертикальном поло кенйи для отстаивания. Воду, собравшуюся вн изу, сливают. Процеду­ ру повторяют 5 р а з. Затем масло центрифугируют для удаления м ель­ чайших капелек воды (1 2 0 мин при 20 тыс.об/мин на роторе вц-27 ), Масло отбирают, стерилизуют 2 ч а с а при 1 20 °С. После охлаждения в насЛо стерильно добавляют 0, 1 - 0, 2 объема среды для культивирова­ ния. Сосуд о маслом и средой встряхивают для получения суспензии.

Пооле отстаивания можно добавить 1*2% стерильного активированного у г л я. Приготовленное таким образом масло можно хранить в хол о­ дильнике при *»°С в течение м есяца.

Подготовка камеры для индивидуального культивирования. Чаш­ ку Петри перед самым опытом заполняют приготовленным маслом на 3-4 мм высоты. В чашку вносят каплю среды для культивирования и каплю суспензии п ротоп ластов. Объем капель не должен превышать 100 мкл, чтобы они не выступали над поверхностью м а сла. Камеру закрепляют в препаратоводителе инвертированного микроскопа.

2. Основные операции

Стерильная (1 4 0 °С, 2 ч) микропипетка у с та н а в л и в а етс я в д е р ­ жатель из комплекта КМ-2, закрепленный на головке манипулятора Фонбрюнна. Держатель и примыкающую часть микропипетки протирают 70# -ным этиловым спиртом. Микропипетку вводят в поле зрения мик­ роскопа. Затем заполняют микропипетку маслом из камеры, а попав­ ший при этом в шланги во зду х стравливают через краник.

После этого в микропипетку набирают 1 0 - 2 0 мкл среды из капли под маслом и при помощи микроаппликатора или шприца на 2 0 мкл на дно камеры наносят микрокапли.

Объем микрокапель определяют по формуле для объема полусферы:

V=- 2й5, 3 ^ __ где й - радиус микрокапли, а V - ее объем. Отсюда # Т ак, для капли объемом 10 нл диаметр равен 342 мкм. Чтобы придать микрокаплям форму полусферы, лишнюю среду отсасывают микропипет­ кой.

Рассаживание протопластов по каплям. Передвигая масляную к а­ меру при'помощи препаратоводителя, приподнятую микропипетку в в о ­ дят в каплю с суспензией п ротопластов. Микропипетку размещают над выбранным протопластом, обдувают его средой и засасывают, исполь­ зу я микроаппликатор или шприц на 20 мкл. Для ускорения работы можно набирать в микропипетку до ГО протоп ластов. После этого микропипетку приподнимают и выводят из капли с суспензи ей.

При помощи препаратоводителя в поле зрения микроскопа вводят микрокаплю, размещают над ней микропипетку с протопластом и опус­ кают ее до соприкосновения с мениском. С помощью микроаппликатора протопласт выпускают в микрокаплю и отбирают из нее избыток с р е ­ ды. Все вышеописанные операции выполняются при 100-кратном увели­ чении микроскопа.

Примерно раз в неделю микроколониям нужно менять среду. Для •27 э т о г о микропипетку заполняют маслом, как описано наше; в камеру вн осят каплю свежей среди (если ее с о с т а в отличается от и с п о л ь зу ­ емой в н а ч а л е ). Часть старой среди из микрокапель забирают в микро пипетку и сливают в каплю со старой средой или в каплю с сусгкзиэией* После микропипетку заполняют свежей средой и доливают микрокапли*

СЕЛЕКЦИЯ МУТАНТОВ В КУЛЬТУРЕ

Успехи, достигнутые в области культивирования растительных клеток, открыли новые потенциальные возможности использования культивируемого растительного материала для решения многих фунда­ ментальных вопросов экспериментального м у т а г е н е з а и селекции но­ вых форм растений. Основными преимуществами работы с клеточными культурами я в л я е тс я возможность манипулирования с большими выбор­ ками клеток, направленная селекция I n v i t r o редких вариантов и регенерация из них растений. Классические работы ПоМалиги с с о т ­ рудниками / 2 6, 2 7 / по получению через культуру ткани отрептомицинустойчивых растений таб ак а и изучению трансмиссии данного при­ з н а к а в потомстве явились убедительным подтверждением эффектив­ ности нового подхода в селекции м утантов.

Исходным материалом для м у та г е н е за и селекции могут быть каллусные и суспензионные культуры, изолированные протопласты, соматические или андрогенные эмбриоиды, сегменты листьев и мери­ стем, семена и пр.

В опытах на растениях накоплены обширные сведения о мутаген­ ной активности различных химических соединений и физических фак­ торов. При работе с клеточными культурами необходимым этапом ис­ следований по м у тагенезу i n v i t r o яв ляе тся выяснение влияния различных доз на выживаемость к леток.

Из химических мутагенов чаще в с е г о используют этилметаноульфонат (ЭМС), нитрозогуанидин (Н Г), нитрозоэтилмочевину (НЭМ) Применяются и физические методы - гамма- и УФ-излучения.

Во многих случаях для получения мутантов i n v i t r o обработка мутагенами не о б я за т е л ь н а. У культивируемых клеток ч а с т о т а в о з ­ никновения спонтанных мутантов равна. 10“ **-10“ ®. Для оценки эффек­ тивности м у т а г е н е за часто используют полезную ч ас тоту мутаций, которую определяют как отношение к оличества мутантных клонов к общему количеству высеянных клеток / 4 2 /.

К настоящему времени наиболее весомые результаты по индуци­ рованному м утагенезу в культуре были получены на таких модельных об ъ ек тах, как N i c o t i a n a t a b a c u m, N. s y l v e s t r i a, N. p l u r a b a g i n i f o lia, D a t u r a i n n o x i a, P e t u n i a h y b r i d a, Hyoscyamus m u t i c u s / 4, 7, 25, 3 1 /. Основными требованиями, предъявляемыми к модельным объектам, я в л я ю т ся быстрый р ост в культуре, сохранение реген ер ацииннии способности, небольшое число хромосом, наличие высокоэф­ фективной методики выделения и культивирования п ротопластов, с у ­ ществование истинных гаплоидов, наличие генетической карты, к о­ роткий жизненный цикл растений.

Для отбора мутантов используют следующие приемы:

1. Прямую или позитивную селекцию, при которой выживают лишь мутантные клетки определенного типа.

2. Непрямую (негативную) селекцию, основанную на и зби ратель­ ной гибели делящихся клеток дикого типа и выживании метаболичес­ ки неактивных клеток; при этом требуется идентификация мутацион­ ных изменений.

3. Тотальную селекцию, при которой индивидуально тестируют­ ся в с е клеточные клоны.

Визуальную селекцию и неселективный отбор, к огда вар иант­ ная линия может быть идентифицирована среди популяции ви зуально или при использовании биохимических методов.

Наибольшее количество работ по м утагенезу в культуре посвя­ щено индукции мутаций устойчивости к антибиотикам и другим инги­ биторам метаболизма, а также мутаций хлорофиллдефектности. Поэ­ тому мы остановимся на примерах получения именно таких мутантов, хотя технические приемы, применяемые з д е с ь, достаточно универ­ сальны.

Селекция мутантов на уровне клеточных колоний.

В первых исследованиях по клеточной селекции мутантов у с т о й ­ чивости к антибиотикам целью работ было получение цитоплазмати­ ческих м утантов, для чего была предложена простая, но удачная схем а селекции / 2 6, 2 7 /. Исходным материалом служит ткань Ni.ccапа ЬаЬасит, полученная из мезофилла л и ста. Селекцию проводят на среде М8, содержащей 2 м г /л ИУК и 0,3 м г/л БАП. Среда допол­ няется 0,5 мг/мл стрептомицин-сульфата. Данная концентрация анти­ биотика в среде ингибирует позеленение ткани, но не подавляет (или частично п одавляет) р о с т. Способность клеток делиться на селективных средах (к тому же в присутствии мутагенного фактора, если учитывать, что многие антибиотики, в том числе и стрептоми­ цин, обладают мутагенным эффектом) приобретает особое значение для отбора цитоплазматических м утантов. Участки каллуса с м у тант­ ными клетками обнаруживаются по их зеленой о к р а ск е. Островки з е ­ леных тканей отделяют от остальной массы, размножают на этих же ср ед ах; проверяя тем самым их на у сто й ч и в ость, и затем регенери­ руют на среде без антибиотика до целых растений. Впоследствии растения целесообразно поддерживать на среде с антибиотиком для предотвращения химеризации.

Метод отбора мутантных клеточных линий по их способности к фотосинтезу на селективной среде лежит в основе многих приемов селекции и я в л яе тся довольно эффективным при селекции цитоплазма­ тических мутантов.

Эффективная селекция цитоплазматических мутантов устойчи­ вости к антибиотикам п оказана при использовании в кач е ств е исход­ ного м атериала для м у т а г е н е за изолированных протопластов. Этот прием успешно использован для получения линкомицинустойчивых му­ тантов N. р1итЬаб1п1ГоИа / Г О /. Он состои т в следующем.

Изолированные мезофильные протопласты обрабатываются 0, 1 или 0,3 мМ НЭМ в течение 20 -3 0 мин, отмываются дважды от м утагена и культивируются на обычной для данного вида протопластов ср е д е.

Через 5 - 6 недель культивирования клеточные колонии заплавляютоя в селективную агаризованкую среду мв, содержащую I мг/л БАЛ,.

0,1 м г/л НУК и Г мг/мл линкомицингидрохлорида. Отбор устойчивых клонов основан на их способности ф отосинтезировать в присутствии антибиотика. Чувствительные к антибиотику колонии в этих условиях формируют белую каллусную тк ань. Регенерацию растений из устойчи­ вых клонов, которые иногда возникают и без мутагенной обработки, проводят на той же среде без антибиотика.

Сочетание нескольких методов селекции____ Эффективный прием селекции цитоплазматических мутантов пред­ ложен Р.Флюхром / 1 5 /. Использовали семена N. taЪacum, обработан­ ные нитрозометилмочевиной (НММ). Обработку семян проводили 5 мМ М М (1 0 0 мл сток ово го р а с т в о р а Н М готовили на 70% этаноле о 1% М М уксусной кислотой) в течение 2 часов^ при комнатной температуре, после ч его их стерилизовали и высаживали для проращивания на с т е ­ рильные среды с селективными концентрациями антибиотиков ( I мг/мл стрептомицина, 0,5 мг/мл спектиномицина, 0,5 мг/мл.линкомицина, 0, 4 мг/мл хлорамфеникола). Проростки на селективных средах о б ес­ цвечивались, но при небольшом увеличении у первых семядольных ли стьев можно было видеть небольшие зеленые участки, содержащие потенциально мутантные клетки. Сегменты семядольных листочков с зелеными зонами высаживали на среду для регенерации с антибиоти­ ком. Зеленые (устойчивые) и пестролистные (химерные) регенеранты высаживали в почву и изучали ( а также расхимеривали) в половых к р о с с а х. Семена второ го поколения на селективных ср ед ах давали большое количество истинных м утан тов.

Селекция на уровне вторичных п об егов, возникающих из пазушных почек культивируемых in v i t r o растений Побеги растущих in v i t r o растений обрабатываю т 3 мМ Н М в М течение 2 ч асов и черенки с единичными пазушными почками высажи­ ваю т на среду с 0,5 мг/мл стрептом ицинсульф ата, на которой наблю­ д а е т с я замедленное образование обесцвеченных п о б его в. При такой обработке мутагеном эффективность образования побегов с о с т а в л я е т около 7 0 #, остальные черенки погибают* На сред е оо стрептомици­ ном из пазушных почек наблю дается формирование пестролистных по­ б е го в о чаототой 2 * 1 0 * ^. Оообого внимания заслуживают р езу л ьтаты, полученные при скрининге на ср ед е о антибиотиком вторичных побе­ г о в, к о гд а для тести рования выоаживаютоя черенки растен ий, вы­ росших на обычной ореде из обработанных мутагеном почек ( т. е.

второ е в е гет ат и в н о е п о то м с тв о ). В данном случае пестролистные побеги Возникают о более высокой ч астотой ( 3, 5 ' I C f 2 ).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

–  –  –

Принципы и методы выращивания изолированных клеток и тканей растений





Похожие работы:

«КИРИЛЛ АЛЕКСЕЕВ О ГРУППОВОЙ ТЕРАПИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ МЕЖЛИЧНОСТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Межличностная групповая терапия. Подход И. Ялома Принципы работы группы Задачи ведущего группы Четыре преимущества групповой терапии 1....»

«Содержание Содержание разделов программы стр 1. Целевой раздел 3 1.1 Пояснительная записка 3 1.2 Цели и задачи реализации программы 4 1.3 Принципы и подходы к реализации программы 5 1.4 Значимые характеристики и особенностей развития детей 8 старшей группы компенсирующей н...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОЦИАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» УТВЕРЖДАЮ И.о. проректора по научной работе А.Н.Малолетко ПРОГРАММА ГОСУДАРСТВЕННОГО ЭКЗАМЕНА Код по ОКСО Наименование направления подготовки Квалификация (степень) (ОП), профиль вы...»

«СОДЕРЖАНИЕ 1. Пояснительная записка.2. Учебно – тематическое планирование.3. Содержание тем учебного курса.4. Контроль уровня обученности.5. Требования к уровню обученности.6. Календарно – тематическое планирование.7. Литература и...»

««Гимнастика для глаз, и ее значение в жизни ребенка» Подготовила Кубарева Л.Г. г. Старый Оскол Острота зрения во многом зависит от общего здоровья ребенка, поэтому общеукрепляющие игры на открытом воздухе, катания на лыжах, коньках, велосипеде, плавание полезны и для глаз. Однако, все чаще даже у здоровых детей зрение...»

«Хадисы Сахих Муслим Об устрашении в адрес измышляющих ложь о Посланнике Аллаха, 1. Али, пусть будет доволен им Аллах, произнося проповедь, говорил: Посланник Аллаха, произнес: Не говорите лжи обо мне, потому что тот, кто лжет обо мне входит в Огон...»

«Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Рабочая программа учебного курса «Окружающий мир» разработана в соответствии с Положением о сроках и порядке разработки, рассмотрения и утверждения рабочих программ учебных курсов и дисциплин, програ...»

«10 класс Наименование видов работы 1 четверть 2 четверть 3 четверть 4 четверть (количество) (количество) (количество) (количество) Текущий контроль 1 1 1 Итоговой контроль 1 1. Пояснительная записка Примерная рабочая программа по праву составлена на основе Федерального компо...»

«КВИР ИССЛЕДОВАНИЯ Минск Бишкек, 2014 Этот Зин появился в результате образовательной программы КВИР-ИССЛЕДОВАНИЯ Р по квир-исследованиям, которую активистки беларуских инициатив А Б «Гендерный маршрут» и «Быть.Квир» провели в Бишкеке во время резиденции в ШТАБЕ (Школе теории и активизма-...»

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ НАУК О МАТЕРИАЛАХ МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЛОЩАДИ ПОВЕРХНОСТИ И ПОРИСТОСТИ МАТЕРИАЛОВ МЕТОДОМ СОРБЦИИ ГАЗОВ А.С. Вячеславов, М. Ефремова Москва 2011 Содержание 1. Основы метода 1.1 Явление сорбции 1.2 Изотермы адсорбции десорбции 1.3 Теории сорбции г...»

«КОЗАРЕНКО В.А. УЧЕБНИК МНЕМОТЕХНИКИ СИСТЕМА ЗАПОМИНАНИЯ «ДЖОРДАНО» Сайт Mnemonikon (http://www.mnemotexnika.narod.ru) Москва, 2007 Глава 1 Вводные статьи 1.1 Система запоминания «Джордано» Добро пожаловать в систему запоминания «Джордано», созданную в 1990 году. Это са...»

«Лекция №1 Понятие информации Учебные вопросы: 1. Возникновение и развитие теории информации 2. Понятие информации и этапы ее обращения Теория информации является одним из курсов при подготовке инженеров, специализирующихся в области автоматизированных систем управления и обработки информации. Функционирование таких сис...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.