WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений..4 Введение..5 1. Обзор литературы..7 1.1. Объекты исследования..7 1.1.1. Бактерии Thioalkalivibrio versutus.7 1.1.2. Везикулы и ...»

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений………………………………………………………………..4

Введение……………………………………………………………………………5

1. Обзор литературы……………………………………………….………....7

1.1. Объекты исследования……………………………………...….…..7

1.1.1. Бактерии Thioalkalivibrio versutus…………………………….7

1.1.2. Везикулы и протеолипосомы…………………………...…9

1.2. Биотехнологическое значение алкалофильных

микроорганизмов……………………………………………...….10

Na+–транспортирующая дыхательная цепь…………

1.3.

1.4. Цитохром-с-оксидаза cbb3-типа…………………………………....17

1.5. Трансмембранный потенциал…………….……………………...25 1.5.1. Ионный транспорт……………………….………………25 1.5.2. Проникающие ионы……………………………………..28

2. Использованные биологические материалы и химические реактивы….31

3. Методы………………………………………………….………………....33

3.1. Препаративные методы…………………………………………….33 3.1.1. Подготовка клеточной суспензии к экспериментам….....33 3.1.2. Получение везикул с помощью ультразвука……..……...33 3.1.3. Выделение и частичная очистка терминальной оксидазы cbb3-типа. Экстракция белков детергентом………………34 3.1.4. Фракционирование экстракта мембранных белков сульфатом аммония………………………………………35 3.1.5. Ионообменная хроматография белковых препаратов….35 3.1.6. Обессоливание и концентрирование белковых препаратов………………………………………………...36 3.1.7. Приготовление протеолипосом…………………………36 3.1.8. Методы проекта очистки фермента…………………………37 3.1.8.1. Очистка антител………………………………….37 3.1.8.2. Иммуноаффинная хроматография……………....38 3.1.8.3. Аффинная хроматография на Ni2+-агарозе……..39



3.2. Аналитические методы…….………………………………………..40 3.2.1. Биуретовый метод определения концентрации белка…..40 3.2.2. Микроскопирование (подсчет клеток) в камере Горяева……………………………………………………41 3.2.3. Определение внутреннего объема суспензии клеток…...41 3.2.4. Оценка клеточного белка по светорассеянию суспензии клеток……………………………………………………...41 3.2.5. Измерение трансмембранного потенциала клеток посредством ТФФ+-селективного электрода…………….42 3.2.6. Регистрация трансмембранного потенциала клеток при помощи сафранина………………………………………42 3.2.7. Регистрация мембранного потенциала в суспензии везикул…………………………………………..………...43 3.2.8. Определение дыхательной активности………………......44 3.2.9. Электрофорез в денатурирующих условиях………….....45 3.2.10. Окрашивание белков в ПААГ…………………………....46 3.2.11. Измерение pH внутри клеток……………………………46

4. Результаты и обсуждение………………………………………….……...47

4.1. Определение внутреннего объема клеточной суспензии…….....47

4.2. Измерение мембранного потенциала на клетках………………..51

4.3. Измерение внутриклеточного рН и расчет протондвижущей силы……………………………………………………………….55

4.4. Регистрация мембранного потенциала на везикулах……………57

4.5. Очистка оксидазы и получение протеолипосом………………...61

4.6. Проект очистки оксидазы………………………………………...68 Выводы……………………………………………………………………………73 Литература……….………………………………………………………………..74 Экономика……………………………………………………………………........80 Охрана труда……………………………………………………………………....87

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

µН+ - электрохимический градиент протонов на мембране;

µI - электрохимический градиент ионов на мембране;

– трансмембранная разность электрических потенциалов;

рН – градиент протонного показателя;

pHВТ – рН внутри клетки;

pHСН – рН снаружи клетки;

ПСА – персульфат аммония;

ДМ – додецилмальтозид;

СА – сульфат аммония;

ОГ – октилглюкозид;

ПААГ – полиакриламидный гель;

ДТТ – дитиотреитол;

БСА бычий сывороточный альбумин.

ВВЕДЕНИЕ Объектом настоящего исследования послужили штаммы AL2 и ALJ15 вида Thioalkalivibrio versutus с оптимумом роста при рН 9,5-10. Это новый вид экстремально алкалофильных хемолитотрофных солеустойчивых (до 2 М Na+) сероокисляющих бактерий, обнаруженный в щелочных содовых озерах юговосточной Сибири (республика Тува). Филогенетические исследования показали, что представители облигатно аэробных бактерий рода Thioalkalivibrio имеют отдаленное родство только с анаэробными пурпурными сероокисляющими бактериями родов Ectothiorhodospira и Chromatia; и, повидимому, представляют собой отдельную ветвь эволюции. Такие микроорганизмы, малоизученные в настоящее время в отношении механизмов запасания энергии, могут быть объектом поиска новых ферментных комплексов дыхательной цепи, использующих не протонный "митчеловский" тип сопряжения энергии, а натриевый.

В предшествовавших данной работе исследованиях в нашей рабочей группе было изучено строение оксидазы cbb3-типа из Tv. versutus, расшифрован оперон, кодирующий данный фермент, и доказана его экспрессия in vivo и in vitro. Также были идентифицированы 4 субъединицы, составляющие оксидазу, определены их молекулярные массы, и установлено количество гемов С в каждой.

Целью настоящей работы было дать характеристику энергозапасающей системы объектов и для этого измерить в клетках мембранный потенциал (), внутренний рН и вычислить протондвижущую силу, а также изучить генерацию электрического потенциала суббактериальными мембранными частицами, полученными с помощью ультразвука. Для доказательства генерации потенциала оксидазой провести ее выделение и очистку с последующей реконструкцией в липосомы и измерением потенциала на их мембране.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Оценить внутренний объем клеток на мг клеточного белка штаммов AL2 и ALJ15 Tv. versutus.

2) Измерить мембранный потенциал, генерируемый клетками в суспензии, с помощью ТФФ+-селективного электрода и рассчитать его численное значение.

3) Измерить внутренний рН клеток и рассчитать протондвижущую силу.

4) Получить везикулы из клеток бактерии Tv. versutus.

5) Исследовать генерацию потенциала на мембране везикул с помощью проникающих ионов: катионов сафранина O и ТФФ+, и аниона – оксонола VI.

6) Выделить и очистить оксидазу cbb3-типа из Tv. versutus AL2.

7) Реконструировать очищенный фермент в протеолипосомы.

8) Исследовать генерацию потенциала на мембране протеолипосом с помощью ТФФ+-селективного электрода.

9) Разработать проект эффективной очистки оксидазы cbb3-типа.

Экспериментальная база исследования:

Отдел биоэнергетики научно-исследовательского института ФизикоХимической Биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

–  –  –

Недавно выделен и описан новый ранее неизвестный род облигатно хемолитоавтотрофных сероокисляющих галотолерантных алкалофильных микроорганизмов Thioalkalivibrio. Бактерии выделены из высокощелочных содовых озер Юго-Восточной Сибири (Республика Тува) и Кении. Они отличаются от всех известных серобактерий способностью расти и окислять восстановленные серные соединения при рН = 10 и выше. Новый род

–  –  –

представитель), Thioalkalivibrio denitrificans и Thioalkalivibrio nitratus.

Филогенетические анализы позволяют отнести этот род к -Proteobacteria, где они

–  –  –

сероокисляющими бактериями рода Ectothiorhodospira. Такое объединение неслучайно. Некоторые виды Ectothiorhodospira преобладают среди популяций анаэробных фототрофов в содовых озерах, и установлено фенотипическое сходство между представителями родов Ectothiorhodospira и Thioalkalivibrio, включая

–  –  –

сульфидокисляющих анаэробов.

В нашем исследовании использован штамм Tv. versutus AL2. Клетки бактерии в форме полиморфных палочек с одним полярным жгутиком.

Выделен штамм с поверхности дна содового озера в Сибири.

Исследование дыхательной активности мембранных частиц культуры (Грищук и др., 2003) дало следующие результаты: зона оптимума дыхательной активности лежит в области 9,5. Спектральный анализ мембранных частиц свидетельствует о наличии цитохромов c- и b- или о- типов. Работы протонной помпы на терминальном участке этой дыхательной цепи не обнаружено.

Обнаружено защелачивание в присутствии 2 мкМ протонофора-разобщителя СССР со стехиометрией –0,3 Н+/е-, что трактовалось как химическое поглощение протона при восстановлении кислорода до воды. Для мембран

–  –  –

В естественном биологическом объекте всегда единовременно действуют множество путей метаболизма. В том числе, исследуемый параметр или свойство может быть обусловлено сразу несколькими происходящими процессами. Чтобы исключить или существенно уменьшить вклад побочных процессов в исследуемое свойство используется метод создания искусственных условий или объектов, предполагающих вклад только одного исследуемого процесса в изучаемый параметр.





Мембранные везикулы представляют собой цитоплазматические мембраны, собранные вновь после разрушения клеток и освобождения их от содержимого цитоплазмы. При таком способе получения мембрана может замкнуться как с исходным расположением внутреннего и внешнего липидных слоев и положением мембранных белков (правильновывернутые везикулы), так и с обращенным их расположением (обратновывернутые везикулы). В обычно приготовленной суспензии везикул присутствуют одновременно оба типа ориентации, поскольку образование мембранных пузырьков носит вероятностный характер.

Липосомы представляют собой замкнутый билипидный слой (мембрану) в форме пузырька. Липид обычно имеет искусственную природу. В такие пузырьки удобно встраивать мембранные белки для изучения их свойств.

Встраивание разумно производить из расчета одной молекулы белка на липосому.

1.2. Биотехнологическое значение алкалофильных микроорганизмов Биотехнологическое значение алкалофильных микроорганизмов определяется, в первую очередь, широким применением выделяемых из них щелочеустойчивых ферментов. Более 30% всех производимых в мире ферментов получены из клеток алкалофильных микроорганизмов.

Щелочеустойчивые ферменты широко используются в пищевой, фармацевтической промышленности, в качестве добавок к детергентам, моющим порошкам, а также в ряде различных биотехнологических схем.

Среди ферментов, выделяемых из алкалофильных микроорганизмов, наиболее часто используются щелочные целлюлазы, щелочные протеазы и щелочные амилазы, которые находят применение в качестве добавок к детергентам и моющим средствам. Они производятся в промышленном масштабе (Horikoshi, 1999). Таким образом, задачей биотехнологии является и получение продуцентов щелочных ферментов с необходимыми свойствами.

Щелочная протеаза находит применение в биотехнологической схеме удаления желатинового слоя рентгеновской пленки при реутилизации серебра.

С помощью щелочного фермента цикломальтодекстрин глюканотрансферазы осуществляется промышленное производство циклодекстрина, широко используемого в пищевой и фармацевтической промышленности в качестве эмульгатора, стабилизатора антибиотиков и витаминов.

Денитрифицирующие галоалкалофильные бактерии, выделенные в последние годы из содовых озер, имеют определенные перспективы использования в биотехнологии благодаря их высокой денитрифицирующей способности, широкому спектру используемых источников углерода и рН среды, устойчивости к засолению и другим свойствам. Эти микроорганизмы, по-видимому, могут быть использованы при очистке от нитратов засоленных щелочных сточных вод. В качестве примера можно привести денитрифицирующую галоалкалофильную бактерию Hahmonas campisalis, выделенную из воды щелочного озера в штате Калифорния (США). По мнению авторов работы, применение этой бактерии перспективно для удаления нитратов, образующихся при регенерации ионообменной смолы на заводах по очистке солей.

Объекты настоящего исследования – бактерии рода Thioalkalivibrio обладают сероокисляющей способностью. Исследования Д.Ю. Сорокина (Sorokin et al., 2005) показали активность в отношении различных серосодержащих субстратов. Весьма интересной является способность к метаболизму полисульфидов.

–  –  –

С другой стороны, разнообразные по составу алкалофильные микробные сообщества, включающие представителей основных трофических групп и главных ветвей филогенетического дерева прокариот, являются, по мнению некоторых ученых, возможным центром происхождения наземной микрофлоры. Поэтому комплексные исследования алкалофильных сообществ интересны и важны в рамках проверки этой гипотезы.

Кроме того, алкалофилы перспективны для фундаментальных микробиологических исследований, поскольку играют важную роль, обитая в экстремальной природной среде, занимая уникальную экологическую нишу. И, наконец, алкалофильные микроорганизмы представляют большой интерес для биоэнергетики, привлекая уникальностью своих энергосопрягающих систем.

Щелочелюбивые организмы развиваются при исключительно низкой концентрации протонов в среде, в связи с чем в настоящее время остается неясным, могут ли эти организмы использовать протонный цикл в своей энергетике, и отличается ли их энергетика от энергетики нейтрофилов.

Согласно гипотезе натриевого цикла В.П. Скулачева роль сопрягающего иона у таких бактерий играет Na+, а не H+, как у нейтрофилов (Скулачев, 1989).

Способность запасать энергию в виде градиента Na+ на мембране известна у морских щелочелюбивых и анаэробных бактерий. Показана возможность использования ионов Na+ первым комплексом дыхательной цепи и F0F1АТФазой, декарбоксилазами, метилтрансферазами, пирофосфатазами некоторых микроорганизмов.

1.3. Na+–транспортирующая дыхательная цепь

Активация ионами Na+ первого комплекса дыхательной цепи – НАДНоксидазы - впервые была показана в 1977 г. Т. Унемото и сотрудниками на морской щелочеустойчивой бактерии Vibrio alginolyticus и умеренно галофильной Vibrio costicola. Дальнейшие исследования той же группы ученых выявили, что Na+-зависимая стадия локализована между НАДН-дегидрогеназой и менахиноном или убихиноном, в то время как цитохромный сегмент цепи был активен без натрия. В 1982 г. Х. Токуда и Т. Унемото продемонстрировали сопряженный с дыханием электрогенный выброс Na+ из клеток V. alginolyticus.

Позднее Na+-транспортирующую НАДН-мена(уби)хинонредуктазу удалось выделить и встроить в протеолипосомы. Окисление НАДН протеолипосомами сопровождалось накоплением в них ионов натрия, а исключение ионов натрия из среды инкубации тормозило скорость окисления НАДН в 15 раз.

Относительно V. costicola было показано, что в мембранах этого вибриона сосуществуют и Na+-, и Н+-транслоцирующие дыхательные цепи. Вывернутые субклеточные пузырьки V. costicola окисляли НАДН с образованием Na+, а окисление сукцината в тех же условиях генерировало Н+.

Na+-транспортирующая По данным Т. Унемото, НАДНмена(уби)хинонредуктаза состоит из двух мономеров, каждый из которых имеет три субъединицы: (52 кДа), (46 кДа), (32 кДа). Соответствующие гены находятся, по-видимому, в большей из двух плазмид, обнаруженных у V.

alginolyticus. Проведенный анализ сравнения всех имеющихся последовательностей бактериальных геномов позволил идентифицировать гены, гомологичные кодирующим НАДН-оксидазу V. alginolyticus, среди огромного разнообразия бактерий. В этом списке оказались другие представители рода Vibrio, Escherichia coli и такие патогены, как V. harveyi, V.

cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Shewanella putrefaciens, Pseudomonas aeruginosa, Porphiromonas gingivalis, Haemophilus influenzae, Clamydia trachomatis.

Оказалось, что этот фермент закодирован даже в геноме Buchnera sp. штамм APS

– бактерии, обладающей одним из наименьших среди известных бактериальных геномов. Несмотря на то, что в большинстве случаев, Na+транспортирующая НАДН-мена(уби)хинонредуктаза обнаруживается у аэробных бактерий, кодирующие ее гены выявлены и в геноме некоторых облигатных анаэробов (например, Thermotoga maritima). Это объясняется способностью фермента катализировать обратный транспорт электронов от хинона на НАД+(Hase et al., 2001).

Было обнаружено, что выброс Na+ осуществляется и на четвертом участке дыхательной цепи алкало- и галотолерантной бактерии Bacillus sp. FTU. Bacillus sp. FTU содержит оксидазы двух типов: цитохромоксидазу caa3- и оксидазу bbтипа, спектрально напоминающую оксидазу bo-типа E.coli. Проведенные исследования показали, что выделяемые первоначально по физиологическому принципу две группы терминальных оксидаз представляют собой два семейства со сходными структурно-функциональными свойствами (Мунтян и др., 1997).

Одно из них включает оксидазы - протонные генераторы энергии в биомембранах, другое объединяет оксидазы непротонного типа. Для первого характерно наличие в структуре гемов, содержащих фарнезильные заместители (т.е. гемы А- или О-типов), и ионов меди. Они более чувствительны к цианиду, чем оксидазы непротонного типа, преобладают на начальных стадиях роста бактериальных культур и характеризуются медленной реассоциацией с СО. В составе молекул оксидаз непротонного типа отсутствуют ионы меди, а содержащиеся гемы (В- и D-типов) не имеют фарнезильных заместителей. Эти оксидазы более устойчивы к цианиду по сравнению с протонными оксидазами, преобладают в конце ростового цикла бактериальных культур, с высокой скоростью рекомбинируют с СО. Экспериментальные данные, полученные в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского в 2000-2001 гг., свидетельствуют, что оксидаза caa3-типа бактерии Bacillus sp. FTU является протонной помпой с показателем эффективности выброса протона Н+/е- равным 1. Оксидаза bb-типа, напротив, не выбрасывает протон. Теоретически существует возможность, что эта оксидаза могла бы выполнять роль Na+-насоса, а уже полученные данные не противоречат этому предположению.

В литературе имеются указания, что bo-оксидаза бактерии Vitreoscilla может функционировать в качестве Na+-насоса. В мембранах бактерии было показано наличие терминальных оксидаз bo- и bd-типа, причем хинолоксидаза bo-типа имеет сходство с цитохромом bo E. coli. Однако обнаружено, что из двух оксидаз только оксидаза bo-типа активируется ионами Na+, что позволяет предполагать ее участие в активном выбросе Na+ из клетки (Park et al., 1996).

Рис. 1. Протонный и натриевый циклы в энергетике бактерий

Первичными Na+-насосами могут выступать и другие ферменты дыхательной цепи. Процесс декарбоксилирования сопровождается выделением энергии, запасаемой в форме градиента ионов Na+ на мембране. Было показано, что дикарбоксилат декарбоксилазы, например, в процессе разложения оксалоацетата у анаэробной Propionigenium modestum, переносят натрий через мембрану из цитоплазмы в межклеточное пространство (Hase et al., 2001).

Кроме оксалоацетата был показан аналогичный активный транспорт натрия у малоната, метилмалонил кофермента А и глутаконил-CoA. Na+-градиент, возникающий при декарбоксилировании, оказался единственным источником энергии для синтеза АТФ у P. modestum и M. rubra (Hilpert et al., 1984).

Обнаружено 2 типа АТФаз, являющихся первичными Na+-насосами, и образующих градиент ионов Na+ в ответ на гидролиз АТФ. Первый тип – NatAB, обнаружен у Bacillus subtilis и B. firmus. Его роль преимущественно в предотвращении токсичности высоких концентраций натрия для клеток (Wei et al., 1999). Второй тип – АТФ синтетазы F0F1-типа и V-типа. К данной группе относятся и АТФазы Р-типа. Как было показано, они очень незначительно отличаются по строению от протонпереносящих. Работа АТФаз, сопряженная с транспортом натрия, является более энергозатратной по сравнению с Н+зависимой, поэтому осуществляется только в экстремальных условиях, обеспечивая возможность для жизни микроорганизмов.

У метаногенных архей была обнаружена первичная натриевая помпа, сопрягающая выброс ионов Na+ с переносом метильной группы от тетрагидрометаноптерина к коферменту М.

Недавно было также показано, что мембраносвязанные пирофосфотазы (РРазы) из мезофильной Methanosarcina mazei, термофильной Moorella thermoacetica и экстремально термофильной Thermotoga maritima, экспрессированные в E. coli, катализируют транспорт Na+ внутрь мембранных везикул из E. coli (Malinen et al., 2007). Наибольшую активность данного фермента наблюдали в присутствии и Na+, и К+. Установлено, что К+ является регулятором, в то время как для активности необходимы Na+ и Mg2+ (Malinen et al., 2008). Обнаружено 2 участка связывания ионов натрия, один из которых также способен связывать катионы калия. В соответствии с результатами филогенетического анализа, предположили, что удвоение генов предшествовало совмещению протонной и натриевой пирофосфатаз.

Стоит заметить, что несмотря на широкое разнообразие натриевых ферментов у соответствующих микроорганизмов, абсолютное большинство энергосопрягающих систем используют протонный градиент.

1.4. Цитохром-с-оксидаза cbb3-типа

Терминальная оксидаза дыхательной цепи - фермент, содержащий в качестве простетической группы гем (гемы). Гем - циклическое тетрапиррольное органическое соединение, имеющее ряд боковых заместителей и связывающее одну молекулу металла (как правило, Fe или Mg). В настоящее время охарактеризовано 5 основных типов гемов, обозначаемых заглавными буквами латинского алфавита: A, B, C, D, O. Белок, содержащий гем, называется цитохромом. В зависимости от типа связанного гема цитохромы называют малыми буквами латинского алфавита или их сочетанием (цитохром c, цитохром bo и т.д.). Из всех гемов только гем C связан с белком ковалентно как правило, через остатки цистеина (Cys). Самым простым по структуре является гем B. Гем C структурно аналогичен гему B, но в отличие от гема B связан с белком ковалентно.

Терминальные цитохром-c-оксидазы дыхательной цепи содержат 5 металлических редокс-центров: два гемовых железа (высоко- и низкоспиновое) и три атома меди - CuА (биядерный медный центр) и CuВ, входящий в состав реакционного биядерного геммедного центра, где происходит восстановление кислорода до воды.

Медь CuА обнаружена только в цитохром-c-оксидазах. Во всех изученных на данный момент хинолоксидазах металлический центр CuА отсутствует.

Однако, хинолоксидазы обнаруживают очень большое структурное сходство потенциального CuА-связывающего центра с CuА-центром цитохром-c-оксидаз.

Присутствие дополнительного металлического центра является отличительным признаком цитохром-c-оксидаз. Так как хинолоксидазы структурно и функционально схожи с цитохром-c-оксидазами предполагается, что хинолоксидазы утеряли CuА-центр в процессе эволюции. CuА–центр содержится в субъединице II цитохром-c-оксидазы, в ее C-терминальной части на внешней стороне мембраны, что получило прямое подтверждение при проведении рентгеноструктурного анализа цитохром-c-оксидазы. Причем было показано сначала биохимическими методами, что CuА-центр расположен близко к поверхности между субъединицами I и II и близко к цитозольной поверхности мембраны. Рентгеноструктурный анализ прямо подтвердил расположение CuА в субъединице II близко к поверхности субъединицы I на внешней стороне мембраны и к водной фазе. Возвращаясь к структурному сходству хинол- и цитохром-c-оксидаз, следует отметить, что были получены экспериментальные данные о реконструкции CuА-центра в субъединицу II (CyoA) хинолоксидазы bo-типа E.coli, изначально не содержащую CuА, при этом реконструированный белок демонстрировал ряд свойств, характерных для центра CuА. Эти данные свидетельствуют о том, что трехмерная структура CuАсвязывающих доменов консервативна у цитохром-c- и хинолоксидаз.

CuА-центр цитохром-c-оксидазы является биядерным и содержит два атома меди в состоянии со смешанной валентностью [Cu(1,5)...Cu(1,5)]. Прямым доказательством биядерности CuА-центра цитохром-c-оксидазы стали данные рентгеноструктурного анализа митохондриальной оксидазы и цитохром-cоксидазы aa3-типа P. denitrificans.

В ряде работ отмечались конформационные изменения фермента при восстановлении CuА. Предполагалось, что эти конформационные изменения вовлечены в механизм активного транспорта протонов. Таким образом, высказывалось мнение, что CuА-центр участвует в транспорте ионов. Так, было показано, что химическая модификация CuА-центра влияет на протонпереносящую активность цитохром-c-оксидазы. Нагревание окисленного о фермента (43 C в течение примерно часа) также вызывает локальные структурные изменения CuВ-центра, приводящие к потере протонпереносящей активности оксидазы.

Однако хинолоксидазы не содержат CuА-центра, и тем не менее функция переноса протонов у них сохранена (например, хинолоксидаза bo-типа E.coli). Более того, кроме хинолоксидаз, не содержащих CuА, была обнаружена цитохром-c-оксидаза cbb3-типа у Rhodobacter, Bradyrizobium japonicum и др., которая имеет биядерный гем-медный центр, низкоспиновый гем, не имеет CuА-центра и переносит протоны (показано косвенно для cbb3-оксидазы P.

denitrificans). Таким образом, ключевую роль в транслокации Н+ играет биядерный гем-медный центр, а перенос H+ непосредственно связан с химией процесса восстановления кислорода. К тому же, молекула воды находится на близком расстоянии к CuА-центру, но не входит в непосредственную координационную сферу металлов (меди). Другая возможная роль CuА-центра участие в переносе электронов к каталитическому центру цитохром-c-оксидазы, в частности, CuА может быть непосредственным окислителем цитохрома c, т.е.

первичным акцептором электронов. В пользу этого свидетельствуют данные, согласно которым минимальное расстояние между CuА и границей белок-вода составляет 5,4 А. На данный момент роль CuА в переносе электронов в оксидазе считается общепринятой.

Второй медный редокс-центр находится в субъединице I цитохромоксидазы и называется CuВ. CuВ входит в состав так называемого биядерного центра цитохромоксидазы, который помимо меди содержит высокоспиновый гем (A или O; а также может быть и B) и служит непосредственным реакционным центром восстановления кислорода до воды.

Наличие биядерного геммедного центра является характерной особенностью целого надсемейства оксидаз.

В настоящее время описан новый тип цитохром-с-оксидаз, которые кодируются опероном ccoNOQP/fixNOQP и называются оксидазами cbb3-типа.

Гены, кодирующие оксидазу cbb3-типа, впервые были обнаружены у B. japonicum.

Их экспрессия у данных микроорганизмов необходима для симбиотической фиксации N2. Позднее цитохром-с-оксидаза cbb3-типа была выделена и описана для многих видов протеобактерий: Azorhizobium caulinodans, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, P. denitrificans, Pseudomonas stutzeri, а также у ряда патогенов человека, среди которых Helicobacter pilori, Campylobacter jejuni, Pseudomonas aeruginosa, V. cholerae (Hase et al., 2001).

Этот фермент достаточно хорошо охарактеризован как представитель отдельной группы терминальных оксидаз, входящих в состав дыхательной цепи аэробных бактерий. Оксидаза cbb3-типа обнаруживает те же активные центры, что и остальные члены суперсемейства гем-медных оксидаз. Однако по субъединичному составу, электрон-транспортным путям в активном биядерном центре и по сродству к кислороду она отличается от ранее описанных членов этого суперсемейства. Одним из таких отличий является присутствие гема В в биядерном центре. Существует предположение, основанное на результатах анализа кристаллической структуры бактериальной и митохондриальной цитохром-с-оксидаз, что гидроксильная группа гидроксифарнезильной цепи гема а3 может принимать участие в формировании Н+- проводящего пути, через который протоны поступают в биядерный центр. Более того, была показана строгая необходимость гидроксифарнезильной цепи для активности высокоспинового гема оксидазы bа3-типа P. denitrificans и оксидазы bo3-типа E. coli.

Оксидаза cbb3-типа у этих организмов была неактивна. Еще одной важной чертой этой оксидазы является отсутствие CuA, который, как считается, функционирует в качестве акцептора электронов от цитохрома с. И, наконец, эта оксидаза отличается интереснейшей особенностью, которая заключается в необычно высоком сродстве к кислороду (Кm7 нМ) и одновременно с этим способностью к транспорту Н+ (Raitio, Wikstrom, 1994) или Na+ (Мунтян, 2002).

Цитохром-с-оксидаза cbb3-типа кодируется опероном ccoNOQP/FixNOQP и состоит из четырех субъединиц. Ген ccoN у R. sphaeroides как и других представителей, имеющих эту оксидазу, кодирует главную мембранную субъединицу, состоящую из 535 аминокислотных остатков с молекулярной массой ~60060Да. Соответствующий полипептид в очищенном ферменте обнаруживается на SDS-PAGE с Mr~45000. Это различие может быть обусловлено аномальной электрофоретической подвижностью и возможным белковым процессингом. Молекулярные массы субъединицы СсоN оксидазы cbb3-типа других представителей имеют близкие значения. Полипептид образует структуру из 14 трансмембранных сегментов с обоими концами на цитоплазматической стороне. Эта субъединица связывает низкоспиновый гем b, высокоспиновый гем b3 и медь CuB. Из 13 гистидиновых остатков только 7 консервативны. В трансмембранных -спиралях локализуются только четыре гистидина, тогда как три находятся на периплазматических петлях. Из сравнения с локализацией гистидиновых лигандов в цитохром-с-оксидазе саа3типа (кристаллическая структура) можно предположить, что His118 и His407 – лиганды для низкоспинового гема b, His405 – высокоспинового гема b3, а His267, His 317 и His 318 – возможные лиганды для CuB.

Ген ссоО кодирует полипептид, состоящий у R.sphaeroides из 241 аминокислоты с Mr ~ 27 376 Да, который предположительно является мембраносвязанным цитохромом с. Соответствующий белок в очищенном препарате обнаруживает Mr ~ 29 000 (для P. stutzeri эта величина равна 23 кДа, для B. japonicum – 28 кДа). Показано, что СсоО возможно имеет единственный мембранный домен вблизи N-конца и гидрофобный домен, который скорее всего экспонирован в периплазматическое пространство, где и прикрепляется гем С. Наиболее вероятным сайтом связывания гема С является участок C68-Y69L70-C71-H72.

Ген ccoQ кодирует кислый полипептид (pI = 5,52) из 67 аминокислот с расчетной молекулярной массой 7778 Да. Этот полипептид имеет высокогидрофобный участок вблизи N-конца и заряженный участок у С-конца.

Присутствие СсоQ в очищенном комплексе было показано только для B.

japonicum. Ряд экспериментов на мутантах показал, что отсутствие ccoQ не влияет на экспрессию и сборку всего комплекса оксидазы. Соответствующий полипептид в очищенном препарате не обнаруживается и поэтому его роль остается невыясненной.

Продукт гена ссоР является кислым мембранным белком (pI = 4,54) и состоит из 290 аминокислот с расчетной молекулярной массой 31361 Да. Этот полипептид на SDS-PAGE соответствует субъединице с Mr ~ 35000 Да в очищенном препарате (для P. stutzeri эта величина равна 35 кДа, для B. japonicum – 32 кДа). Предполагается наличие двух доменов: гидрофобный трансмембранный домен вблизи N-конца и гидрофильный домен, вероятнее всего располагающийся на периплазматической стороне. В этом домене обнаруживаются участки для связывания двух гемов С.

Если предположить, что только субъединицы СсоN, СсоO, СсоP составляют функциональную оксидазу cbb3-типа, то рассчитанная по данным сиквенса масса всего комплекса ~120000 Да, близка величине, полученной в результате электрофореза. Кластер этих генов организован как оперон, что подтверждается: 1) присутствием только одного потенциального сайта терминации транскрипции в конце ссоР; 2) потерей экспрессии оксидазы cbb3типа в результате нарушения кластера генов. Сравнение известных последовательностей оперона показало, что самую высокую степень консервативности имеют субъединицы, кодируемые ccoN/fixN и ccoО/fixО генами (25% и 24% соответственно). Степень консервативности среди СсоР и СсоQ гораздо ниже (9,7% и 1,3% соответственно). Степень консервативности зависит от значимости субъединицы. Было показано, что полипептиды СсоN и СсоO необходимы для сборки и функционирования оксидазного комплекса (Zufferey et al., 1996). В той же работе показано, что делеция по гену ссоР приводит к сборке частично активного комплекса СсоN-СсоO. Субъединица СсоQ по-видимому не является необходимой для сборки и функционирования всего комплекса оксидазы. Это согласуется с данными о высокой активности очищенной cbb3-оксидазы R. sphaeroides, дефицитной по субъединице, кодируемой ссоQ. Однако нельзя полностью исключить возможной роли СсоQ в экспрессии комплекса и регуляции его активности.

Способность оксидазы cbb3-типа переносить протон является предметом дискуссии. Результаты исследования оксидазы P. denitrificans и некоторые измерения транслокации протонов могли трактоваться в пользу того, что оксидаза cbb3-типа не является протонной помпой. Однако было также обнаружено, что этот же фермент способен транспортировать протоны в процессе окисления сукцината, тогда как транслокация протонов, связанная с окислением ТМФД/аскорбатной системы, проявляется слабо. Позднее анализ транслокации Н+ целыми клетками различных представителей и очищенными из них оксидазами cbb3-типа, встроенными в фосфолипидные везикулы, показал, что соотношение Н+/е- для данного фермента – величина, варьирующая в интервале 0,2-0,5, что значительно ниже того же показателя для оксидазы аа3-типа (1 Н+/е-). Сходные данные были получены также для оксидазы cbb3-типа R. sphaeroides, более того, эффективность работы этой оксидазы достигала 1 Н+/е-. Причины этих отличий до сих пор не ясны. Одним из предполагаемых объяснений может быть присутствие другого О2потребляющего фермента у P. denitrificans, который забирает электроны от ТМФД/аскорбатной системы, но не от сукцината. Другой вариант объяснения более тонкий феномен, связанный с механизмом выброса Н+ в оксидазах cbb3типа. Этот механизм может быть высокочувствителен к значению редокспотенциала в донорном сайте и контролироваться им. Вероятно, достаточный контроль может достигаться только при поступлении электронов от комплекса bc1, но не от ТМФД/аскорбатной системы. Однако строгая гомология этих ферментов у P. denitrificans и R. sphaeroides не в пользу этого объяснения. Еще более интересным оказалось то, что оксидаза cbb3-типа не имеет некоторых участков, которые являются ключевыми компонентами в механизме транслокации протонов у большинства известных гем-медных оксидаз. Однако для R. sphaeroides была показана транслокация Н+ оксидазой cbb3-типа. Поэтому можно предположить, что эти высококонсервативные участки могут различаться среди оксидаз, но принципиальный механизм процесса транслокации при этом будет оставаться универсальным. Для окончательного выяснения этих вопросов и подтверждения имеющихся теорий необходимы дальнейшие исследования.

Анализ гидрофобных профилей и консервативных остатков гистидинов, которые служат лигандами для гема, железа и CuB в субъединице I, предполагает, что структура оксидазы cbb3-типа сходна со структурой известных цитохром-с-оксидаз, несмотря на низкий уровень гомологии. Эта субъединица (CcoN) скорее всего содержит низкоспиновый гем b, а также гем b3-CuB биядерный центр. Функцию CuA центра известных цитохром-с-оксидаз повидимому выполняет мембраносвязанный цитохром с, который транспортирует электроны в биядерный центр через низкоспиновый гем b.

Благодаря высокому сродству к кислороду, оксидазе cbb3-типа приписывается основная роль в процессе дыхания в условиях с пониженной концентрацией кислорода. В дополнение к функции преобразования энергии белковая субъединица CcoQ пурпурных бактерий участвует в передаче сигнала, в качестве которого выступает окислительный поток, проходящий через терминальную оксидазу. Результатом этого сигнала является экспрессия генов, молчащих при иных (аэробных) условиях роста. Филогенетический анализ предполагает, что субъединица CcoN/FixN, несущая активный центр оксидазы cbb3-типа, является частью древней цитохром-с-оксидазы. У B. japonicum эта оксидаза используется для фиксации азота. Есть и такие представители, у которых эта оксидаза является единственной, например, R. capsulatus. Поиск в полностью или частично прочитанных геномах различных микроорганизмов нуклеотидной последовательности, соответствующей субъединице CcoN оксидазы cbb3-типа R. capsulatus, которая по аминокислотной последовательности является гомологом субъединицы I оксидазы саа3-типа, показал, что она присутствует как у протеобактерий, так и у эубактерий. Однако аналогичный поиск других белковых субъединиц, уникальных для оксидазы cbb3-типа, показал присутствие этих субъединиц только у протеобактерий, но не за пределами этой группы. В работе Myllykallio говорится о том, что присутствие последовательности, соответствующей главной субъединице СсoN, не является доказательством наличия всей оксидазы cbb3-типа, т.к. остальные компоненты этой оксидазы могут отсутствовать.

–  –  –

Замечено, что методы измерения весьма грубые, и зачастую дают неточные или вовсе недостоверные результаты. В частности, точное значение мембранного потенциала для нейтрофильных бактерий неизвестно. Результаты, полученные рядом исследователей (Bakker, 1990; Kashket, 1985; Rottenberg, 1989), показывают, что даже низкие концентрации молекул порядка 100 нМ могут понизить потенциал. Это значит, что многие распространенные методы измерения не подходят для этого.

Для бактерий рода Thioalkalivibrio посредством расшифровки генома установлено наличие в цитоплазматической мембране ряда ионотранспортных систем, помимо рассмотренной оксидазы, приведенных на рис. 2 (Muyzer, 2008 personal communication).

Рис. 2. Ионный транспорт через мембрану Thioalkalivibrio versutus Центральной проблемой для облигатно или факультативно алкалофильных организмов, растущих при рН более 10, является поддержание более кислого внутреннего рН. Ключевым составляющим в механизме рН гомеостаза является электрогенный Na+/H+ антипортер (например, белок NhaP), который посредством своих кинетических свойств и/или концентрации в мембране катализирует поглощение протона, в то время как клетки выбрасывают протоны при дыхании. Антипортер также способен поддерживать постоянным внутренний рН при постоянном повышении внешнего рН, до тех пор, пока перемещение внутрь Na+ облегчено наличием в среде веществ, закачиваемых вместе с ним. Из E. coli был выделен и детально изучен антипортер NhaA, являющийся димером (2 цепи по 12 трансмембранных сегментов с асимметричной укладкой). Многие антипортеры очень чувствительны к рН, что объясняется функцией данных белков (Padan et al., 2001).

Второй проблемой для протондвижущей силы алкалофильных бактерий из-за закисления цитоплазмы является высокий отрицательный градиент рН (кислее внутри). Для целей закачки веществ и подвижности ряд организмов преодолевает проблему низкой протондвижущей силы путем использования для энергизации натрийдвижущей силы. Однако в случае синтеза АТФ алкалофильными бактериями проблема низкой протондвижущей силы повидимому не решается путем использования градиента Na+ или путем включения протонпереносящей АТФ синтазы во внутриклеточные органеллы.

Приведенные данные предполагают, что дыхательная цепь алкалофилов при высоком рН может как минимум эффективно перекачивать протоны через мембрану для H+-утилизирующих ферментов (например F1F0-АТФазы или Na+/H+ антипортера), используя при этом гипотетический внутримембранный путь (Krulwich, 1986).

Первичные помпы включаются либо редокс-системами, либо реакциями переноса метильной группы при метаногенезе, либо светом у фотофосфорилирующих галобактерий (Schafer et al., 1999). Известно большое количество Na+-субстратных симпортеров со стехиометрией 1:1 (Wilson et al., 2001).

Бактерии передвигаются, используя вращающиеся спиралевидные жгутиковые филаменты. Бактериальные двигательные жгутики работают благодаря утилизации µI специфических ионов на клеточной мембране.

Жгутиковый мотор расположен у основания филамента и заглублен в цитоплазматической мембране. Жгутиковые моторы классифицируют по типу Na+-зависимый Н+-зависимый.

сопрягающего иона на 2 типа: и Силопреобразующие элементы статора Н+-зависимого двигателя состоят из двух мембранных белков: MotA и MotB. Na+-зависимый жгутиковый мотор приводится во вращение посредством четырех трансмембранных белковых компонент: PomA, PomB, MotX и MotY (Yorimitsu et al., 2001).

–  –  –

Штаммы бактерии Thioalkalivibrio versutus AL2 и ALJ15, выделенные из содовых озер республики Тува (хранятся в музее ИНМИ РАН).

Реактивы и химически чистые вещества, использованные в работе:

FCCP (п-трифторметоксифенилгидразон) – Sigma;

CCCP (карбонилцианидхлорфенилгидразон) – Fluka;

ТФФ+ (тетрафенилфосфоний катион) – Sigma;

Оксонол VI – Sigma;

Сафранин О – Sigma;

Моненсин – Sigma;

Грамицидин – Sigma;

L-аскорбиновая кислота – Sigma;

Октилглюкозид (N-октил-,D-глюкопиранозид) – Anatrace;

Додецилмальтозид (N-додецил-,D-мальтопиранозид) - Anatrace;

Дитиотреитол – Serva;

-меркаптоэтанол – Sigma;

Глицерол – Реахим;

Глицерин – Реахим;

ТМФД (N,N,N,N-тетраметилен-п-фенилендиамин) – Fluka;

ТХУ (трихлоруксусная кислота) – Реахим;

CH3COOH (уксусная кислота) – Реахим;

ЭДТА (N,N,N,N-этилендиаминтетраацетат) – Sigma;

C2H5OH ректификат (этанол) – Реахим;

C2H4(CH3)OH (изопропанол) – Реахим;

HCl (соляная кислота) – Fluka;

KCN (цианид калия) – Merck;

H2O химически очищенная (вода дистиллированная) системы Millipore;

(NH4)2SO4 (сульфат аммония) – Реахим;

Na2SO4 (сульфат натрия) – Реахим;

K2SO4 (сульфат калия) – Реахим;

MgSO4 (сульфат магния) – Реахим;

CuSO4· 5H2O (сульфат меди пятиводный) – Реахим;

KCl (хлорид калия) – Реахим;

NaCl (хлорид натрия) – Реахим;

NaHCO3 (гидрокарбонат натрия);

NaOH (гидроксид натрия) – Реахим;

KOH (гидроксид калия) – Реахим;

Tricine (N-трис-[гидроксиметил]-глицин) – Sigma;

TEMED (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин) – Reanal;

Tris (трис-[гидроксиметил]-аминометан) – Sigma;

PMSF (фенилметилсульфонилфлюорид) – Serva;

SDS (C12H25NaO4S; додецилсульфат натрия) – Sigma;

(NH4)2S2O8 (персульфат аммония) – Reanal;

Na2S2O3 (тиосульфат натрия) – Реахим;

Caps (3-[циклогексиламино]-1-пропансульфоновая кислота) – Sigma;

Ches (N-циклогексил-2-аминоэтансульфновая кислота) – Sigma;

Mops (4-морфолинопропансульфоновая кислота) – Sigma;

Сахароза (перекристаллизованная) – Реахим;

Na2C4H4O6· 2H2O (виннокислый натрий двухводный) – Реахим;

Холат Na (3,7,12-тригидрокси-5-холанат натрия) – Реахим;

NaN3 (азид натрия) – Реахим;

Акриламид (CH2=CHC(O)NH2; 2-пропенамид) – Sigma;

N,N-Метиленбисакриламид – Sigma;

–  –  –

БСА (бычий сывороточный альбумин) - Serva;

ДНКаза I - Sigma;

Кумасси R-250 - Sigma;

MWM (преокрашенные маркеры молекулярных масс) – Fermentas;

Цитохром с сердца лошади (очищенный) Sigma;

–  –  –

Надосадочную жидкость аккуратно отбирали пипеткой вследствие неплотности осадка.

Для озвучивания отмытые клетки ресуспендировали в среде Б, содержавшей:

Буферная смесь А;

0,5 мМ ЭДТА;

4 мМ дитиотреитол (вносили перед озвучиванием);

1 мг/мл БСА (вносили предприготовленный концентрат);

Для озвучивания суспензию клеток разливали по стеклянным пенициллиновым флаконам (10 мл) и помещали в ледяную баню.

Непосредственно перед озвучиванием в каждый флакон добавляли по 2 капли PMSF (0,17 мг/мл в стоке) и ДНКазу на кончике шпателя. Озвучивание производили по 15 с 6 раз с перерывом 1 мин на ледяной бане с солью; всего проводили 6 циклов. По окончании обработки ультразвуком полученную суспензию разливали по пробиркам Eppendorf и центрифугировали при 15000 об/мин, 15 мин, +4°С. Супернатант по 8 мл аккуратно переносили пипеткой в пробирки для ультрацентрифугирования и полученные везикулы осаждали при 45000 об/мин ( Тi-50, 2 ч, +4°С). Осадок ресуспендировали в буферной смеси А, содержавшей 2 мМ Na2SO4 вместо 0,8 M, и гомогенизировали. Полученную суспензию далее анализировали фотометрически.

3.1.3. Выделение и частичная очистка терминальной оксидазы cbb3-типа.

Экстракция белков детергентом

–  –  –

В буфер добавляли PMSF до конечной концентрации 0,17 мМ, а затем добавляли додецилмальтозид из расчета 2 мг на 2-5 мг белка, т.е. 220 мг на 20 мл смеси. Проводили экстракцию в течение 20 мин при 0°С. Затем центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин при +4°С, и из отобранного супернатанта получали фракции белка дробным высаливанием с помощью сухого сульфата аммония.

–  –  –

Дробное высаливание экстрагированных мембранных белков проводили при t комнатной, добавляя сухой сульфат аммония в раствор, ступенчато увеличивая его концентрацию на 5 - 10%, начиная с 40% от насыщающей концентрации. Подбирали концентрацию, при которой преципитируют белки, обладающие оксидазной активностью. Образцы центрифугировали для отделения осадка.

Полученные белковые преципитаты растворяли в минимальном объеме среды Д, добавляли глицерин до 25 %.об и хранили при –70 оС. Каждую фракцию анализировали спектрально и полярографически на дыхательную активность. Образующийся при 60-70% осадок темно-красного цвета собирали центрифугированием с охлаждением, 14000 g, 10 мин. Данную фракцию, содержащую оксидазу cbb3–типа использовали для дальнейших исследований.

3.1.5. Ионообменная хроматография белковых препаратов Концентрат белковых фракций, обладавших наиболее интенсивной дыхательной активностью, наносили на анионообменную колонку DEAEToyoPearl, размером 10х1 см. Элюировали линейным градиентом концентрации NaCl от 50 мМ до 700 мМ.

3.1.6. Обессоливание и концентрирование белковых препаратов Белковые препараты, полученные в процессе фракционирования, концентрировали и обессоливали при помощи патронов Centricon на 2 мл, при этом использовали центрифугу Beckman, ротор JA-20 до 7000 об/мин.

–  –  –

Азолектин для приготовления протеолипосом, из расчета 8 мг/мл, гомогенизировали в 1 мл буфера следующего состава:

200 мМ Mops;

рН=7,4 (NaOH);

0,4 мМ додецилмальтозид;

Все растворы готовили на деионизованной в системе Millipore стерильной воде. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком 2 раза 15 периодами по 4 с, с перерывами 26 с. Центрифугировали полученную суспензию при 14000 об/мин, 4 °С, 5 мин для удаления титановых крошек. В озвученный раствор азолектина вносили раствор цитохром-с-оксидазы cbb3-типа из бактерии Tv. versutus AL2 (16 мкл) и перемешивали на магнитной мешалке (18 °С, 5 мин).

Удаление детергента производили на магнитной мешалке с термостатированием (18 °С, 5 ч) при поэтапном внесении сорбента “Bio-Beads” (Bio-Rad), предварительно активированного этанолом, до конечного содержания 240 мг.

Полученную суспензию протеолипосом разбавляли в 10 раз раствором:

200 мМ KCl 40 мМ Ches-KOH (pH = 9,3) 10 мМ NaCl и осаждали центрифугированием (160000 g; 1,5 ч; +4 °C). Осевшие протеолипосомы ресуспендировали в гомогенизаторе Поттера в минимальном объеме раствора, в котором производили разбавление.

–  –  –

Для очистки антител использовалась жидкостная хроматография на аффинной колонке HiTrap Protein G HP (Bio Rad), заполненной 5 мл сорбента G-сефарозы.

Образцы разводили в буфере для нанесения, содержавшего 20 мМ Na3PO4; pH=7,0, до полного растворения.

Суспензию антител фильтровали непосредственно перед нанесением на колонку. Перед нанесением АТ колонку уравновешивали 50 мл буфера для нанесения образцов со скоростью 5 мл/мин. После нанесения АТ колонку промывали 50 мл этого буфера.

Элюцию сорбированных АТ проводили путем снижения рН в элюенте до 2,7. В качестве элюента использовали раствор 0,1 М Глицин-HCl (pH=2,7), колонку промывали 25 мл элюента. Для предотвращения деградации нестабильных в кислоте IgG во флаконы для сбора фракций предварительно добавляли по 100 мкл 1 М Tris-HCl (рН=9,0).

–  –  –

Для очистки фермента использовали гель Affi-Gel Hz (Bio Rad) для иммуноаффинной сорбции.

Перед сшивкой антител с матрицей (Affi-Gel Hz гель) проводили замену буфера, в котором очищали IgG, на буфер для сшивки. Далее иммуноглобулины обрабатывали 30% v/v раствором периодата натрия (NaIO4), добавляя 21 мг/мл к раствору очищенных кроличьих антител (АТ) в темноте в течение 1 ч при t комнатной. Сразу после окисления проводили обессоливание раствора АТ для удаления периодата путем замены буфера колоночным способом на Econo-Pac 10DG, при этом белковые фракции элюировались первыми, а периодатные сразу после них (их не собирали). Последним подготовительным к очистке белка этапом является связывание АТ с Affi-Gel Hz-матрицей при помощи гидразида (гель Affi-Gel Hz отмывают в буфере для связывания; рН=5,5). Концентрация нанесенного IgG 5 мг на мл геля. Время связывания 20 часов при t комнатной. Готовую колонку промывали раствором 0,5 М NaCl, содержавшим 0,02 М азида натрия, и хранили при +4 °С.

Перед нанесением образца колонку с пришитыми АТ уравновешивали буфером для образца при t комнатной. Образец фильтровали перед нанесением. После нанесения промывали колонку 2 объемами 0,5 М NaCl в буфере для образца для удаления свободных белков из колонки. Затем колонку промывали 2 объемами буфера для образца с низкой концентрацией NaCl.

Для элюции можно использовать один из "кислых" либо хаотропных растворов, которые соответственно после элюции нужно быстро разбавить или нейтрализовать:

Хаотропные элюенты (рН 7,0):

4 M NaSCN;

3-6 M Guanidine-HCl;

6 М мочевина;

"Кислые" элюенты (рН = 2,0-3,5):

0,2 М Глицин-HCl; pH=2,5;

0,1 M уксусная кислота;

0,15 М цитрат натрия; рН=3,0;

0,5 М муравьиная кислота.

3.1.8.3. Аффинная хроматография на Ni2+-агарозе "Гистидиновую ручку" из 6 звеньев встраивали в субъединицу I оксидазы в 2 этапа при помощи генетических процедур (Mitchell et al., 1995).

Специфический сайт рестрикции (XhoI) пришивали к концевому участку субъединицы I цитохром-с-оксидазы непосредственно за последним кодоном методом двухшагового ПЦР мутагенеза, при котором использовался один синтетический олигонуклеотид: 5'-GAA CGC GCG CCC GCC CAC TCG AGC TAG CCT TCT GAT GCC CTA-3'. Двухнитевую ДНК с шестью кодонами гистидина и последующим стоп-кодоном пришивали к сайту XhoI (5'-TCG AAC CAT CAC CAT CAC CAT CAC TGA CCC GGG ATG TA-3'; 5'-AGC TTA CAT CCC GGG TCA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GT-3').

10 мМ имидазола вносили в экстракт мембранных частиц, затем мл Ni2+-агарозы и перемешивали в течение 1 ч при 4 °С.

добавляли 0,5 мг оксидазы

–  –  –

Точную концентрацию стандартного раствора БСА устанавливали по поглощению при 280 и Е= 0,067.

Все пробы, каждая объемом 600 мкл, сразу по истечении 30 минут анализировали на фотометре "Specol 20" при 540.

3.2.2. Микроскопирование (подсчет клеток) в камере Горяева

–  –  –

Где: - общий внутренний объем суспензии клеток;

- концентрация белка в исследуемом разведении суспензии клеток.

3.2.4. Оценка клеточного белка по светорассеянию суспензии клеток В серии разведений клеточной суспензии измеряли концентрацию белка и светорассеяние на фотометре "Specol 20" при 420 (рабочий объем кюветы 400 мкл). По показаниям строили калибровочный график для последующей быстрой оценки концентрации клеточного белка в клеточной суспензии.

3.2.5. Измерение трансмембранного потенциала клеток посредством ТФФ+-селективного электрода

–  –  –

3.2.7. Регистрация мембранного потенциала в суспензии везикул За мембранным потенциалом в обратновывернутых везикулах следили при помощи проникающего аниона оксонола (30 мкМ) на спектрофотометре Aminco DW-2000 (измеряли оптическое поглощение в двухволновом режиме, = 627–577 нм). Для измерений использовали кварцевую кювету 10x10 мм с рабочим объемом 2 мл. Буферная смесь для измерения содержала:

5 мМ Na2SO4;

200 мМ Tricine-KOH (рН = 8,3);

100 мМ К2SO4;

0,1 М сахароза;

10 мМ MgSO4;

0,3 мМ ЭДТА;

Активность ионной помпы инициировали добавками аскорбиновой кислоты и ТМФД в качестве субстратов. Для рассеивания потенциала использовали протонофор-разобщитель FCCP.

За мембранным потенциалом в правильновывернутых везикулах следили при помощи проникающего катиона ТФФ+ и ТФФ+-селективного электрода по методике, использованной для измерения потенциала на целых клетках.

Регистрацию мембранного потенциала с помощью ТФФ+ проводили в буферной смеси того же состава, что и при работе с оксонолом.

3.2.8. Определение дыхательной активности Дыхание (поглощение кислорода) ферментных комплексов на разных этапах очистки, а также препаратов мембранных частиц, содержащих эти комплексы, измеряли полярографически на полярографе LP7e с помощью стандартного платинового электрода Кларка в семи-анаэробной ячейке закрытого типа на магнитной мешалке при t комнатной. Результаты регистрировали с помощью самописца. В качестве доноров электронов для цитохромоксидазы использовали аскорбат (2 мМ) и ТМФД (0,08 мМ). В ячейку полярографа объемом 0,8 мл вносили 0,77 мл буфера Д, состава:

50 мМ Ches-Tris;

0,1 М NaCl;

0,5 мМ ЭДТА;

рН = 9,3.

Вносили 1,6 мкл аскорбата и 3,2 мкл ТМФД до конечных концентраций соответственно 2 мМ и 0,08 мМ и 4 мкл раствора, содержавшего фермент (количество препарата подбирали). Для ингибирования дыхания использовали свежеприготовленные растворы KCN различных концентраций.

Скорость дыхания (поглощения кислорода) определяли по формуле:

Объем ячейки Растворимость кислорода при данной температуре Время поглощения кислорода, находящегося в ячейке Количество белка в пробе При этом учитывали, что часть кислорода восстанавливалась находящимися в системе аскорбатом и ТМФД. При t комнатной растворимость кислорода в водных растворах принимали равной ~550 нг атомов кислорода/мл. Считали, что ширина ленты самописца, отмеченной пером, эквивалентна 100 % кислорода, а длина ее – время протекания процесса.

Строили кривые зависимости относительной активности потребления кислорода от концентрации цианида в ячейке.

3.2.9. Электрофорез в денатурирующих условиях

–  –  –

Местоположение белковых полос, если таковые имеются, определяли окрашиванием гелей в 0,05 % растворе Кумасси R-250 в смеси: уксусная кислота : этанол : вода (19 : 25 : 65 ). Окрашивание проводили в течение ночи при t комнатной, а отмывку 7 % уксусной кислотой – до желаемого прозрачного состояния геля (при повышенной температуре). Чтобы сохранить результат, гель помещали в канцелярский файл и сканировали изображение.

3.2.11. Измерение рН внутри клеток

Измерение проводили при помощи комбинированного стеклянного рНминиэлектрода. Свежевыросшую суспензию клеток Tv. versutus AL2 отмывали 5 раз раствором 0,62 М NaCl.

Клетки суспендировали в минимальном объеме раствора:

0,5 М сахароза;

0,12 М KCl;

20 мМ додецилмальтозид;

Полученную суспензию тщательно перемешивали и измеряли рН с помощью электрода.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Определение внутреннего объема клеточной суспензии На первом этапе исследования оценивали внутренний объем клеточной суспензии, отнесенный к содержанию клеточного белка в ней. Для этого поэтапно решались следующие задачи: подготовка клеточной суспензии к исследованию (отмывка от ростовой культуры и ресуспендирование в подходящем буфере); подсчет концентрации клеток в суспензии; определение концентрации клеточного белка в суспензии клеток; расчет внутреннего объема клеточной суспензии на количество белка клеток данных штаммов.

Подсчет клеток проводили в камере Горяева, последовательно фотографируя 5 слоев распределения (рис. 5). Сумму клеток в слоях считали общим количеством клеток в объеме, ограниченном стеклами камеры и сторонами квадрата.

–  –  –

Для построения калибровки концентрации белка по светорассеянию эту суспензию разбавляли в том же буфере. Полученные результаты для светорассеяния представлены на рисунке.

A420, O.E.

–  –  –

0,5 0,4 0,38; 0,19 0,3 0,24; 0,11 0,2 0,17; 0,08 0,1 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

–  –  –

Значения внутреннего объема, определенного двумя независимыми методами, оказались одинаковыми. Сделан вывод о точности определения данного параметра для исследуемой клеточной культуры.

–  –  –

Рис. 8. Измерение потенциала на целых клетках. Изменения мембранного потенциала регистрировали с помощью проникающего катиона ТФФ+.

Среда измерения содержала: 5 мМ Caps; 0,6 М NaCl; pH=10

–  –  –

Полученное значение заметно выше, чем для большинства известных бактерий. Отрицательное значение потенциала указывает на то, что более положительный заряд локализован внутри мембранного объекта.

Для исследования генерации мембранного потенциала клетками штамма ALJ15 в ячейку вносили 25 мкл суспензии клеток (103,2 О.Е.). Активность ионной помпы инициировали добавками аскорбиновой кислоты и тиосульфата натрия. Для рассеивания потенциала использовали детергент n-октил-,Dглюкопиранозид (5 мМ).

–  –  –

Рис. 9. Измерение потенциала на целых клетках штамма ALJ15. Изменения мембранного потенциала регистрировали с помощью проникающего катиона ТФФ+. Среда измерения содержала: 50 мМ Caps; 2 М NaCl; pH=10

–  –  –

Генерацию столь высокого электрического потенциала у Tv. versutus можно объяснить необходимостью преодоления противоположно направленного градиента концентрации протонов, для обеспечения возможности функционирования потребителей µН+.

4.3. Измерение внутриклеточного рН и расчет протондвижущей силы

–  –  –

Из расчета видно, что суммарный градиент протондвижущей силы направлен внутрь, и такой результат показывает преимущественный вклад в общий µН+ (Akerman et al., 1976).

Вычисленная протондвижущая сила имеет величину, которая может оказаться недостаточной для работы µН+ потребителей. У Bacillus firmus OF4 (при рН = 10,6) электрический градиент оказался равным 167 мВ, а концентрационная составляющая µН+ имела величину +121 мВ (Guffanti et al., 1992). Таким образом, по нашим расчетам с учетом первичных данных Гуффанти и соавт. суммарная протондвижущая сила у B. firmus равна 46 мВ, что по абсолютному значению меньше рассчитанной в настоящей работе.

–  –  –

Согласно гипотезе В.П. Скулачева, микроорганизмы, обитающие в щелочных условиях, могут использовать рNa для того, чтобы преодолеть большой отрицательный вклад рН в µН+ (Skulachev, 1989). Опираясь на эту гипотезу, можно предполагать, что у исследуемых экстремально алкалофильных бактерий могут функционировать генераторы натриевого потенциала.

4.4. Регистрация мембранного потенциала на везикулах На третьем этапе исследования получили везикулы из клеточной массы бактерий и оценили разность потенциалов на их мембране.

За генерацией электрического потенциала на мембране везикул, полученных из бактериального штамма AL2, следили по разностному показателю поглощения проникающего аниона Оксонола на спектрофотометре. В ячейку вносили 2 мл буфера; 30 мкМ Оксонола, 40 мкл суспензии везикул. Генерацию потенциала запускали добавкой субстрата для терминальной оксидазы, а именно аскорбатом и ТМФД. Для рассеивания потенциала в кювету вносили 12 мкМ протонофора-разобщителя FCCP.

Как следует из рисунка, везикулам как и многим мембранным препаратам присуще неспецифическое связывание аниона в силу его липофильности. В ответ на добавку субстратов наблюдается специфическая генерация мембранного потенциала, что подтверждается его полным рассеиванием при внесении ингибитора-протонофора FCCP. Результат показывает наличие в суспензии обратновывернутых везикул, поскольку только в случае положительного заряда на внутренней стороне мембраны, в результате работы ионной помпы, проникающие анионы будут закачиваться внутрь везикул.

–  –  –

Рис. 10. Генерация электрического потенциала на мембране обратновывернутых везикул AL2. Оценку проводили по разности поглощения оксонола VI на двух длинах волн в суспензии везикул Регистрацию мембранного потенциала на мембранных везикулах, полученных из клеток штамма AL2, также производили с помощью ТФФ+селективного электрода в ячейке с мешалкой по методике, приведенной для клеточной суспензии.

В первом опыте использовали везикулы, выделенные в середе с 2 мМ Na2SO4. В качестве субстратов вносили аскорбиновую кислоту и ТМФД. Далее вносили Na+/H+ антипортер моненсин. Для рассеивания потенциала в ячейку вносили протонофор-разобщитель СССР. Результаты приведены на рис. 11.

–  –  –

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Рис. 11. Измерение потенциала на везикулах штамма AL2, выделенных в середе с 2 мМ Na2SO4. Изменения мембранного потенциала регистрировали с помощью проникающего катиона ТФФ+.

Среда измерения содержала: 2 мМ Na2SO4 Во втором опыте (рис. 12) использовали везикулы, выделенные в середе с 800 мМ Na2SO4.

В третьем опыте (рис. 13) везикулы выделены в середе с 800 мМ Na2SO4.

Среда для измерения содержала 600 мМ Na2SO4.

–  –  –

Рис. 12. Измерение потенциала на везикулах штамма AL2, выделенных в середе с 800 мМ Na2SO4. Изменения мембранного потенциала регистрировали с помощью проникающего катиона ТФФ+.

Среда измерения содержала: 2 мМ Na2SO4

–  –  –

Проведенные опыты показали, что потенциал на везикулах зависит от концентрации ионов Na+ по обе стороны мембраны. При низкой концентрации натрия внутри и снаружи везикул, равной 2 мМ, генерация потенциала достигает низкого уровня, порядка 3 мВ на мг белка, по сравнению с вариантами экспериментов, когда концентрацию натрия увеличивали последовательно сначала внутри до 800 мМ, а затем и снаружи до 600 мМ. При повышении внутренней концентрации Na+ до 800 мМ генерация потенциала от одной добавки аскорбата достигает более высокого уровня (рис. 12), чем при 2 мМ Na+ в присутствии аскорбата и ТМФД (рис. 11). Последующее добавление ТМФД до конечной концентрации 96 мкМ (рис. 12) приводит к последовательному повышению уже достигнутого уровня потенциала, до 11,5 мВ на мг белка. При повышении внешней концентрации Na+ до 600 мМ, при сохранении его концентрации внутри везикул равной 800 мМ (рис. 13), наблюдалась еще более активная генерация потенциала, составлявшая порядка 14 мВ на мг белка.

Результат показывает наличие в суспензии правильновывернутых везикул, поскольку только в случае отрицательного заряда на внутренней стороне мембраны, в результате работы ионной помпы, проникающие катионы будут закачиваться внутрь везикул.

4.5. Очистка оксидазы и получение протеолипосом

Установление особенностей функционирования отдельного белка или белкового комплекса в составе целых клеток или мембранных частиц зачастую усложняет трактовку полученных результатов из-за присутствия в той же экспериментальной системе других компонентов, вклад которых в наблюдаемую картину нельзя исключить. С этой точки зрения гораздо более надежным является метод реконструкции очищенного белка в искусственную мембрану (получение протеолипосом). Этот метод не является универсальным и в каждом отдельном случае требует индивидуального подхода.

Как известно из предшествующих исследований, оксидаза является интегральным мембранным белком, а ее каталитическая субъединица облигатно интегральным (рис. 18). Этим объясняется сложность разработки метода очистки.

Мембранные белки требуют выделения из естественного липидного бислоя, для чего используют детергент в присутствии ингибитора протеаз.

Липиды рекомендуется удалять экстракцией органическими растворителями (Финдлей, 1990).

Для очистки мембранных белков можно использовать: распределение в двухфазной системе; изоэлектрическое фокусирование; гель-хроматографию или гель-фильтрацию; ионообменную, распределительную (нормальнофазовую и обращеннофазную), гидрофобную, адсорбционную, высокоэффективную жидкостную и аффинную хроматографию – а также иммунологические методы: иммуносорбцию, имуноэлектрофорез (Остерман, 1985). При очистке мембранных белков необходимо поддерживать концентрацию детергента выше критической концентрации мицеллообразования.

Аффинная хроматография основана на биологическом сродстве или активности определенного белка к носителю. Адсорбированный белок элюируют с носителя агентом, эффективно конкурирующим за центр связывания.

Современные высокоэффективные методы очистки белков основаны на генетических модификациях (введение аффинных "ручек") и специфических иммунных взаимодействиях (иммуносорбция).

Для дальнейшей работы по очистке оксидазы cbb3-типа Tv.

versutus AL2 нами были выбраны следующие альтернативные подходы, основанные на:

ионообменной (1), иммуноаффинной (2) и металлохелатной (3) хроматографии (на Ni2+-агарозе). В дальнейшем с очищенным белком по первому методу опробована методика получения протеолипосом с цитохром-с-оксидазой бактерии Tv. versutus AL2 (рис. 14).

При использовании первого подхода фермент, полученный в результате фракционирования сульфатом аммония, очищали в процессе анионообменной хроматографии в градиенте концентрации NaCl на носителе DEAE ToyoPearl.

В ходе выделения контролировали дыхательную активность препаратов и содержание белка в них. Исследование дыхательной активности мембранных препаратов проводили с использованием ТМФД/аскорбатной системы в качестве субстрата (см. "методы"). Таким образом, в процессе дыхания принимал участие только терминальный участок дыхательной цепи.

–  –  –

Для экстракции фермента из мембран бактерии нами был использован неионный детергент N-додецил-,D-мальтопиранозид. Концентрацию детергента подбирали исходя из максимальной дыхательной активности мембранных частиц (рис. 15) и полноты экстракции мембранных белков.

Активность фермента исследовали во времени с целью выяснить дезактивирующее влияние детергента (рис. 16).

–  –  –

0,6 0,4 0,2

–  –  –

Рис. 15. Зависимость дыхательной активности мембран Tv. versutus AL2 от концентрации додецилмальтозида (ДМ). Среда измерения содержала: 50 мМ Ches-Tris; рН = 9,3; 100 мМ NaCl; 0,5 мМ ЭДТА; ДМ от 0,1 до 50 мМ.

–  –  –

Рис. 16. Зависимость дыхательной активности мембран Tv. versutus AL2 от времени инкубации с детергентом.

Среда измерения содержала: 50 мМ Ches-Tris; рН = 9,3; 100 мМ NaCl; 0,5 мМ ЭДТА; додецилмальтозид (ДМ) 5 или 20 мМ.

Нами было показано, что при инкубации мембранных препаратов с 5 мМ детергентом в течение суток активность оксидазы падает на 30 % от начальной.

При инкубации мембранных препаратов с 20 мМ детергентом в 4 часов активность оксидазы падает на 50 % от начальной. При снижении концентрации детергента в 200 раз путем разбавления препарата с исходной [ДМ] = 20 мМ буфером без детергента (конечная [ДМ] = 0,1 мМ) обратимо восстанавливается в соответствии с концентрационной зависимостью.

Ранее в нашей рабочей группе уже были исследованы зависимости дыхательной активности мембранных частиц от концентрации додецилмальтозида фирмы Sigma. Результаты текущего исследования в области 5-20 мМ додецилмальтозида фирмы Anatrace довольно близко повторяют результат предшествующего эксперимента. Мы опробовали для экстракции фермента концентрацию ДМ 20 мМ (активность падает на 50 % от исходной).

После экстракции активность возросла относительно исходной на 38%.

Провели фракционирование СА, дробно повышая его концентрацию на каждом этапе на 15%. Исследуемый фермент выпадал при 60% сульфата аммония. От СА суспензию отмывали 1М детергентом, на этом этапе активность составила 74% от исходной. На ночь суспензию оставили при +4°С.

Первое фракционирование на анионообменной DEAE колонке ToyoPearl проводили в присутствии изначально высокой концентрации соли, так чтобы не допустить сорбцию фермента на колонке, но обеспечить сорбцию балластных белков. В суспензии, нанесенной на колонку, обнаруживалось лишь 20 % изначальной активности, что предположительно обусловлено длительной инкубацией с детергентом. При элюции все дыхательно-активные белки вышли в проскок (фракции со 2 по 9). Тем не менее, несколько цветных фракций (22было собрано после выхода фермента, но они почти не обладали активностью, по сравнению с фракциями оксидазы (4,5 % от исходной) (см.

таблица 7).

Второе фракционирование на ионообменной колонке проводили при исходно низкой концентрации соли. Подавали на колонку сконцентрированные фракции 2-9 от первой хроматографии, а элюцию фермента обеспечивали повышающимся градиентом NaCl от 50 до 700 мМ (рис. 18). При этом оксидаза элюировалась в интервале концентраций NaCl от 170 до 220 мМ (фракции 13-17; активность 0,4 % от исходной).

фракция 15 A280, O.E.

фракция 13 1,0 400

–  –  –

В ходе предыдущей работы методом иммунизации были получены поликлональные антитела кролика к C-концу субъединицы ccoN каталитической субъединицы фермента (рис. 18, 19), которые целесообразно далее использовать для иммуносорбционной колонки Affi-Gel Hz.

Пептидо-белковый конъюгат (KAEAREAQAASTEARTA)8БСА был использован для иммунизации кроликов по стандартной методике. Пептид представляет собой химически синтезированный C-концевой фрагмент каталитической субъединицы ccoN ферментного комплекса cbb3-оксидазы.

Рис. 18. Каталитическая субъединица оксидазы cbb3-типа Tv. versutus AL2 и ее Cконцевой фрагмент, использованный в качестве составляющей АГ

–  –  –

Рис. 19. Схема получения антител к оксидазе Метод иммуносорбции Affi-Gel Hz наиболее специфичен благодаря использованию IgG в качестве сорбента, и его можно применять при недостаточности сведений о свойствах белка. При такой очистке фермент сохраняет свою активность.

Очистка антител

---------------------------------------------------------Хроматография на колонке с G-сефарозой; рН=7,0

–  –  –

Рис. 20. Схема очистки оксидазы методом иммуноаффинной хроматографии Для обеспечения высокой эффективности метода иммуносорбции необходимо получить чистые антитела. Также очистка повышает емкость сорбции антител на матрице. HiTrap Protein G HP (Bio Rad) – это подготовленная аффинная колонка для очистки моноклональных и поликлональных антител, которую планируется применить для очистки.

G-сефароза используется в качестве сорбента для выделения IgG из асцитов, крови и супернатантов клеточных культур. G-белок – это белок клеточной поверхности, Fc-рецептор III типа, который связывается с Fcучастком IgG по неиммунному механизму. Рекомбинантный G-белок имеет 2 сайта связывания для IgG и не имеет сайта связывания с альбумином. G-белок связан с высокоструктурированной агарозой в шариках посредством Nгидроксисукцинимида. Емкость связывания иммуноглобулина с матрицей, несущей G-белок, зависит от вида источника IgG и скорости протока (для IgG человека емкость около 25 мг иммуноглобулина на мл сорбента).

G-белок связывается с IgG в широком интервале рН и тем самым позволяет работать с различными буферами и условиями, но максимально эффективен рН=7,0. Для элюции рН понижают до 2,5-3,0. В качестве протектора для нестабильных в кислоте IgG добавляют в пробирки для сбора фракций по 60-200 мкл 1 М Tris-HCl; рН=9,0 – таким образом, конечный рН фракций будет близок к нейтральному.

Когда получены чистые антитела, можно переходить к очистке белка методом Affi-Gel Hz (Bio Rad) иммуноаффинной сорбции. Он основан на связывании IgG с агарозной матрицей и последующей сорбцией белка на антителах к нему. Преимуществом Affi-Gel Hz является однообразное ориентирование связанных антител на матрице благодаря использованию гидразида в качестве связки. В отличие от обычного способа присоединения антител по первичным аминогруппам (при котором сшивка очень близка к сайту связывания антигена), гидразид образует стабильные ковалентные гидразоновые связки с альдегидными группами иммуноглобулинов, окисленными из расположенных в Fc области тяжелой цепи углеводных групп (периодат окисляет соседние гидроксильные группы сахаров до альдегидной).

Рис. 21. Схема получения сорбента для иммуноаффинной хроматографии Условия элюции подбирают эмпирически (общие подходы: путем закисления рН до 2,5-3,0 или введением хаотропного агента).

Другой быстрый и высокоэффективный метод очистки оксидазы был описан Д. Митчеллом (Mitchell et al., 1995). Он основан на высоком сродстве гистидиновой "ручки" из 6 звеньев, прикрепленной к С-концу одной из субъединиц ферментного комплекса оксидазы, к Ni2+-нитрилотриуксусной (НТУ) кислоте (закрепленной на агарозной матрице). Метод позволяет быстро и с высоким выходом, за один этап аффинной хроматографии очистить оксидазу, подаваемую в виде экстракта мембран на колонку. При этом очистка фермента достигает более 95 %, а фермент полностью сохраняет активность.

Гистидиновая ручка, состоящая из шести последовательных триплетов, кодирующих гистидин, легко включается в состав субъединицы I, которая в свою очередь предварительно подготовлена сайт-направленным мутагенезом.

Плазмиду, полученную после встраивания в нее последовательности субъединицы I и последовательности шести гистидинов непосредственно за ней, вводят в мутантный штамм исходной бактерии с делецией по соответствующей субъединице, и получают рекомбинантный фермент из выросшей биомассы. Элюция белка осуществляется повышением концентрации имидазола до 100 мМ.

–  –  –

Существует целый ряд аффинных "ручек", которые в зависимости от условий можно использовать для очистки белков (Arnau et al., 2006).

Разработаны и методы удаления ручки. His-ручка выгодно отличается от других аффинных конструкций большим выходом и меньшим числом этапов очистки, поэтому является перспективным методом для работы, в частности, с оксидазой cbb3-типа из Tv. versutus.

ВЫВОДЫ

1. Измерен мембранный потенциал на клетках двух штаммов AL2 и ALJ15 экстремально алкалофильной бактерии Tv. versutus. Он равен соответственно

-231 мВ и -235 мВ, и оказался выше, чем у большинства известных бактерий, обитающих в нейтральных средах.

2. Измерен внутренний рН клеток (7,1); и вычислена протондвижущая сила, которая равна -61 мВ. Градиент рН на мембране клеток составил 2,9 единицы.

3. Потенциал на мембране везикул зависит от концентрации ионов натрия в среде. Совокупность данных позволяет предположить наличие натриевых помп в клетках данной бактерии.

4. Разработан проект эффективной очистки оксидазы cbb3-типа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Albers S.V., J. Van de Vossenberg, A. Driessen. W.N. Konings. Bioenergetics and solute uptake under extreme conditions. // Extremophiles. 2001.-V.5.-P.Aono R., M. Ito, and K. Horikoshi. Measurement of cytoplasmic pH of the alkaliphile Bacillus lentus C-125 with a fluorescent pH probe. // Microbiology.

1997. – v.143. - p.2531–2536.

3. Arnau J., Conni Lauritzen, Gitte E. Petersen, John Pedersen. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. // Protein Expression and Purification. 2006. – v.48. - p.1-13.

4. Bally M.B., M.J. Hope, C.J.A. Van Echteld and P.R. Cullis. Uptake of safranine and other lipophilic cations into model membrane systems in response to a membrane potential. // Biochimica et Biophysica Acta. 1985. - v.812. - p.66-76.

5. Blair D.F., W.R. Ellis, Jr., H. Wang, H.B. Gray and S.I. Chang.

Spectroelectrochemical Study of Cytochrome c Oxidase: pH and Temperature Dependences of the Cytochrome Potentials. // The Journal of Biological Chemistry. 1986 September 5. - V.261. - p.11524-11537.

6. Bloch D., I. Belevich, A. Jasaitis, C. Ribacka, A. Puustinen, M. I. Verkhovsky, and M. Wikstrom. The catalytic cycle of cytochrome c oxidase is not the sum of its two halves. // PNAS. 2004 January 13. - v.101. - P.529–533.

7. Bott M. et al. Methylmalonyl-CoA decarboxylase from Propioniogenium modestum cloning and sequencing of the structural genes and purification of the enzyme complex. // Eur. J. Biochem. 1997.-V.250.-P.590-599.

8. Cook G.M. et al. The intracellular pH of Clostridium paradoxum, an anaerobic, alcaliphilic and thermophilic bacterium. //Appl. Environ. Microbiol. 1996.V.62.-P.4576-4579.

9. Dimroth P. A new sodium-transport system energized by the decarboxylation of oxaloacetate. // FEBS Lett. 1980.-V.122.-P.234-236.

10. Dimroth P. Primary sodium ion translocating enzymes. // Biochim. Biophys.

Acta 1997. - V.

1318. - P.11-51.

11. Dimroth P. The Generation of an Electrochemical Gradient of Sodium ions upon Decarboxylation of Oxaloacetate by the Membrane-Bound and Na+activated Oxaloacetate Decarboxylase from Klebsiella aerogenes. // Eur. J.

Biochem. 1982. - v.121. – p.443-449.

12. Dzbek J. and Bernard Korzeniewski. Control over the contribution of the mitochondrial membrane potential () and proton gradient (pH) to the protonmotive force (p): in SILICO studies. // The Journal of Biological Chemistry. 2008 august 11. Manuscript M802404200.

13. Efiok B.J. and D.A. Webster. A cytochrome that can pump sodium ion. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990.-V.173.-P.370-375.

14. Guffanti A.A. and Terry Ann Krulwich. Features of Apparent Nonchemiosmotic Energization of Oxidative Phosphorylation by Alkaliphilic Bacillus firmus OF4. // J. Biol. Chem. 1992 May 15. – v.267. – p.9580-9584.

15. Guffanti A.A., Richard T. Fuchs, Michael Schneier, Easter Chiu, Terry A.

Krulwich. A Transmembrane Electrical Potential Generated by Respiration Is Not Equivalent to a Diffusion Potential of the Same Magnitude for ATP Synthesis by Bacillus firmus RAB. // The Journal of Biological Chemistry. 1984 March 10. - V.259. - p.2971-2975.

16. Hase С.С., N.D. Fedorova, M.Y. Galperin, P.A. Dibrov. Sodium ion cycle in bacterial pathogens: evidens from cross-genome comparisons. // Microbiol.

Mol. Biol. Rev. 2001.-V.65.-P.353-370.

17. Hase C.C. Virulence and sodium bioenergetics. // Trends in Microbiology.

2000. - V. 8. - P. 490-491.

18. Hicks D., T. Krulwich. The respiratory chain of alkaliphilic bacteria. // Biochem. et Biophys. Acta. 1995. - v.1229. – p.303-314.

19. Hilpert W., B. Schink, P. Dimroth. Life by a new decarboxylation-dependent energy conservation mechanism with sodium as coupling ion. // EMBO J. 1984.

– v.3. – p.1665–1670.

20. Hockings P.D. and Peter J. Rogers. The measurement of transmembrane electrical potential with lipophilic cations. // BBA. 1996.-V.1282.-P.101-106.

21. Horikoshi К. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology.

// Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - v. 63. - P. 735-750.

22. Horikoshi K. Alkaliphiles - from an industrial point of view. // FEMS Microbiol. Reviews. 1996. V.18, P.259-270.

23. Huttunen M.T. and K.E.O. Akerman. Measurements of membrane potentials in Escherichia Coli K-12 inner membrane vesicles with the safranine method. // Biochimica et Biophysica Acta. 1980. - v.597. – p.274-284.

24. Jones В.Е. et al. Alkaliphiles: diversify and identification. // Bacterial diversity and systematics. New York: Plenium Press. 1994.-P.195-230.

25. Karl E.O. Akerman and Marten K.F. Wikstrom. Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. // FEBS Letters. October 1976. - v.68. p.191-197.

26. Kita K., Konishi K., Anraku Y. Terminal oxidases of Escherichia coli aerobic respiratory chain I. Purification and properties of cytochrome b562-o complex from cells in the early exponential phase of aerobic growth. // J. Biol. Chem.

1984. - V.259. - P.3368-3374.

27. Kostyrko V.A., A.L. Semeykina, V.P. Skulachev, I.A. Smirnova, M.L. Vaghina, M.L. Verkhovskaya. The H+-motive and Na+-motive respiratory chains in Bacillus FTU subcellular vesicles. // Eur. J. Biochem. 1991. – v.198. – p.527–534.

28. Krulwich T.A. Bioenergetics of Alkalophilic Bacteria. // J. Membrane Biol.

1986.-v.89.-p.113-125.

29. Krulwich T.A. and Guffanti A.A. The Na+-cycle of extreme alkaliphiles: a secondary Na+/H+ antiporter and Na+/solute symporters. // J. Bioenerg.

Biomembr. 1989.-V.21.-P.663-677.

30. Malinen A.M., Alexander A. Baykov, Reijo Lahti. Mutual Effects of Cationic Ligands and Substrate on Activity of the Na+-Transporting Pyrophosphatase of Methanosarcina mazei. // Biochemistry. 2008. – v.47. - p.13447–13454.

31. Malinen A.M., Georgiy A. Belogurov, Alexander A. Baykov, Reijo Lahti. Na +Pyrophosphatase: A Novel Primary Sodium Pump. // Biochemistry. 2007. – v.46. – p.8872-8878.

32. Mitchell D.M., Robert B. Gennis. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni2+-NTA affinity chromatography. // FEBS Letters. 1995. - v.368. – p.148-150.

33. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. // Nature. 1961. - V.191. - P.144-148.

34. Morozov D.A., Maria S. Muntyan, Sergey S. Klishin. The finding of the cbb 3oxidase gene and the evidence for enzyme expression in extremely alkaliphilic bacteria. // Biochimica et Biophysica Acta. Abstracts. 2008. - v.1777. – p.72.

35. Muntyan M.S., Dinarieva T.Yu., Baev M.V. and Netrusov A.I. Effect of growth conditions on the synthesis of terminal oxidases in Methylobacillus flagellatus KT.

// Arch. Biochem. Biophys. 2002.-V.398.-P.118-124.

36. Muntyan M.S., Denis Morozov, D.Y. Sorokin, Sergey Klishin, V.P. Skulachev.

Molecular identification of the cbb3-type oxidase in extremely halo- and alkaliphilic bacterium Thioalkalivibrio versutus. // FEMS Microbiology Letters.

2007. – v.07-09-0946.

37. Padan E., Miro Venturi, Yoram Gerchman, Nir Dover. Na+/H+ antiporters. // Biochimica et Biophysica Acta. 2001. – v.1505 – p.144-157.

38. Park C., Moon J.Y., Cokic P., Webster D.A. Na+-translocating cytochrome bo terminal oxidase from Vitreoscilla: some parameters of its Na+ pumping and orientation in synthetic vesicles. // Biochemistry. 1996. - V.35. - P.11895-11900.

39. Russell N.J. Adaptive modifications in membranes of halotolerant and halophilic microorganisms. // J. Bioenerg. Biomembr. 1989. - V.21. - P.93-113.

40. Schafer G., Martin Engelhard, Volker Muller. Bioenergetics of the Archaea.

//Microbiology and Molecular biology reviews. Sept. 1999.-Vol. 63.-p. 570–620.

41. Semeykina A.L., Skulachev V.P., Verkhovskaya M.L., Bulygina E.S., Chumakov K.M. The Na+ -motive terminal oxidase activity in an alkalo- and halo-tolerant Bacillus. // Eur. J. Biochem. 1989. V.183. P. 671-678.

42. Skulachev V.P. Membrane-linked energy transduction. Bioenergetic functions of sodium: H+ is not unique as a coupling ion. // Eur. J. Biochem. 1985.-V. 151.-P.

199-208.

43. Skulachev V.P. The sodium cycle: a novel type of bacterial energetic. // J.

Bioenerg. Biomembr. 1989.-V.21.-P.635-647.

44. Smith J.C.. Potential-sensitive molecular probes in membranes of bioenergetic relevance. // Biochimica et Biophysica Acta. 1990. - v.1016. - p.1-28.

45. Sorokin D.Y., Robertson LA., Kuenen J.G. Chemostat study of alkaliphilic obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria. // Arch. Microbiol.

1999.

46. Sorokin D.Y. and Johannes Gijs Kuenen. Haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacteria in soda lakes. // FEMS Microbiology Reviews. 2005.-v.29-p.685–702.

47. Sorokin D.Y., Robertson L.A., Kuenen J.G. Isolation and characterization of obligately chemolithoautotrophic alkaliphilic sulfur-oxidizing bacteria. // Ant.

Van Leeuwenhoek. 2000.-V.77.-P.251-262.

48. Sorokin D.Y., Lysenko A.M., Mityushina L.L., Tourova T.P., Brian E.J., Rainey F.A., Robertson L.A., Kuenen G.J. Thioalkalimicrobium sibencum, Thioalkalimicrobium aerophilum gen. nov., sp. nov. and Thioalkalivibrio versutus, Thioalkalivibrio nitrates, Thioalkalivibrio denitrificans gen. nov., sp. nov., new obligately alkaliphilic and obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from soda lakes. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001.-V.51.-P.565-580.

49. Steuber J. Na translocation by bacterial NADH:quinone oxidoreductases: an extension to the complex-I family of primary redox pumps. // Biochimica et Biophysica Acta. 2001. – v.1505 – p.45-56.

50. Steuber J., С. Schmid, M. Rufibach and P. Dimroth. Na+ translocation by complex I of Escherichia coli. // Mol. Microbiol. 2000.-V.35.-P.428-434.

51. Sturr M.G., Arthur A. Guffanti, and Terry A. Krulwich. Growth and Bioenergetics of Alkaliphilic Bacillus firmus OF4 in Continuous culture at High pH. // Journal of Bacteriology. June 1994. - v.176. - p. 3111-3116.

52. Tokuda. H., Unemoto T. Growth of a marine Vibrio alginolyticus and moderately halophilic V. costicola becomes uncoupler resistant when the respirationdependent Na+ pump functions. // Bacteriol. 1983.-V.156.-P.636-643.

53. Waugh D.S. Making the most of affinity tags. // TRENDS in Biotechnology.

2005. - V.23 – p.316-320.

54. Wei Y., A.A. Guffanti, T.A. Krulwich. Sequence analysis and functional studies of a chromosomal region of alkaliphilic Bacillus firmus OF4 encoding an ABCtype transporter with similarity of sequence and Na+ exclusion capacity to the Bacillus subtilis NatAB transporter. // Extremophiles. 1999. - v.3. – p.113–120.

55. Wilson T.H., Ping Z. Ding. Sodium-substrate cotransport in bacteria. // Biochimica et Biophysica Acta. 2001.-v.1505.-p.121-130.

56. Yorimitsu T., Michio Homma. Na+-driven flagellar motor of Vibrio. // Biochimica et Biophysica Acta. 2001.-v.1505.-p.82-93.

57. Zanotti A. and Giovanni Felice Azzone. Safranine as Membrane Potential Probe in Rat Liver Mitochondria. // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1980 April 15. - V.201. - p.255-265.

58. Zilberstein D., V. Agmon, S. Schuldiner, and E. Padan. The sodium/proton antiporter is part of the pH homeostasis mechanism in Escherichia coli. // J. Biol.

Chem. 1982. – v.257. – p.3687-3691.

59. Герасименко Л.М., Дубинин А.В., Заварзин Г.А. Алкалофильные цианобактерии содовых озер Тувы и их экофизиология. // Микробиология. 1996.-Т.65.-С.844-849.

60. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Кулырова А.В., Заварзина Д.Г., Жилина Т Н. Активность сульфатредуцирующих бактерии в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья. // Микробиология. 1996. - T.65. - C.546Грищук Ю.В., Мунтян М.С., Попова И.В., Сорокин Д.Ю. Транспорт ионов, сопряженный с работой терминальной оксидазы экстремально щелочелюбивой солеустойчивой бактерии рода Thioalkalivibrio. // Биохимия. 2003. – т.68. – с.477-483.

62. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие. // Микробиология.

1999. - Т.68. - С.579-599.

63. Мунтян М.С., Блох Д.А., Устиян В.С. Два семейства терминальных оксидаз и их роль в энергетике микроорганизмов. // Российская наука. "Выстоять и возродиться". 1997. - С.286-293.

64. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. – М.: Наука.

1985.

65. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии.

М.: Высшая школа. 1989.

66. Сорокин Д.Ю. Совмещенные микробиохимические процессы трансформации неорганических веществ: роль в природных системах и возможности использования в биотехнологии. // Микробиология. 1997. Т. 66. - С. 293-301.

67. Финдлей Д.Б., Эванс У.Г. Биологические мембраны. Методы. – М.: Мир.

1990.

РОССИЙСКИЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Д.И. МЕНДЕЛЕЕВА

ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА

ИНЖЕНЕРНЫЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ

–  –  –

"Изучение мембранного потенциала у экстремально алкалофильных бактерий из содовых озер" Руководитель работы _________________________________ Мунтян М.С.

Консультант по экономике _____________________ Пржиялговская И.С.

Студент группы Э-64 _____________________________ Д.А. Морозов

–  –  –

Данная дипломная работа посвящена изучению мембранного потенциала у экстремально алкалофильных бактерий.

Целью настоящего исследования было измерить мембранный потенциал () на мембране экстремально гало- и алкалофильных бактерий Thioalkalivibrio versutus AL2 и ALJ15 – представителей подкласса гамма-протеобактерий. Также необходимо было изучить генерацию электрического потенциала суббактериальными мембранными частицами, полученными с помощью ультразвука. Исследование проводили для выяснения замкнутости мембранных частиц и для оценки их ориентации в суспензии. Для доказательства генерации потенциала оксидазой было проведено ее выделение и очистка с последующим встраиванием в липосомы и измерением потенциала на их мембране.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) Оценить внутренний объем клеток на мг клеточного белка Thioalkalivibrio versutus штаммов AL2 и ALJ15.

2) Установить зависимость светорассеяния клеточной суспензии от клеточного белка.

3) Измерить генерируемый потенциал в суспензии клеток с помощью ТФФ+-селективного электрода и рассчитать его численное значение на мембране бактерий.

4) Получить везикулы из клеток бактерии Thioalkalivibrio versutus.

5) Исследовать генерацию потенциала на мембране везикул с помощью различных проникающих ионов: для этого использовать в качестве проникающего катиона ТФФ+, а в качестве проникающего аниона – Оксонол VI.

6) Получить протеолипосомы с оксидазой cbb3-типа из Thioalkalivibrio versutus AL2.

7) Исследовать генерацию потенциала на мембране липосом с помощью ТФФ+.

Выполнение поставленных задач потребовало применения большого количества материалов, хим. реактивов, биомассы и широкого спектра оборудования, ввиду своей специфичности, а также поискового (исследовательского) характера работы.

–  –  –

Цены на материальные ресурсы взяты из документов бухгалтерской отчетности: по данным бухгалтерии НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского на 2008 год - по расходам средств гранта РФФИ (№ 08-04-01731), выделенного на проведение текущего исследования, положенного в основу дипломной работы.

–  –  –

Цены взяты по данным каталога цен на лабораторную посуду предприятия “Лабораторная техника”, 2008 года

2.4. Амортизационные отчисления Амортизационные отчисления (Сам) определяют исходя из стоимости используемого оборудования и приборов, годовых норм амортизации и времени их использования (в месяцах).

Сам=((Фi*Hai*Ti)/(100*12));

где: Фi - стоимость используемых приборов (по данным кафедры), руб.;

Hai - годовая норма амортизационных отчислений, которая берется из справочника “О единых нормах амортизационных отчислений на полное восстановление основных фондов народного хозяйства СССР” или устанавливается самостоятельно, исходя из возможного срока службы оборудования и приборов (по согласованию с консультантом по экономической части);

Ti - время работы приборов и оборудования в течение срока выполнения дипломной работы, мес.

–  –  –

Накладные расходы (Сн), включающие затраты на содержание учебновспомогательного и административно-управленческого персонала, отопление, освещение, вентиляцию, содержание библиотеки, общежития, ремонт зданий и прочие хозяйственные расходы, принимаются в размере 100 % от суммы заработной платы с начислениями.

Сн = 7920+6300+1260+1965,60 = 17445,6 руб.

3.Смета затрат на проведение дипломной научно-исследовательской работы.

–  –  –

4. Выводы

1. В дипломной работе, основную часть от всех затрат составляют затраты на накладные расходы – 29,18 % и затраты на заработную плату- 25,90 %.

Следовательно, данная работа является трудомкой.

2. Ощутимый вклад также вносят затраты на сырье и материалы (26,80 %), поэтому данная работа является еще и материалоемкой.

3. Все остальные затраты вносят небольшой вклад в общую сумму затрат на проведение данной НИР, поэтому ее нельзя отнести к энергоемким.

РОССИЙСКИЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Д.И. МЕНДЕЛЕЕВА

ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА

ИНЖЕНЕРНЫЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ

–  –  –

"Изучение мембранного потенциала у экстремально алкалофильных бактерий из содовых озер" Руководитель работы _________________________________ Мунтян М.С.

Консультант по охране труда ___________________________ Митин А.В.

Студент группы Э-64 _______________________________ Д.А. Морозов

–  –  –

Цель охраны труда – исключить воздействие на человека опасных и вредных производственных факторов, т.е. обеспечить безопасность производственного процесса.

Для плодотворной, интенсивной деятельности необходимо, чтобы условия труда были безопасны, безвредны, а также необходим оптимальный микроклимат.

Поэтому улучшение охраны труда – важнейшая задача, стоящая на сегодняшний день. В нашей стране уделяется большое внимание этой проблеме. Разработаны научные основы создания безопасных условий труда и постоянно проводятся социально-экономические, организационные и технические мероприятия, обеспечивающие соответствие действительных производственных условий нормативным. Вопросы улучшения охраны труда нашли отражение в законодательстве РФ. В нем подробно регламентированы все вопросы безопасности и улучшения условий работы людей. Однако все мероприятия по охране труда не принесут желаемых результатов, если каждый человек на конкретном рабочем месте не будет соблюдать установленные правила техники безопасности.

Данная дипломная работа выполнена на базе отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ и посвящена изучению мембранного потенциала у экстремально алкалофильных бактерий Thioalkalivibrio versutus. Целью работы было получение высокоточных экспериментальных данных о физико-химических величинах и доказательство предполагаемых научных фактов. Поэтому необходима была большая аккуратность и сосредоточенность внимания, а также информационная безопасность наряду с физической.

В ходе выполнения работы использовались различные токсические и пожароопасные химические соединения, большое количество разного сложного электрооборудования.

Токсикологические и химически опасные характеристики веществ

В ходе работы использовался ряд веществ, обладающих токсическими и химически опасными свойствами. Особенностью работы в микробиологической лаборатории является наличие наряду с опасными и вредными производственными факторами, характерными для химической лаборатории, специфических факторов, определяющих повышенные требования к гигиене труда и производственной санитарии - это биологические объекты, в т.ч. микроорганизмы.

Под токсичностью вещества подразумевается способность его вызывать в организме нарушение нормальных процессов жизнедеятельности при действии этих веществ на организм, в условиях работы даже с малыми количествами. Для характеристики вредных веществ, применяется система предельно допустимых концентраций этих соединений в окружающей среде, при воздействии их на организм на протяжении разных отрезков времени. Величина ПДК и характеристика токсикологических свойств веществ, использованных в работе приведены в табл. 1 [6].

–  –  –

В ходе выполнения дипломной работы использовались легковоспламеняющиеся и пожароопасные жидкости, работа с которыми требует мер предосторожности. Все работы с растворителями проводились в вытяжном шкафу. Скорость движения воздуха в поперечном сечении комнаты 1,5 м/с [4].

При проведении экспериментов с токсическими, агрессивными и пожароопасными веществами, установки и приборы размещали в вытяжном шкафу.

Использовалось только герметичное оборудование. Выполнены требования норм безопасности [22].

Техника безопасности при работе в лаборатории и правила работы с биообъектами При работе в микробиологичеких и биохимических лабораториях руководствуются ”Положением о единой системе организации работы по охране труда и технике безопасности в медицинской и микробиологической промышленности”. В соответствии с положением все сотрудники института должны обеспечиваться необходимым количеством спецодежды и средствами индивидуальной защиты (резиновые перчатки, прорезиненные фартуки, защитные очки и т.д.).

В лаборатории проводятся работы с различными штаммами микроорганизмов.

Так как работа с данными культурами представляет собой реальную опасность, в лаборатории существует инструкция ”По охране труда”, без ознакомления, с которой сотрудник не допускается до работы [1].

Все работы с микроорганизмами должны проводиться в специальных боксах с соблюдением высокостерильных условий, на расстоянии не более 10-15 см от горелки. Переодеваться в стерильную одежду необходимо в предбокснике, который также как и бокс облучается УФ. Для избежания травмирования при работе со стеклянной посудой запрещается применять посуду с трещинами и отбитыми краями, в случае же порезов рук стеклом и при попадании в ранку жидкости, необходимо удалить из раны осколки, промыть спиртом, смазать йодом и забинтовать. Пролитые растворы, содержащие опухолевые клетки, немедленно убрать и протереть 70% спиртом.

После завершения работы все рабочие поверхность протираются 70% спиртом, использованная пластиковая посуда промывается водой и только после этого утилизируются. Вся стеклянная посуда сначала моется специальным моющим средством, затем промывается 10 раз водой из под крана и 10 раз дистиллированной водой. В рабочем ламинаре включают УФ лампы сразу после окончания работы, а в боксе в конце рабочего дня [5].

–  –  –

Размеры помещения Площадь лабораторной комнаты – 32,0 м2, высота – 4,0 м, объем – 128,0 м3. В данной лаборатории одновременно работает не более 2 человек, то есть на каждого приходится 16,0 м2 площади и 64,0 м3 объема помещения, что соответствует требованиям санитарных норм [12].

Метеорологические условия Метеорологические условия в лаборатории соответствуют легкой категории работ. Температура воздуха в лаборатории в зимний и переходный периоды находится в пределах 17-23С, а в летний - 19-27С при относительной влажности не более 75%.

–  –  –

Вентиляция Для работы с вредными веществами в лаборатории имеется вытяжной шкаф, оборудованный раковиной для слива, кранами для подачи холодной воды и газа, розетками с напряжением 220 В и 380 В, внутренним освещением и водоструйным насосом. Рабочее помещение снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

Кратность воздухообмена определяется по формуле:

K=v*N/V;

где: K – кратность воздухообмена, ч-1;

v – расход воздуха на одного работающего человека по санитарным нормам, м 3/час; v=30 м3/час;

N- число людей работающих в лаборатории; N=2;

V – объем лаборатории, м3;

V=8*4*4=128 м3;

K= 30*2/128=0,47 ч-1;

В вытяжном шкафу имеется верхний и нижний отсос, что позволяет удалять как легкие так и тяжелые пары. Скорость движения воздуха в тяге зависит от положения створки и должна составлять 1,2 м/с, что больше скорости диффузии летучих веществ, используемых в работе. Нормам соответствует [15].

–  –  –

Канализация В лаборатории имеется хозяйственно-бытовая канализация, снабженная гидрозатворами, для предотвращения поступления в лабораторию и из нее вредных веществ и препятствия распространению пламени в случае пожара. Отработанные жидкости сливаются в канализационную сеть. Кислоты и щелочи перед сливом нейтрализуются. Отработанные вредные и ядовитые вещества собираются в герметичный стеклянный сосуд для последующей их переработки с целью утилизации или регенерации, а не сливаются в канализацию. Во избежание засорения суспензии с гранулами также не подлежат сливу [21].

Отопление Лаборатория оснащена радиаторами центрального отопления, которые обеспечивают среднюю температуру воздуха 20–23С, что соответствует санитарным нормам. Помещение характеризуется незначительным избытком явного тепла – около 5 кДж/м3·с и менее. Дополнительно используются бытовые электрообогреватели в зимний период. Условия соответствуют [20].

Электробезопасность в лаборатории

Для работы электроприборов в лаборатории используется переменный ток напряжением 220 и 380 В и частотой 50 Гц. Данное помещение относится к 1 классу "без повышенной опасности поражения людей электрическим током", т.к.

отсутствуют условия повышенной электроопасности. Температура = 22–25С, относительная влажность 60%, отсутствие токопроводящих полов и возможности одновременного прикосновения человека к имеющим соединение с землей металлоконструкциям и к металлическим корпусам электрооборудования.

Электрооборудование в лаборатории имеет соответствующую маркировку, электропровода, рубильники, пусковые устройства изолированы. Согласно требованиям ПУЭ для помещения класса В-1б, для защиты персонала от поражения электрическим током все приборы устанавливаются в защитном исполнении.

Сопротивление изоляции должно быть не менее 0,5 мОм, и должно периодически проверятся. При работе оборудования, находящегося под током, необходимо использовать электрозащитные средства [3].

–  –  –

Здание, в котором находится лаборатория, относится к категории "В", т.к.

легковоспламеняющиеся жидкости находятся в небольших количествах, так что не могут образовываться паровоздушные смеси, при воспламенении которых развивалось бы избыточное давление взрыва в помещении более 5 кПа. ЛВЖ находятся в лаборатории в количествах, недостаточных для создания взрывоопасной смеси. Работа с ЛВЖ и ГЖ проводится в вытяжных шкафах и без применения открытого пламени. Таким образом, данная лаборатория относится к зоне класса В-1б по классификации взрывоопасных и пожароопасных зон [22].

Степень огнестойкости строительных конструкций – II. Стены здания выполнены из бетона, полы покрыты линолеумом. Лаборатория расположена на 4 этаже шестиэтажного здания, имеется запасной выход на улицу. Расстояние от наиболее удаленного рабочего места до ближайшего эвакуационного выхода не превышает 12 м, что соответствует нормам регламента [22].

В здании имеется внутренний пожарный водопровод с выходами на лестничных клетках пожарных кранов, имеющих выкидные рукава и стволы. Краны расположены на высоте 1,3 м от уровня пола. Снаружи здания имеется пожарный водопровод с гидрантами на расстоянии 100 м друг от друга.

В самой лаборатории имеются следующие средства пожаротушения:

- огнетушители;

На этаже в коридоре расположены:

- асбестовые одеяла;

- песок;

- пожарный гидрант и рукава.

СИЗ и пожаротушения находятся в доступном месте и поддерживаются в исправном состоянии.

Для оповещения о возникшем в лаборатории пожаре имеется телефонная связь и пожарная сигнализация. На здании расположен молниеотвод. Категория молниезащиты – II. Соответствует строительным нормам и правилам [19].

Источники информации к разделу "Охрана труда"

1. Инструкция по технике безопасности для студентов, аспирантов и сотрудников НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

2. Инструкция о мерах пожарной безопасности в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

3. Инструкция по пользованию электроустановками в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

4. Инструкция по хранению и выдаче легко воспламеняющихся жидкостей (ЛВЖ) и растворителей НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

5. Инструкция по безопасной работе с едкими веществами НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

6. Инструкция по работе с особо опасными и токсическими веществами НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

7. Инструкция по работе на роторном испарителе НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

8. Инструкция по безопасной эксплуатации баллонов и сосудов, работающих под давлением и под вакуумом НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ.

9. Инструкция по безопасной работе со стеклянной химической посудой и ампулами НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

10. Отдельные требования к хранению химических реактивов НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

11. Инструкция по эксплуатации приборов системы газоснабжения в Лабораторном корпусе "А" МГУ.

12. СанПиН 2.2.12.1.1.1200-03. Санитарно-защитные зоны и санитарная классификация предприятий, сооружений и иных объектов. Санитарноэпидемиологические правила и нормативы.

13. СанПиН 2.2.4.1294-03. Гигиенические требования к аэроионному составу воздуха производственных и общественных помещений.

14. ГОСТ Р ИСО 16017-1-2007 Воздух атмосферный, рабочей зоны и замкнутых помещений.

15. ГОСТ Р ИСО 16000-1-2007. Воздух замкнутых помещений.

16. ГОСТ Р ИСО 7708-2006. Качество воздуха.

17. ГОСТ ИСО 8995-2002. Принципы зрительной эргономики. Освещение рабочих систем внутри помещений.

18. ГОСТ Р 52706-2007. Лампы накаливания вольфрамовые для бытового и аналогичного общего освещения. Эксплуатационные требования.

19. СНиП 31.03-2001. Производственные здания.

20. СНиП 41-01-2003. Отопление вентиляция и кондиционирование.

21. СНиП 2.04.01-2000. Внутренний водопровод и канализация зданий.

22. Федеральный закон от 22.07.2008 N 123-ФЗ. "Технический регламент о требованиях пожарной безопасности".

23. Макаров Г.В. Методические указания по разделу “Охрана труда” в дипломных проектах и работах. - М.: МХТИ им. Д.И. Менделеева, 1990.

24. Батаров А.Н. Пожаро-взрывоопасность веществ и материалов и средства их тушения. Справочник. – М.: Химия, 1990.

25. Трудовой кодекс Российской Федерации.



Похожие работы:

«ОАО «ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ» АФАНАСЬЕВ В.А. РУКОВОДСТВО ПО ТЕХНОЛОГИИ КОМБИКОРМОВОЙ ПРОДУКЦИИ С ОСНОВАМИ КОРМЛЕНИЯ ЖИВОТНЫХ ВОРОНЕЖ 2007 УДК 636.085:55 ББК 36.824 А 94 В.А.Афанасьев Рук...»

«УДК 574+551.477(75) Смирнов В.О. Некоторые аспекты фитоактинометрических исследований в лесах заповедника «Мыс Мартьян» Крымский научный центр НАН Украины и МОНМС Украины, г. Симферополь Аннотация. В статье рассмотр...»

«Ю. В. Морозюк С. Н. Морозюк 10 шагов исцеления от обиды. Практикум по развитию саногенного мышления Издательский текст http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=8880025 10 шагов исцеления от обиды. Пра...»

«2012 · № 6 ОБЩЕСТВЕННЫЕ НАУКИ И СОВРЕМЕННОСТЬ ГЛ О Б А Л И С Т И К А И ФУ Т У Р ОЛ О Г И Я М.В. ТЛОСТАНОВА Пограничное (со)знание/ мышление/эстезис на пути к трансмодерному миру* В статье рассматриваются особенности...»

«Вознаграждение руководителей высшего звена на примере компаний Восточной Европы (опыт эмпирического исследования на данных Bloomberg) Докладчик Кузнецова Екатерина Дискуссанты Солнцев Сергей Травкин Павел Содержание: 1...»

«Sattva Артемида Очистка организма от паразитов. Паразиты (Parasitos нахлебник, тунеядец) в процессе жизнедеятельности выделяют столько вредных и токсических веществ, что организм вынужден в...»

«УТВЕРЖДЕН решением Совета директоров ОАО «Газпром» от 25.02.2014 № 2309 с изменениями, внесенными решением Совета директоров ПАО «Газпром» от 01.09.2016 № 2795 КОДЕКС КОРПОРАТИВНОЙ ЭТИКИ ПАО...»

«6811 УДК 577 УПРАВЛЕНИЕ ТРАНСПОРТОМ КИСЛОРОДА ЧЕРЕЗ ПОВЕРХНОСТЬ ИЗОЛИРОВАННОЙ ПЕРФУЗИРУЕМОЙ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ К.В. Шадрин Красноярский научный центр СО РАН Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50 E-mail: kvsh_buffon@mail.ru Р.Г. Хлебопрос Красноярский научный центр СО РАН Россия, 660036, Красноярск, Академгород...»

«ГРИГОРЬЕВА Лидия Петровна, Фильчикова Любовь Ивановна, Алиева Зоя Сафаровна, Вернадская Марина Эдуардовна, Толстова Вера Анатольевна, Фишман Мария Натановна, Рожкова Лидия Алексеевна, Благосклонова Наталья Константиновна, Костина Татьяна Федоровна Дети с проблемами в развитии (комплексная ди...»

«13 (26) марта Священномученик Михаил (Околович) Священномученик Михаил родился 15 октября 1888 года в городе Полоцке Витебской губернии в семье священника, служившего в Спасо-Евфросиниевском женском монастыре, Федора Околовича. В 1899 го...»

«Радиотехника, системы телекоммуникаций, антенны и устройства СВЧ 11 РАДИОТЕХНИКА, СИСТЕМЫ ТЕЛЕКОММУНИКАЦИЙ, АНТЕННЫ И УСТРОЙСТВА СВЧ УДК: 621.396.6 С.В. Зимина ФЛУКТУАЦИИ ВЕСОВЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ В И...»

«Успенские чтения «Правда. Память. Примирение». Киев, 22 – 25 сентября 2015 г.  АРХИМАНДРИТ МИХАИЛ ВАН ПАРЕЙС МОНАХ — АНГЕЛ ОБЩЕНИЯ В ТВОРЕНИЯХ ПРЕПОДОБНОГО НИЛА РОССАНСКОГО* «Монах есть ангел, а его дела...»

«© 1999 г. Е.С. БАЛАБАНОВА АНДЕКЛАСС: ПОНЯТИЕ И МЕСТО В ОБЩЕСТВЕ БАЛАБАНОВА Евгения Сергеевна кандидат социологических наук, старший преподаватель кафедры общей социологии и социальной работы Нижегородского государственного университета. Underclass п...»

«Приложение № 4 к Условиям открытия и обслуживания расчетного счета Перечень тарифов и услуг, оказываемых клиентам подразделений Северного банка ОАО «Сбербанк России» на территории Вологодской области (действуют с 01.07.2014) Наименова...»

«Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования центр повышения квалификации специалистов Санкт-Петербурга «Региональный центр оценки качества образования и информационных технологий» ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНТЕРНЕТ-ТЕХНОЛОГИЙ В СОВР...»

«Система регулирования для оптимизации производительности и расхода энергии центрифугами периодического типа Дирк Зеебаум, Анне Зайдлер, Свен Вайднер, Бернд Бреннеке Требования по обеспечению высокой производительности и наилучшего возможного расхода электроэнергии являются главными факторами п...»

«10. Архебактерии. Архебактерии – особая группа микроорганизмов, отличающаяся от Эубактерий и Эукариот. Археи – обитатели многих экстремальных биотопов, согласно последним данным распространены также и в обычных биотопах. Современное издание «Руководства Берджи» разделяет Археев на 2 типа: Crenarchaeota и Eur...»

«European Journal of Psychological Studies, 2014, Vol.(1), № 1 Copyright © 2014 by Academic Publishing House Researcher Published in the Russian Federation European Journal of Psychological Studies Has been issued since 2014. I...»

«146 Раздел 2. Сбор социологической информации зрения, высказанную на предыдущем этапе, либо изменяют оценку в соответствии с мнением большинства. Так повторяет ся 3–4 раза. В ходе подобной процедуры вырабатывается со гласованная оценка, при этом исследователь не должен игно рировать мнение...»

«Прп. Иоанн Дамаскин Три защитительных слова против порицающих святые иконы Первое защитительное слово против порицающих святые иконы. Глава I О том, что Божество непостижимо и что не должно с излишним любопытством доискиваться того, что не предано нам святыми пророками, апостолами и евангелиста...»

«1 А. Ю. Агафонов об эмпирических и теоретических понятиях1 «В отличие от определений, – считает А. Ю. Агафонов, – термины важны. Научный стиль речи предполагает использование терминологии. Без терминов невозможно построить теорию. Это тривиальное соображение. Однако важно подчеркнуть: именно тео...»

«1 Армен Тыугу ОБЩИНА ХРИСТИАН В ТАЛЛИННЕ Община в Таллинне, Эстония, была основана в 1980 году Хельмаром Кнутером, священником Общины христиан Финляндии. Хотя уже с начала двадцатых годов (до времени запрета в 1940 1990гг) в...»

«В ЕДИНЕНИИ-СИЛА! КООПЕРАЦИЯ СЕВЕРА ДВУХНЕДЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, СЕВЕРОСОЮЗОМ ИЗДАВАЕМЫЙ ^ ; ПРИ УЧАСТИИ ЛЕСОАРТЕЛИ, АРТЕЛЬСОЮЗА и СЕВЕРН: о т с. х. КРЕДИТА. ГОД И З Д А Н И Я 4-й. № 19-20. ОКТЯБРЬ 1924 ГОДЯ. ВОЛОГДА. ;./л; • Вседо кооператавнЫ/у\ органазацоя^ Вологодского района.. ( Понесенная пролетариатом и крестьянами...»

«2014 ГОДОВОЙ ОТЧЕТ Омская региональная общественная организация «Центр охраны здоровья и социальной защиты «СИБАЛЬТ» www.sibalt.org Общественная организация «Центр «СИБАЛЬТ» Обращение председателя правления организации Уважаемые друзья! Я с гордо...»

«Университетская трибуна Б И Б Л И О Г РАФ И Ч Е С К И Й С П И С О К См.: A l e x a n d e r J. С. Twenty lectures: Sociological Theory since World War II. New York, 1987. См.: R o t h G u e n t h e r. Interpreting and Translating Max Weber // Intern. Sociology...»

«СЛОВАРЬ устаревших и диалектных слов БАЗ («на базу разводили костёр») – огороженное на дворе место для скота; скотный двор, крытый или некрытый при доме или за селением (№ 16). БАСТЕНЬКА, бастенький. («Масленка бастенька») – хорошенький, к...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.