WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:   || 2 | 3 |

«С.С. РЫБАКОВ КУРС ЛЕКЦИЙ ПО ОСНОВАМ БИОТЕХНОЛОГИИ В двух частях Часть 2. Применение биотехнологии Владимир 2010 УДК 573.6 (075.8) ББК 30.16 Р 93 Рецензенты: Доктор медицинских ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Владимирский государственный университет

С.С. РЫБАКОВ

КУРС ЛЕКЦИЙ

ПО ОСНОВАМ БИОТЕХНОЛОГИИ

В двух частях

Часть 2. Применение биотехнологии

Владимир 2010

УДК 573.6 (075.8)

ББК 30.16

Р 93

Рецензенты:

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой химии Владимирского государственного гуманитарного университета Н.П. Ларионов Доктор медицинских наук, профессор Владимирского государственного университета И.П. Бойко Доктор ветеринарных наук, профессор, начальник отдела разработки и внедрения промышленных технологий Федерального центра охраны здоровья животных В.В. Михалишин Печатается по решению редакционного совета Владимирского государственного университета Рыбаков, С.С.

Курс лекций по основам биотехнологии. В 2 ч. Ч. 2. ПрименеР93 ние биотехнологии / С.С. Рыбаков ; Владим. гос. ун-т.

– Владимир :

Изд-во Владим. гос. ун-та, 2010. – 127 с. – ISBN 978-5-9984-0046-9.

В первую часть курса лекций была включена информация по истории биотехнологии, генетической, клеточной инженерии и тканевой инженерии, культивированию бактерий и новому направлению нанобиотехнологии.

Во второй части в краткой форме изложены сведения о применении биотехнологии в различных областях деятельности человека, включая вопросы, связанные с биологическим оружием и биотерроризмом, биобезопасностью и охраной авторских прав в биотехнологии.



Данный краткий курс предназначен для студентов 3 и 4-го курсов очной формы обучения по специальностям «Биотехнические и медицинские аппараты и системы» (200401), «Инженерное дело в медико-биологической практике» (200402).

Табл.: 8. Библиогр.: 11 назв.

УДК 573.6 (075.8) ББК 30.16 ISBN 978-5-9984-0046-9 © Владимирский государственный университет, 2010

ВВЕДЕНИЕ

Сфера приложения биотехнологии и биотехнологических процессов c каждым годом расширяется: медицина и фармакология, сельское хозяйство, промышленность, охрана окружающей среды и др. Наиболее широко биотехнология применяется в трех отраслях народного хозяйства – медицине, сельском хозяйстве и промышленности. В последние годы все чаще она начинает применяться для решения проблем аквакультуры. Для обозначения указанных выше направлений был введен ряд новых терминов.

Красная биотехнология – применение биотехнологии в медицине. Например, получение необходимых штаммов микроорганизмов и их применение; разработка методов диагностики, средств лечения и профилактики различных заболеваний.

Зеленая биотехнология – процессы биотехнологии, применяемые в сельском хозяйстве. В качестве примеров можно привести традиционную селекцию и выращивание необходимых человеку животных и растений или получение трансгенных животных и растений с заданными, полезными для человека свойствами. Есть надежда на то, что зеленая биотехнология внесет в охрану окружающей среды больший вклад, чем традиционное индустриальное сельское хозяйство, например, благодаря использованию биопестицидов, биогербицидов и биоудобрений.

Белая биотехнология известна как промышленная биотехнология.

Примером является создание микроорганизмов, продуцирующих нужные для человека вещества, использование ферментов в качестве промышленных катализаторов или для деградации вредных отходов, загрязняющих окружающую среду. Из преимуществ белой биотехнологии перед традиционными процессами можно отметить снижение загрязнения окружающей среды и уменьшение потребления энергии и сырья.



Синяя биотехнология – термин, который введен для описания процессов биотехнологии, применяемых в аквакультуре. Этот термин пока используется редко.

Инвестиции и экономические вопросы, возникающие при применении биотехнологии в вышеперечисленных областях, формируют то, что обычно называют биоэкономикой.

В последние годы появился новый термин нанобиотехнология, который используется все чаще (см.Ч.1). Нанобиотехнологи уже начали применять молекулярную самоорганизацию как способ производства новых нанобиоструктур, таких как нанокапсулы для лекарств и каркасы из нановолокон для выращивания тканей. Важным направлением нанобиотехнологии считается разработка новых материалов для медицины.

Биотехнология является одним из научно-практических приоритетов XXI века. В 2004 г. рынок биотехнологической продукции в мире составил около 40 млрд долларов. По расчетам, к 2010 г. эта цифра увеличится до 100 млрд, а с включением сюда продукции, произведенной в других отраслях с использованием биотехнологических методов, превысит 3 трлн. Долгосрочные прогнозы также подтверждают тенденции роста биотехнологической отрасли.

Сознавая приоритетность и актуальность современной биотехнологии, общество биотехнологов им. Ю.А. Овчинникова, воссозданное в октябре 2003 г., вместе с другими заинтересованными общественными и государственными структурами России выступило с инициативой формирования и последующей реализации комплексной национальной программы «Развитие биотехнологии в России на 2006– 2015 гг.». Программа была утверждена Третьим съездом Общества биотехнологов им. Ю.А. Овчинникова 27 октября 2005 г.

Основная цель Программы – развертывание работ в области теоретической и практической биотехнологии в России на базе современных инновационных подходов для производства отечественной биотехнологической продукции. В практическом (прикладном) аспекте будут поддержаны наиболее перспективные проекты в области медицинской, сельскохозяйственной, пищевой, экологической, промышленной биотехнологии и других сфер применения биотехнологии с целью выйти на определенный процент импортозамещения.

Большое внимание уделено вопросам подготовки кадров XXI века. На это направлена одна из основных задач Программы – создание современной системы подготовки и сохранения кадров биотехнологов.

Лекция 1. БИОТЕХНОЛОГИЯ В МЕДИЦИНЕ

В недалеком прошлом смерть постоянно угрожала человеку.

Смертность младенцев достигала 25 %, примерно столько же умирало в детском возрасте. Человек из-за эпидемий, которые возникали очень часто, мог умереть в любом возрасте. Чуть больше 2 % популяции доживало до 65 лет. Благодаря усилиям ученых были выяснены причины многих болезней, разработаны методы их диагностики, лечения и профилактики, созданы антисептики, вакцины, антибиотики и другие препараты.

С улучшением условий жизни, а также медицинского обслуживания продолжительность жизни за последние 150 лет увеличилась с 40 до 80 лет и в будущем будет увеличиваться. В наши дни инфекционные болезни значительно меньше угрожают жизни и на первый план выступили сердечно-сосудистые и онкологические заболевания, нейродегенеративные болезни (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др.), количество случаев которых значительно возросло в результате старения популяции.

В медицине современная биотехнология находит широкое применение в таких областях, как разработка и производство фарм- и биопрепаратов; генетическое тестирование, терапия генов и т.д. Получение препаратов, применяемых в медицине, исследователи считают одним из важных направлений в биотехнологии. Речь идет о диагностических наборах, профилактических и лечебных препаратах. С помощью современных биотехнологических методов получено большое разнообразие биологически активных веществ белковой природы, в том числе гормонов, белков крови, иммунорегуляторов и иммуномедиаторов — интерлейкинов, интерферонов и др. Разработаны новые принципы конструирования вакцин и диагностических наборов. Эти задачи успешно решает иммунобиотехнология, выделившаяся в самостоятельный раздел биотехнологии.

Известно, что для разработки современных фармацевтических препаратов требуется значительное время. Кроме того, необходим длительный период их проверки, прежде чем соответствующие государственные органы разрешат производство и применение препарата.

Стоимость разработки и испытания таких препаратов может составлять многие миллионы долларов, поэтому они должны пользоваться большим спросом, чтобы не только возместить затраты, но и принести доход. Из-за отсутствия финансового интереса производящих компаний, сталкивающихся с гигантскими затратами, многие необходимые препараты не появляются на рынке. Биотехнология должна помочь в производстве препаратов, которые необходимы для человека в небольших количествах и не дают большого дохода.

Новые медицинские препараты, полученные с помощью биотехнологии, появляются на рынке почти ежедневно. Они включают терапевтические продукты (гормоны, регуляторные белки, антибиотики и т. д.; вакцины нового поколения, иммунодиагностические и ДНК-овые наборы для идентификации болезней; препараты для терапии генов и предродовой диагностики генетических болезней и др.) Молекулярные структурные элементы, образованные из аминокислот, пептидов, очень перспективны для разработки новых препаратов для медицины. В воде и жидкостях организма они образуют хорошо упорядоченные каркасы из нановолокон, которые могут использоваться для выращивания тканей. Например, ученые успешно использовали такие каркасы для выращивания искусственных хрящей и костей с целью замены поврежденных тканей. Самоорганизующиеся пептидные нановолокна могут мгновенно остановить кровотечение, что очень важно для хирургии. Применение новых структур для доставки лекарств и генов оказалось очень эффективным, так как они могут обволакивать гидрофобные вещества и доставлять их в клетки больного.

Всестороннее изучение механизмов заболевания позволяет разработать препараты целенаправленного действия. Это коммерчески развиваемые области новой биотехнологии с огромным настоящим и необъятным будущим рынком сбыта, некоторые из них будут кратко описаны ниже.

1.1. Фармацевтические и биофармацевтические препараты Антибиотики. Открытие в 1928 г. Александром Флемингом того, что грибок, называемый Penicillum notatum, может продуцировать соединение, подавляющее размножение широкого ряда бактерий, без заметного действия на организм человека или животных, сыграло в дальнейшем огромную роль. Последующие многочисленные исследования в этом направлении изменили методы борьбы человека с инфекционными, в первую очередь, бактериальными болезнями. Антибиотики начали интенсивно использоваться примерно с 1945 г. после применения пенициллина. Новые антибиотики вскоре расширили спектр антимикробных препаратов и в настоящее время широко используются в медицине и ветеринарии, а также (хотя менее интенсивно) в животноводстве, где некоторые антибиотики используются для увеличения веса сельскохозяйственных животных. Они могут также использоваться для борьбы с болезнями растений, а также в качестве инсектицидов.

Антибиотики, которые действуют на ряд микроорганизмов, называются антибиотиками с широким спектром. К ним относятся, например, хлорамфеникол и тетрациклины, которые могут действовать на такие неродственные группы микроорганизмов, как риккетсии, хламидии и микоплазмы. В противоположность им стрептомицин и пенициллин имеют узкий спектр действия, поскольку эффективны только против некоторых видов бактерий. Известно около 6000 антибиотиков, которые продуцируются грибами, стрептомицетами, бактериями. В медицинской практике испольуются около 100 антибиотиков. Большинство из них продуцируется актиномицетами, в частности, представителями рода Streptomyces (табл. 1.1).

Таблица 1.1 Некоторые наиболее важные антибиотики МикроорганизмАнтибиотик Спектр действия продуцент Actinomicin D Антиопухолевое Streptomices sp.

Bacitracin Антибактериальное Bacillus sp.

Bleomicin Антираковое Streptomices sp.

Cephalosporin Антибактериальное Acremonium sp.

Chloramphenicol Антибактериальное Cephalosporium sp.

Daunorubicin Антипротозойное Streptomices sp.

Fumagillin Амебоцидольное Aspergillus sp.

Griseofulvin Антигрибковое Penicillum sp.

Mitomycin C Противоопухолевое Streptomices sp.

Natamycin Консервант продуктов Streptomices sp.

Nisin Консервант продуктов Lactococcus sp.

Penicillin G Антибактериальное Penicillum sp.

Rifamicin Противотуберкулезное Nocardia sp.

Streptomicin Антибактериальное Streptomices sp.

Tetraciyclin Антибактериальное, Streptomices sp.

Антиамебное В последние годы возникла проблема, связанная с повышением устойчивости бактерий к антибиотикам. Установлено, что факторы устойчивости расположены в плазмиде и могут легко передаваться от одной бактерии к другой. Открытие этого феномена послужило основой для разработки метода переноса генов, который широко используется в генетической инженерии.

Применение методов генетической инженерии позволило получить новые штаммы-продуценты с высокой продуктивностью, лучшей стабильностью и дало возможность синтезировать новые антибиотики. Эти модификации позволили снизить себестоимость антибиотиков. В настоящее время в их производстве используются танковые реакторы с перемешиванием, работающие в аэробных циклических условиях. Одним из путей получения новых антибиотиков считается их постсинтетическая химическая модификация.

Практика показывает, что поиск новых антибиотиков необходимо проводить постоянно, поскольку бактерии очень быстро приобретают устойчивость к ним. Например, производство нового антибиотика Zyvox было налажено в 2000 году, а первые стойкие к нему штаммы бактерий появились уже через год.

Наиболее актуальные задачи, связанные с разработкой, производством и применением антибиотиков:

– создание и разработка способов преодоления антибиотикорезистентности микробов;

– изыскание природных и создание полусинтетических антибиотиков, эффективных в борьбе со стафилококковой, синегнойной и другими инфекциями;

– поиски других видов организмов – продуцентов антибиотиков;

– получение новых антибиотиков путем направленного биосинтеза и подбора соответствующих мутантов и рекомбинантов.

Стимулом к дальнейшим исследованиям являются два основных фактора – большое значение антибиотиков в медицине и ветеринарии и низкая стоимость сырья, идущего на их изготовление. Эта отрасль производства в отличие от других не испытывает конкуренции со стороны химического производства. Однако проблемы, отмеченные выше, вынуждают изыскивать новые подходы в борьбе с инфекционными болезнями. Одним из наиболее перспективных путей в борьбе с некоторыми заболеваниями можно считать создание и широкое применение пробиотиков. Большая часть пробиотиков, используемых в настоящее время, создана на основе бактерий рода Bacillus.

Ферменты. Ферменты очень широко используются в биотехнологии в качестве инструментов для осуществления тонкого химического органического синтеза, в легкой, пищевой и фармацевтической промышленности, а также в генноинженерных исследованиях. В большинстве случаев получение ферментов – это аэробный процесс.

Их выгоднее получать микробиологическим путем, чем выделять из растительного или животного сырья.

Особенности получения ферментов:

– тщательное соблюдение стерильности, так как они при производстве в отличие от спиртов, кислот и антибиотиков не подавляют постороннюю микрофлору;

– биосинтез ряда ферментов подавляется катаболитами, (например глюкоза ингибирует синтез -амилазы);

– большую опасность представляют протеазы, так как они гидролизуют ферменты, большинство из которых являются белками.

В качестве примеров использования ферментов в медицине можно привести следующие: урокиназа, которая продуцируется культурой клеток, ее используют для разрушения тромбов; супероксиддисмутаза синтезируется бактериями и применяется для лечения ишемической болезни сердца; стрептокиназа синтезируется бактериями, способна превращать плазминоген в плазмин и поэтому применяется для разрушения тромбов.

Перспективным считается направление, связанное с получением с помощью представителя энтеробактерий Serratia marcescens высокоактивной внеклеточной эндонуклеазы, расщепляющей ДНК и РНК. Эндонуклеаза находит применение в качестве объекта и инструмента исследований, обладает противоопухолевым и противовирусным, а также ростстимулирующим действием. Методом индуцированного мутагенеза и селекции получены высокопродуктивные штаммы S. marcescens с активностью внеклеточной эндонуклеазы, превышающей активность исходного штамма в 140 раз.

Гормоны.

В зависимости от величины и структуры молекулы гормоны делят на 4 группы:

– пептидные гормоны (состоят из нескольких десятков аминокислот). Факторы гипоталамуса, гормоны гипофиза, щитовидной железы, пищеварительного тракта — холецистокинин, поджелудочной железы — инсулин;

– гормоны роста и пролактины (от 170-190 аминокислот), например соматотропин;

– гликозилированные (состоят из двух субъединиц). Лютеонизирующий, фолликулостимулирующий и тиреотропный гормоны;

– стероидные гормоны-глюкокортикоиды (кортизон, гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон и др.), которые применяются при заболеваниях крови, таких как гемолитическая анемия, острый лейкоз и др.; иммуносупрессии, снижая отторжение органов и тканей; аллергии – астма, экзема и др.; аутоиммунных заболеваниях — ревматоидный артрит, системная красная волчанка.

Первыми генами человека, для которых была определена последовательность нуклеотидов и клонированными в микроорганизмы, были гены, кодирующие гормоны инсулин и соматотропин, а также интерферон, имеющие важное терапевтическое значение.

Инсулин. В мире миллионы людей нуждаются в регулярном введении инсулина для того, чтобы избежать летального действия диабета. Долгое время для этих целей использовали инсулин, экстрагированный из поджелудочных желез свиней и крупного рогатого скота.

Такие препараты обладали побочным действием, поскольку они содержали различные контаминанты. В 80-х г. производство инсулина подверглось радикальному изменению. Появление рекомбинантного инсулина человека сняло проблему побочного действия и заметно увеличило рынок сбыта этого препарата, поскольку его производство не связано с забоем животных. В настоящее время почти весь инсулин производится в E. coli, в которые встроен ген, кодирующий инсулин человека. Генетически измененные дрожжи в последние годы также используются для производства инсулина. Имеются подтверждения того, что инсулин в трансгенных растениях можно получить с меньшими затратами, чем в биореакторах. Например, одна из канадских фирм сообщила, что произведенный ими в подсолнечнике инсулин дешевле более чем на 25 %. Новая технология уменьшит затраты на строительство необходимых производственных мощностей.

Соматотропин. Этот гормон крайне трудно получать из тканей животных. Для получения 0,005 грамма чистого соматотропина требовалось переработать 0,5 млн мозгов овец. Используя трансгенные бактерии, содержащие ген, кодирующий соматотропин, такое количество гормона можно получить из 9 литров бактериальной культуры. У детей гипофизарная карликовость возникает в результате дефицита гормона роста с частотой 1:5000. Получение этого гормона поможет детям, страдающим данным заболеванием. Ежегодный рынок этого препарата оценивается в 100 млн долларов США. Потенциальный рынок его сильно возрос после того как было показано, что соматотропин может способствовать наращиванию мышечной массы нормальных (не больных) индивидуумов и теперь применяется с этой целью некоторыми атлетами. Было также показано, что регулярное введение этого гормона улучшает самочувствие у людей пожилого возраста.

Витамины. Витамин В2 (рибофлавин) получил свое название от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита. Широко распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами и бактериями. Продуцентами витамина являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes, Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, C. flaveri), микроскопические (Ashbya gossypii) и плесневые грибы (Aspergillus niger). Промышленное получение рибофлавина осуществляется химическим, микробиологическим или комбинированным методом: при этом синтезированная микроорганизмами рибоза химически трансформируется в В2. Животные, не синтезирующие этот витамин, должны получать его вместе с кормом. Препараты рибофлавина используют в медицине для лечения ряда заболеваний. Для медицинских целей микробиологический рибофлавин получают на основе гриба Aspergillus. В последние десятилетия бурно развивается микробиологическое производство витамина В2 путем культивирования микроскопического гриба Eremothecium ashbyii, которое успешно конкурирует с его химическим синтезом.

Витамин В12 – (-5,6-диметилбензимидазол)-цианкобаламин – это полимер сложного строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и микроорганизмов. Микробиологический синтез является единственным способом получения данного витамина. Способность к синтезу данного витамина широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин В12 Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры метанообразующих бактерий.

Эргостерин (эргоста-5,7,22-триен-3-ол) является исходным продуктом производства витамина D2 и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи и плесневые грибы.

Для получения кристаллического -каротина в промышленном масштабе используется низший гриб Blakeslea trispora, характерной особенностью которого является способность к сверхсинтезу целевого продукта.

Интерфероны. В 1957 году были открыты вещества, образующиеся в организме, которые могут действовать против вирусов, делая тем самым клетки устойчивыми к ним. Эти вещества были названы интерферонами. Многие вирусы могут индуцировать их синтез в клетках in vitro и являются чувствительными к ним. Получение интерферонов в достаточных количествах довольно проблематично, поскольку они образуются в клетках в очень небольших количествах и поэтому их невероятно сложно отделить от других клеточных белков.

Интерфероны являются гликопротеинами и играют большую роль в контролировании многих типов вирусных инфекций.

Многие типы интерферона охарактеризованы для отдельных видов животных:

мышиный интерферон будет действовать только в клетках мыши, но не человека и наоборот. Более того, различные ткани одного и того же вида животного производят различные интерфероны.

Имеется несколько источников получения интерферона. Диплоидные фибробласты человека, культивируемые in vitro. В- и Т-лимфоциты синтезируют имунный интерферон. Его противоопухолевая активность в 50-100 раз выше, чем других интерферонов. Ген, кодирующий интерферон фибробластов человека, может быть встроен в плазмиду бактерий таким образом, что они будут синтезировать интерферон, который затем можно экстрагировать и очистить.

Лимфокины. Лимфокины это белки, продуцируемые лимфоцитами (клетки иммунной системы организма). Они являются необходимыми компонентами иммунной реакции и способны усиливать борьбу иммунной системы с инфекционными или онкологическими болезнями.

Таким образом, лимфоцитарные противораковые вещества — интерлейкин 1 и 2 являются факторами иммунитета. Их получают из лимфоцитов, фибробластов (диплоидные клетки), а также с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

Большинство других фармацевтических препаратов, полученных с помощью биотехнологии, представляют собой вещества, выделенные из источников биологического происхождения. При этом они могут быть использованы после химической модификации или без неё. Методы молекулярной биологии, генетической и клеточной инженерии играют в настоящее время основную роль в открытии, дизайне и производстве препаратов. Можно привести несколько примеров получения фармацевтических препаратов с помощью современной биотехнологии. РНКазы бактерий находят широкое применение в биохимии и молекулярной биологии в качестве инструментов генетической инженерии и являются объектом биотехнологического производства, кроме того, они обладают противовирусными свойствами.

Из других микроорганизмов широко используются дрожжи. Источником сырья для получения дрожжевой РНК служат кормовые дрожжи, как правило рода Candida, выращенные на различных субстратах и содержащие не менее 7 % компонентов нуклеотидной природы. Дрожжевая РНК представляет собой смесь полирибонуклеотидов разных молекулярных масс. Ее натриевая соль – нуклеинат натрия находит применение в медицине при лечении широкого круга заболеваний, а технический продукт РНК-концентрат используется в производстве нуклеозидов и мононуклеотидов. Представляют также интерес некоторые основания нуклеиновых кислот, применяемые в современной биотехнологии в виде ростовых факторов (аденин и его производное кинетин) или в технологиях тонкого органического синтеза при получении фармакопейных препаратов (например, ацикловира на основе гуанина).

Сравнительно недавно разработан биотехнологический метод получения тимидина, который является сырьем для производства лекарственного препарата азида тимидина, применяемого для лечения СПИДа путем ингибирования роста ВИЧ. Этот способ представляется более выгодным с экономической и экологической точек зрения в сравнении с методами химического синтеза и ферментативного гидролиза ДНК, используемыми ранее в промышленности.

Многие физиологически активные вещества получают из растительного сырья. Более 25 % лекарственных препаратов изготовлены на основе соединений растительного происхождения. Так, элеутерококк колючий Eleutherococcus senticosus (синонимы-свободноягодник, дикий перец, колючий перец, чертов куст) – кустарниковое растение из семейства аралиевых, распространен главным образом в кедровошироколиственных и темнохвойных лесах малодоступных районов Сихоте-Алиня, используется для получения экстракта, который обладает ярко выраженным адаптогенным действием: повышает умственную и физическую работоспособность, увеличивает резистентность к вредным воздействиям физической, химической и биологической природы. Физиологически активными веществами элеутерококка, обусловливающими его биологическую активность, являются гликозиды.

Продукты вторичного метаболизма растений также широко используются в медицине. При лечении аритмии сердца используют препарат аллапинин, действующим началом которого является дитерпеновый алкалоид лаппаконитин, который получают из аконита белоустого. С целью увеличения сырьевой базы для производства аллапинина проводятся исследования другого вида аконита – борца северного.

Биополимеры (БП). В настоящее время в медицине все большее внимание уделяется полимерам биологического происхождения. Это объясняется их разнообразием, уникальностью свойств, а также тем, что методы биотехнологии в отличие от традиционных химических позволяют получать экологически чистые материалы. Кроме белков и нуклеиновых кислот, особого рассмотрения заслуживают микробные термопластичные поли (3-оксиалканоаты) – полимеры 3-оксинасыщенных жирных кислот. Наиболее изученным считается полиоксибутират – гомополимер D-(3)-оксимасляной кислоты, служащий запасным энергетическим соединением, которое синтезируют прокариоты в специфических условиях роста. Эти БП обладают механофизическими свойствами, близкими к полиэтилену и полипропилену, а также рядом специфических свойств – биодеградируемостью, совместимостью с тканями человека и животных, пьезоэлектрическим эффектом и другими полезными свойствами. Они успешно используются в медицине, в частности, в хирургии (прочный рассасываемый хирургический материал, элементы для остеосинтеза, сосудистой пластики, пленочные покрытия ран и ожоговых поверхностей, одноразовые изделия, в том числе нетканые материалы), фармакологии (пролонгация действия лекарственных веществ). В последние годы идентифицированы новые биополимеры этого класса, обладающие термопластичностью и биодеградируемостью – гетерополимеры, включающие в различных соотношениях и вариантах мономеры 3-оксинасыщенных жирных кислот (оксимасляной, оксивалериановой, оксигексановой, оксиоктановой и др.).

В настоящее время проводится активный поиск новых продуцентов БП, оптимизируются условия их ферментации, изучаются свойства полученных на их основе материалов.

Вакцины и диагностические препараты. Способность стимулировать выработку антител с помощью вакцин известна давно. Вакцины являются препаратами убитых (инактивированных) микроорганизмов (или их отдельных антигенов), живыми ослабленными (аттенуированными) микроорганизмами, которые могут стимулировать в организме человека или животных иммунитет к инфекционному заболеванию. Таким образом, они имитируют инфекционный агент и без патогенных последствий при введении в организм вызывают протективный иммуннный ответ. Основной целью исследований, связанных с разработкой вакцин нового поколения, являются идентификация и характеристика индивидуальных антигенов инфекционного агента, которые индуцируют защитный иммунный ответ. Применение субъединичных вакцин, состоящих из высокоочищенных компонентов вириона, считается более безопасным, чем традиционных убитых или живых аттенуированных вакцин. Однако такие вакцины часто оказываются менее иммуногенными. Накопленная в последние годы информация о молекулярных механизмах презентации антигенов позволяет нивелировать эти недостатки, моделировать вакцинный процесс, избирательно активируя разные отделы иммунной системы путем использования адъювантов с различными механизмами действия, выбора антигена определенной степени полимеризации, включения в состав вакцины тех или иных цитокинов.

В настоящее время разработаны вакцины различных типов против многих инфекционных болезней.

Против некоторых болезней, вызываемых вирусами, разрабатываются вакцины с помощью технологии рекомбинантных ДНК – против гриппа, полиомиелита, гепатита, герпеса и др.

Проводятся исследования по получению различных вакцин против инфекционных болезней человека и животных, в том числе и с использованием растений в качестве продуцентов антигенов.

Интенсивные исследования проводятся в направлении создания некоторых бактериальных вакцин, а также вакцин против паразитарных заболеваний. Малярия остается одним из наиболее опасных заболеваний в мире. Это сложная и неотложная проблема, возможно, будет решена в ближайшем будущем. Против некоторых инфекционных болезней разрабатываются ДНК-вакцины.

Биотехнологическими предприятиями выпускается большое разнообразие иммунодиагностических и ДНК-овых наборов для диагностики. В последние годы большая часть иммунодиагностических наборов приготовлена не на основе поликлональных сывороток, а с использованием моноклональных антител (МАт).

Применение моноклональных антител (см.Ч.I). Моноклональные антитела (МАт) примененяются для диагностики онкогенных и инфекционных заболеваний в качестве лечебных препаратов для создания пассивного иммунитета и т.д. Для диагностики МАт наиболее широко используются в сочетании с иммуноферментным анализом (ИФА).

В настоящее время производится несколько коммерческих препаратов на основе МАт. Препарат Infliximab (Remicade) считается перспективным при некоторых болезнях воспалительного характера, таких как ревматоидный артрит.

МАт, соединенные с токсинами, используются для избирательной химиотерапии, поражая раковые и не действуя на нормальные клетки. Их можно применять против отторжения трансплантатов, направляя на специфические иммунные клетки, участвующие в этом процессе, без нарушения функций других клеток иммунной системы.

В качестве примера таких препаратов можно привести MuromomabCD3. Модифицированная версия ингибировала аутоиммунное разрушение бета-клеток при сахарном диабете 1-го типа. МАт препарата Daclizumab (Zenapax) связываются с некоторыми рецепторами интерлейкина-2. Он используется для предотвращения отторжения трансплантированных почек. Кроме того, он эффективен при лимфоме T-клеток.

Кроме этого МАт применяются в качестве высокоспецифичных лекарственных препаратов.

Omalizumab (Xolair) связывается с IgE и предотвращает их взаимодействие с тучными клетками. Препарат применяется против астмы аллергической природы.

МАт исползуются для уничтожения или ингибиции роста раковых клеток. Rituximab (Rituxan) связывается с молекулой CD20, которая обнаружена на большинстве B-клеток и используется для лечения лимфомы B-клеток.

Препарат Tositumomab (Bexxar) является конъюгатом МАт против CD20 и радиоактивного иода изотопа 131. Был одобрен для лечения лимфомы.

Trastuzumab (Herceptin) связывается с рецептором HER2 эпидермального фактора роста, найденного при некоторых видах рака молочной железы и лимфомах.

Cetuximab (Erbitux) блокирует HER1 другого рецептора эпидермального фактора роста. Был одобрен для лечения рака толстого отдела кишечника.

Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) – конъюгат МАт к CD33, антигену, находящемуся на поверхности клетки и экспрессируемому раковыми клетками при острой миелогенной лейкемии, и калихемицина – комплекса олигосахарида, разрушающего двунитевые ДНК. Препарат является первым иммунотоксином, с которым получены хорошие результаты в борьбе против рака.

Alemtuzumab (Campath) связывает молекулу CD52, найденную на лимфоцитах, и позволяет излечивать хроническую лимфоцитарную лейкемию в течение 18 месяцев.

Некоторые препараты на основе МАт используют в качестве ингибиторов ангиогенеза. Bevacizumab (Avastin) блокирует рецептор фактора роста эндотелия сосудов. Был одобрен для лечения толстого отдела кишечника.

Препарат Abciximab (ReoPro) ингибирует агрегацию тромбоцитов, взамодействуя с рецепторами на их поверхности, которые в норме связываются фибриногеном. Этот препарат предотвращает блокирование коронарных артерий у пациентов, которые подверглись ангиопластике.

МАт погут быть получены на мышах, но будучи введенными в организм человека распознаются иммунной системой, что часто приводит не только к их элиминации без терапевтического эффекта, но и вызывает повреждение почек. Для решения этой проблемы ученые использовали химерные (человек - мышь) антитела. При этом вариабельная часть антитела была взята от мыши, а константная – от человека. Препараты Infliximab, Rituximab и Abciximab являются примерами использования таких антител. Кроме того, можно брать не всю вариабельную область мышиных антител, а только аминокислоты, участвующие в связывании антигена, а остальную часть взять от молекулы антигена человека, заменив в антителе только гипервариабельную область. Такие антитела включены в состав коммерческих препаратов Zenapax, Vitaxin, Mylotarg, Herceptin и Xolair.

Концепция направленной доставки лекарственных средств клеткам и тканям-мишеням, способная разрешить проблемы неспецифического воздействия различных терапевтических препаратов на нормальные ткани, стала предметом широкого экспериментального изучения после разработки гибридомной технологии. В первую очередь реализация этих идей была направлена на лечение онкологических больных в связи с тем, что именно в этой области традиционные химиотерапевтические и радиотерапевтические средства оказывают мощное повреждающее воздействие и на нормальные клетки. Интенсивное развитие гибридомной технологии привело к получению большого количества высокоспецифичных МАт против маркерных антигенов на поверхности клеток, которое сопровождалось не менее интенсивными исследованиями возможности использования их для избирательной элиминации популяций клеток-мишеней. В настоящее время достигнут значительный прогресс в создании цитотоксических фармакологических агентов направленного действия - иммунотоксинов, т.е. конъюгатов антител с токсинами растительного или бактериального происхождения.

1.2. Использование трансгенных растений и животных в медицине В настоящее время многие биофармацевтические препараты производятся методом генетической инженерии в клетках млекопитающих, растений, бактериях или классическим методом – микробной ферментацией. Однако с получением трансгенных животных (см.Ч.1) становится возможным получать некоторые белки человека, перспективные для фарминдустрии, включая тканевой активатор плазминогена, фактор свертывания крови и т.д., в молочных железах нескольких видов животных, таких как мыши, кролики, овцы, коровы и свиньи. У этих животных необходимые препараты накапливаются в молоке.

У некоторых людей, больных гемофилией, отсутствует агент свертывания крови, называемый коагулирующим фактором IХ. Был сконструирован ген, кодирующий этот белок, и успешно встроен в геном овец. Этот ген экспрессируется, хотя и в незначительной степени, и наследуется потомством.

В 2006 г. были получены трансгенные свиньи путем встраивания гена "жир-1". Ген был взят от нематоды Caenorhabditis elegans. У 6 из 10 полученных клонов свиней экспрессировались высокие уровни омега- 3 жирных кислот, полезных для профилактики сердечнососудистых заболеваний.

Потенциал трансгенных животных, которые могут секретировать различные коммерчески важные для медицины продукты, не ограничен и будет реализован в будущем. Основным преимуществом данной системы является то, что синтез проводится в организме млекопитающих, это обеспечивает посттрансляционную модификацию сложных белков человека, необходимую для проявления их биологической активности. Такая модификация не может быть достигнута в бактериальных системах. Пока еще нет коммерческого производства, работа в настоящее время проводится в направлении повышения выхода целевых продуктов. Процесс экспрессии не наносит вреда животному, которое продолжает давать молоко как обычно. Нет сомнения в том, что этот путь станет одним из основных при получении ряда белков, необходимых человеку. В качестве примера можно привести некоторые американские компании, которые могут в настоящее время производить гемоглобин человека в крови трансгенных животных и на его основе готовить заменитель крови человека, который может иметь огромный спрос. Каждый год в мире делается 70 млн переливаний крови общей стоимостью 10 млрд долларов США. Такой кровезаменитель будет свободным от многих патогенов человека таких, например, как ВИЧ и будет исключена необходимость определения группы крови перед его введением, поскольку он не содержит красных клеток крови (эритроцитов). Однако предстоит провести дополнительные исследования, прежде чем данная технология будет применяться на практике.

Важным направлением можно назвать использование трансгенных животных в качестве доноров органов и тканей, необходимых для трансплантации. Почти четверти миллиона людей продлена жизнь благодаря пересадке органов. По статистическим данным в настоящее время в экономически развитых странах около 150 000 человек нуждаются в пересадке донорских органов и тканей. Мировая потребность в трансплантации может оказаться значительно большей.

По сравнению с 1988 г. она повысилась вдвое и продолжает ежегодно увеличиваться на 15 %. Одним из перспективных путей решения этой проблемы считают разработку метода пересадки человеку органов и тканей от животных (ксенотрансплантация). Естественным было бы считать, что ближе всего к нам стоят человекообразные обезьяны, однако число животных этого вида ограничено и их трудно разводить в неволе. Не последнюю роль играет этическая сторона вопроса, связанная с необходимостью убивать их с целью получения органов, и, наконец, невозможность полностью обезопасить реципиента от инфекционных заболеваний заставляет искать донора органов для человека среди животных другого вида. Как оказалось, таким животным может стать свинья, имеющая определенное анатомическое и физиологическое сходство с человеком. Некоторые биотехнологические компании работают над созданием свиней, с геном гистосовместимости человека. Предполагается, что эта технология завоюет огромный рынок. В настоящее время основным лимитирующим фактором является получение большого числа трансгенных животных.

Одним из путей использования трансгенных растений в медицине и ветеринарии – это получение вакцин. Для этого в растение встраивают гены, кодирующие белки возбудителей инфекционных болезней, индуцирующих выработку нейтрализующих антител. В настоящее время получены генетически модифицированные картофель, томаты, подсолнечник, салат, табак, рис и другие растения. Если будущие клинические испытания пройдут успешно, то появятся «съедобные» вакцины, которые будут играть важную роль в борьбе с инфекционными болезнями, особенно в развивающихся странах. Их преимущество состоит в том, что трансгенные растения могут быть выращены повсюду с применением сравнительно дешевой технологии. Изготовленные с их помощью вакцины позволили бы избежать материально-технических проблем, связанных с транспортировкой вакцин на большие расстояния и созданием холодовой цепи, необходимой для большинства обычных вакцин. И так как они съедобны, они не будут нуждаться в шприцах, которые не только создают дополнительные материальные затраты, но также в случае их контаминации могут быть источником инфекций. Однако возникает другая проблема, связанная с тем, что в желудочно-кишечном тракте антигены расщепляются. Это затрудняет получение желаемого эффекта.

1.3. Генотерапия Несомненно, основным достижением генетической инженерии человека является терапия генов. Она дает возможность лечить болезни путем переноса и экспрессии генетического материала в клетки пациента с целью восстановления нормальной функции клеток. Основная цель терапии генов – корректировка отдельных дефектов гена (мутаций), например при кистозной болезни и гемофилии (табл. 1.2), которые могут наблюдаться в семьях согласно законам наследственности Менделя. Очевидно, что многие сотни подобных болезней можно лечить, корректируя дефекты гена. В настоящее время нет эффективного лечения генетических болезней, но терапия генов может дать надежду большому количеству людей. Исправление дефектов соматических клеток при таких болезнях, как, например, болезнь Паркинсона, рак и многих других является трудной задачей, которая будет решена нескоро, поскольку происходит нарушение ряда генов.

Геном человека содержит около 100 000 генов, включающих около 3х109 нуклеотидов.

Выполнение программы «Геном человека», кроме определения последовательности нуклеотидов всего генома дало возможность провести его картирование с целью получения:

– генетической карты с относительным расположением генов;

– физической карты, дающей информацию по истинному положению генов.

Таблица 1.2 Некоторые генетические болезни человека Мишень Частота Болезнь (орган, клетки) встречаемости Талассемия (эритроб- Костный мозг 1:600 в некоторых ластическая анемия) популяциях

–  –  –

Терапия генов включает несколько этапов. Она основана на методах современной биотехнологии. Для ее выполнения следует доставить с помощью вектора ген (ДНК) к специфическим клеткаммишеням; поместить его в клетки, обычно это делается путем эндоцитоза; провести транскрипцию и трансляцию гена в составе вектора и получить продукт терапевтического гена. Для этого требуется полное понимание механизмов, с помощью которых дефектный ген влияет на индивидуум, необходима возможность выключения и замены его нормальной копией. Имеется как минимум два вида терапии генов. В первом виде мишенью будут соматические, а во втором половые клетки, или оплодотворенная зигота. Во втором случае генетические изменения передаются по наследству. Для обоих случаев имеется ряд нерешенных вопросов, в том числе и этического характера.

Биотехнология ускоряет производство и скрининг новых препаратов, а также помогает более точно объяснить их действие в организме человека и животных. Она заметно снижает стоимость новых препаратов, которая складывается из стоимости открытия, разработки, масштабирования, клинического испытания препарата и оформления документации необходимой для его применения.

Контрольные вопросы

1. Какие виды препаратов для лечения и профилактики можно получить с помощью биотехнологии?

2. С какой целью получают трансгенных животных и растений в медицине?

3. Применение МАт в медицине.

4. Каковы основные отличия антибиотиков от пробиотиков?

5. Терапия генов и перспективы её применения в медицине.

6. Какой вклад вносит биотехнология в развитие диагностики, лечения и профилактики болезней?

Лекция 2. БИОТЕХНОЛОГИЯ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ

Эффективность сельскохозяйственных технологий зависит от многих факторов, включая экологогеографические, экономические, и от возобновляемых биологических ресурсов, таких как культурные растения, домашние животные и т.д. Повышение продуктивности в сельском хозяйстве зависит также от активных исследований с помощью комплекса различных биологических наук. Вклад биотехнологии в развитие и повышение эффективности традиционных сельскохозяйственных технологий постоянно возрастает. Стремительно растущий объем производства биотехнологической продукции растениеводства превысил 5 млрд долларов. В настоящее время особые перспективы в создании и распространении новых культивируемых сортов растений и пород животных имеют новейшие методы биотехнологии – клеточная и генетическая инженерия. Биотехнологические методы направлены на увеличение количества и улучшение качества продукции за счет повышения устойчивости биологических видов к неблагоприятным условиям внешней среды, вредителям и патогенам.

2.1. Биотехнология в животноводстве Животноводство во всем мире дает основные продукты питания.

В промышленно развитых странах для получения продуктов животноводства используются интенсивные технологии. Продуктивность животных зависит от их породы, условий содержания и ряда других факторов.

На ранних этапах развития животноводства у животных выявляли полезные свойства и пытались закрепить их у потомства. Благодаря обычной селекции и разведению получены высокопродуктивные породы сельскохозяйственных животных. Дальнейшее увеличение продуктивности с помощью традиционных приемов часто не дает желаемых результатов. Селективное разведение, особенно крупных животных, трудоемкий и медленный процесс, поскольку они имеют длинный период генерации. В связи с этим получение желаемых фенотипических изменений может растянуться на много лет, поэтому постоянно продолжается поиск других путей получения животных с нужными свойствами. Разработка методов технологии рекомбинантных ДНК и ее применение к программам разведения животных может значительно увеличить скорость и расширить возможности селективного разведения.

Трансгенные животные. Несколько лет назад многие ученые склонялись к мысли, что обновление генотипа сельскохозяйственных животных путем применения методов генетической инженерии не даст выигрыша во времени по сравнению с традиционным скрещиванием, так как для передачи определенного признака необходимо перенести группу или даже несколько групп генов. Первым примером переноса чужеродных генов в организм животного с помощью технологии рекомбинатных ДНК было встраивание в геном мыши гена гормона роста крысы. Полученное от такой мыши потомство было значительно крупней, чем их родители. “Супермышь” привлекла большое внимание общественности, поскольку это была первая удачная попытка получения трансгенного животного, т.е. животного, которое получило новый генетический материал искусственным способом. Впоследствии велись длительные дискуссии об экономическом потенциале трансгенных сельскохозяйственных животных, однако в настоящее время нет сомнения, что это направление является перспективным и сулит большие выгоды всему человечеству. В то же время, как указано в лекции 8, это одна из наиболее спорных областей современной биотехнологии.

Хотя не всегда опыты по получению трансгенных животных заканчивались положительным результатом, однако в последние годы это направление успешно развивается:

1) в сельском хозяйстве для повышения устойчивости животных к различным заболеваниям, что приведет к увеличению количества и улучшению качества продуктов сельского хозяйства;

2) как источник органов для трансплантации (в результате активности в них генов человека органы таких животных после трансплантации вызывают меньше вредных последствий);

3) как живые биореакторы для производства необходимых белков;

4) для тестирования вакцин и оценки токсичности, канцерогенности и мутагенности разных веществ;

5) для научных исследований, например, для расшифровки функционирования различных генов у разных видов животных.

Из перечисленных выше направлений самым необычным и коммерчески более перспективным считается проект, предусматривающий использование некоторых лактирующих животных, таких как коровы, овцы, свиньи и кролики, для получения в их молоке белков человека или животных, которые можно затем выделять и использовать в качестве фарм- и биопрепаратов. Общественность и контролирующие ведомства в настоящее время относятся к пищевым продуктам, полученным из генетически модифицированных организмов (ГМО), менее настороженно, чем раньше. Недоверие к продуктам, полученным с использованием генноинженерных манипуляций, возникло прежде всего из-за отсутствия стопроцентной гарантии того, что вводимые в растения гены не вызовут появления в их организме потенциально вредных для человека веществ. В отношении животных такие опасения считались менее обоснованными, так как наличие таких веществ, скорее всего, отразилось бы на состоянии здоровья животных, поскольку они генетически более близки человеку, чем растения. К другим опасениям, связанным с трансгенными животными, можно отнести следующие: 1) в них могут содержаться физиологически активные вещества, попадание которых в пищу нежелательно (например, гормоны, стимулирующие рост, лактацию и др.); 2) они могут "случайно" передать гены нетрансгенным сородичам; 3) некоторые опасения вызывало использование в качестве векторов ретровирусов. Все эти и другие нежелательные возможные последствия должны быть изучены и, если они реальны, исключены или хотя бы сведены к минимуму.

После получения трансгенных животных необходимо убедиться в том, что чужеродная ДНК стабильна и наследуется по меньшей мере некоторыми родившимися потомками. Главным моментом является доказательство того, что ген хорошо регулируется и функционирует в новом для него организме.

В отношении трансгенных растений в настоящее время общественность также склоняется к более рациональному и оптимистичному подходу, поскольку состав вводимого генетического материала всегда точно известен. Несомненно, мутации, включая делеции, вставки и генетические перестройки, могут возникнуть при введении генов в реципиентный геном, и именно они могут оказаться потенциально опасными. Теоретически такая возможность не исключена. Однако необходимо помнить, что разнообразные перестройки в геноме животных и растений происходят в их организме в течение десятилетий и без всякого вмешательства человека. При этом изменения, приводящие к выработке токсичных или других вредных для окружающих соединений, имеют место только при значительном селективном давлении. В растениеводстве и животноводстве таких случаев не было отмечено.

Трансгенные свиньи, овцы и коровы в настоящее время уже получены, хотя частота успеха равна всего около 1% по сравнению с 2-5 % для мышей. Такая низкая эффективность сдерживает широкое получение и использование трансгенных животных. Однако с яйцеклетками рыб, которые, как известно, оплодотворяются во внешней среде, выпадает несколько этапов, которые необходимо проводить при работе с млекопитающими, в частности, выделение яйцеклеток, оплодотворение их, а затем введение эмбрионов в суррогатную мать, эффекивность достигает 70 %.

Знание механизмов, регулирующих экспрессию гена у высших животных, недостаточны и это ограничивает возможности получения трансгенных животных.

Огромные перспективы использования трансгенных животных ожидаются в медицине (см. лекцию 1). В сельском хозяйстве основной целью получения трансгенных животных является введение специфических, экономически важных признаков, которые принесут пользу человеку.

За последние несколько лет контролирующие ведомства западных стран получили большое количество заявок от различных фирм на получение разрешения производить пищевые продукты с использованием методов генетической инженерии. Начало было положено исследованиями физиолого-биохимического состояния свиней, получивших рекомбинантный гормон роста. В отличие от знаменитой супермыши свиньи, в эмбриональные клетки которых вводили ген соматотропина, не вырастали до необычных размеров, а имели развитую мышечную ткань, что отвечало запросам потребителей. К сожалению, введение генов соматотропина приводило к ощутимому эндокринному сдвигу у животных. Свиньи страдали диабетом, бесплодием и другими заболеваниями. Эти последствия можно отнести к разряду технических проблем, но сам метод следует считать многообещающим в применении трансгенных животных для сельского хозяйства.

Применение гормонов в животноводстве. Гипофиз животных секретирует гормон роста, который оказывает большое влияние на их рост, а у лактирующих животных на образоание молока. В 80-х годах ген, ответственный за выработку соматотропина КРС, был успешно выделен и встроен в бактериальную клетку с целью получения гормона в больших количествах. При введении коровам 30 мг такого гормона значительно увеличивался надой молока (10 – 30 %), но продолжительность его действия зависела от регулярных инъекций. Такой эффект наблюдали у нескольких видов животных. Повышенного содержания соматотропина в молоке не было обнаружено и оно не изменялось ни по каким параметрам. Применение соматотропина в США в ноябре 1993 года явилось первым примером использования биотехнологически полученного коммерческого препарата, предназначенного для сельскохозяйственных животных. В результате проверки было показано, что соматотропин КРС оказался безопасным препаратом и в настоящее время применяется во многих странах, в частности в США, где он продается фирмой “Vonsanto” под торговым названием “Posilac”. Но многие потребительские организации выступают против использования данного подхода. Что касается здоровья животных, установлено, что у трансгенных свиней, которым введен ген соматостатина, ССТ, обнаружили патологию в скелете, а у коров участилось заболевание маститами. Это было объяснено тем, что полученные препараты были плохо очищены. Тем не менее, полученные результаты дискредитировали данное направление биотехнологии в глазах общественности. Появилось мнение, что биотехнологические продукты не дают прибыли и нет необходимости их применять. Однако важно то, что в этих экспериментах была показана возможность применения достижений биотехнологии для увеличения продукции сельского хозяйства.

Ветеринарные препараты. Биопрепараты – средства биологического происхождения, применяемые в медицине и ветеринарии для диагностики, профилактики и лечения неинфекционных, инфекционных и паразитарных болезней человека и животных. Важным направлением биотехнологии стала разработка биопрепаратов, их производство и применение. Возбудители инфекционных болезней вызывают заболевание всех видов сельскохозяйственных животных и растений. Если количество больных животных будет уменьшено или болезнь ликвидирована, то возрастет производство сельскохозяйственной продукции. Кроме того, биопрепараты необходимы также для домашних и диких животных.

Одним из видов биопрепаратов являются вакцины. Их производят с применением различных технологий и используют для создания у животных активного иммунитета. В настоящее время разработаны вакцины против многих инфекционных болезней животных. Обычно их применяют с профилактической (вакцинопрофилактика) и реже лечебной (вакцинотерапия) целями. Наиболее широко применяется вакцинопрофилактика против бактериальных (сибирская язва, бруцеллез, рожа свиней, сальмонеллезы и др.) и вирусных (бешенство, классическая чума свиней, чума плотоядных, ящур и др.) болезней.

Ведется интенсивная разработка вакцин против инфекционных болезней животных с применением генноинженерных методов на основе мутантов и рекомбинантов возбудителей и ДНК-вакцин. Это еще раз подчеркивает важную роль биотехнологии в борьбе с инфекционными болезнями сельскохозяйственных, домашних и диких животных.

Методы диагностики. Кроме классических вирусологических, серологических и иммунологических методов, в настоящее время применяются несколько новых, предложенных биотехнологией, методов, а именно: иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и др. Эти методы революционизируют многие аспекты анализа и дают возможность проводить определение in situ без применения сложных процедур выделения анализируемого вещества.

Кроме того, они легче поддаются автоматизации и более быстро выполняются.

Для успешного применения методы должны быть быстрыми, точными и надежными; простыми в выполнении и дешевыми; использовать готовые и стабильные реагенты; требовать небольших затрат труда; иметь высокую чувствительность и специфичность.

Обычно эти требования очень трудно совместить. Многие из методов уже применяются или проходят испытание с целью обнаружения возбудителей болезней растений и животных, а также мониторинга физиологического cостояния животных. Почти во всех случаях они были разработаны вначале для использования в медицине и очень быстро нашли применение в ветеринарии. Одновременно с этим увеличивается их применение в растениеводстве. ИФА в комплексе с поликлональными и особенно МАт широко используется не только для диагностики, но и для выявления нежелательных примесей в продуктах питания. Метод зондов нуклеиновых кислот основан на принципе гибридизации комплементарных последовательностей ДНК или РНК, ПЦР – на амплификации ДНК (см. Ч.I).

Использование этих методов диагностики позволяет обнаруживать инфекционные заболевания на очень ранней стадии заражения, например путем анализа физиологических жидкостей, что дает возможность выявлять больное животное еще до проявления клинических признаков. Ранняя диагностика значительно облегчает ликвидацию того или иного заболевания. Многие болезни животных можно легко контролировать путем использования наборов (китов) ветеринаром или даже фермером. Широкое применение наборы находят при определении половых гормонов (таких как прогестерон, эстрогенсульфат, тестостерон и др.), гормона роста и антибиотиков в молоке и крови животных. В настоящее время выпускаются сотни наименований таких наборов.

2.2. Биотехнология в растениеводстве C помощью генетической инженерии ставится задача не только улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, но и получить растения, способные производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях деятельности человека. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, «съедобные» вакцины, антитела, интерфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не загрязняющие окружающую среду, и многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления. По общему мнению, применение методов клеточной и генетической инженерии в сельском хозяйстве позволит улучшить свойства культурных растений (см. Ч.I).

2.2.1.Трансгенные растения Используя методы современной биотехнологии, гены можно вводить в растение с целью передачи ему нового признака, повышающего урожайность. Однако при решении данной задачи возникает ряд трудностей. Современные методы генетической инженерии хорошо разработаны для признаков, зависящих от одного гена.

В то же время ряд сложных признаков, таких как, например, рост контролируется несколькими генами, каждый из которых может оказывать определенное влияние. Поэтому в научном плане предстоит выяснить механизм ряда сложных процессов. Несмотря на ряд нерешенных вопросов, трансгенные растения постепенно внедряются в практику сельского хозяйства многих стран. В США ими занято наибольшее количество сельскохозяйственных угодий.

Культура растительных клеток и тканей. Растительные клетки могут культивироваться как на жидких, так и твердых средах. Используемые при этом приемы аналогичны культивированию микроорганизмов. Процесс начинают с взятия в асептических условиях кусочков ткани от молодого здорового растения, как правило, используют листья или ствол. Кусочки ткани помещают в подобранную питательную среду, содержащую необходимые для роста компоненты. После получения каллуса возможно продолжение его выращивания на твердой среде или получение суспензии клеток. Суспендированные растительные клетки по сравнению с клетками каллуса более гомогенны, быстрее растут и имеют повышенные адаптационные возможности.

Культуры растительных клеток могут быть использованы для биотрансформации химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных соединений. Основными недостатками метода считаются низкие скорости роста растительных клеток, высокая вероятность заражения и генетическая нестабильность. Кроме этого в суспензии клеток происходят их агрегация и дифференцировка, в результате чего снижается активность. Этих недостатков лишены процессы с использованием иммобилизованных растительных клеток.

Особенностью клеточных культур растений является их способность к тотипотенции (см. Ч.I), что часто используют при микроразмножении растений. Данная технология имеет существенные преимущества, так как позволяет быстро получать материал для размножения растений, не содержащий возбудителей болезней; круглогодично иметь посадочный материал и повышать его однородность; длительно хранить генетический материал и создавать новые генотипы.

Техника слияния протопластов: гаплоидные растения. Методика наиболее отработана применительно к видам семейства пасленовых. Получены парасексуальные гибридные растения в родах Nicotiana (табак), Solanum (картофель), Lucopersicum (томат), крестоцветных и зонтичных. Имеются плодовитые, фенотипически нормальные межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнепсом и стерильные межвидовые гибриды картофеля и томатов, табака и картофеля, табака и беладонны, образующие нормальные стебли и корни. Удалось получить растения, гетерозиготные по внеядерным генам – гибриды, в которых от одного родителя получено ядро, а от другого – цитоплазма. В настоящее время исследования и уровень данной технологии достигли такого состояния, при котором становится возможным практическое применение метода для улучшения ряда культурных видов растений.

Основными направлениями работ по соматической гибридизации высших растений являются гибридизация клеток как средство расширения рамок скрещивания; слияние клеток и перенос или реконструкция генов; слияние клеток с целью переноса отдельных небольших фрагментов генома. При гибридизации соматических клеток возможно получение асимметричных гибридов, что может способствовать получению более устойчивых и функционально улучшенных растений.

Генетическая инженерия растений. Исследования в области генетической инженерии растений интенсивно проводятся во многих лабораториях. При использовании новейших генетических методов при работе с высшими растениями возникают не только технические трудности. Приходится решать более сложные научные проблемы, связанные с нарушением структуры генома культивируемых растительных клеток (изменение плоидности, хромосомные перестройки).

Интенсивно исследуются структура и функции плазмидных ДНК растений и возможности их использования в качестве векторов.

Проблема создания векторов для введения чужеродной ДНК в протопласты растений считается наиболее сложной. Здесь наметились следующие подходы: 1) использование плазмид бактерий, заражающих растения в естественных условиях. При этом часть плазмиды встраивается в ядерный геном растения-хозяина и функционирует в составе его генома; 2) использование бактериальных плазмид, «сшитых» с фрагментами ДНК хлоропластов или митохондрий растений, для создания челночных векторов, способных к репликации в клетках прокариот и экспрессии в эукариотических клетках; 3) использование ДНК-содержащих вирусов растений.

Для защиты чужеродного генетического материала, вводимого в протопласты растений, от разрушающего действия нуклеаз также разрабатываются новые методы, например, ингибирование нуклеаз и создание механической защиты рекомбинантных ДНК. С этой целью можно использовать липосомы. С их помощью в клетки и протопласты эукариот введены РНК вируса табачной мозаики, еще более крупная ДНК вируса ОВ40 и Ti-плазмида Agrobacterium tumifaciens.

Надежная защита липосомами нуклеиновых кислот особенно важна при манипуляции с протопластами растений. Примером реализованного генноинженерного проекта является синтез фазеолина (запасного белка фасоли) в регенерированных растениях табака. Введение гена, кодирующего синтез фазеолина, проведено с использованием в качестве вектора Ti-плазмиды. С помощью этой плазмиды в геном растений табака внедрен ген устойчивости к неомицину. С помощью CMV-вируса в геном растений репы встроен ген устойчивости к метотрексату –ингибитору дигидрофолатредуктазы.

Генноинженерные манипуляции с растениями породили некоторые опасения, аналогичные тем, которые возникли в начале генетических манипуляций с микроорганизмами. Как уже отмечалось, опасения связаны с возможностями выхода генетических векторов и трансгенных растений из-под контроля биотехнологов. В этой связи высказываются опасения превращения генноинженерных растений в сорняки. Вероятность такого превращения очень мала и может произойти только в результате переноса нескольких генов. Однако устойчивость к гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к определенному препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду.

Кроме того, следует учитывать, что биохимические изменения растений в результате генноинженерных перестроек могут привести к утрате способности синтеза биологически полезных соединений и приобретению нежелательных признаков. Однако данная проблема существует и при традиционных методах селекции. Это выдвигает необходимость тщательного тестирования всех генноинженерных растений перед их переносом в полевые условия.

Основные пути развития генетики высших растений включают несколько направлений:

– придание растениям способности синтезировать дополнительные ценные продукты;

– повышение фотосинтетической эффективности растений;

– придание растениям диазотрофности;

– обеспечение устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды.

2.2.2. Биопестициды, биогербициды и биоудобрения Биопестициды. Использование химических пестицидов привело к заметному увеличению уровня производства продуктов сельского хозяйства. Их широкое применение привело к тому, что один человек может в настоящее время производить больше продуктов с меньшими затратами, чем раньше. Однако потребители все больше беспокоятся о качестве продуктов и возможном сохранении остатков пестицидов в готовых пищевых продуктах. Биотехнологи в настоящее время интенсивно ищут замену химическим веществам, с помощью которых можно было бы бороться с вредителями и болезнями. Очевидным подходом является использование существующих в природе биологических методов борьбы. Известно, что все организмы болеют характерными только для них специфическими болезнями, а также имеют хищников, врагов, которые их уничтожают. В данном контексте, биологические методы борьбы связаны с использованием микроорганизмов, применением их в полевых условиях для борьбы с вредителями и болезнями. Кроме того, насекомые-хищники также могут быть использованы для этих целей.

Наиболее успешным агентом биоконтроля считается Bacillus thuringiensis, которая является спорообразующей бактерией, содержащей кристаллические белковые включения. Её белки очень токсичны для насекомых-вредителей и специфичны в проявлении их активности. Они уже более 30 лет широко используются против насекомых, которые имеют в своем цикле размножения стадию гусеницы.

B. thuringiensis обычно применяется в виде спор или кристаллических включений, полученных после её разрушения. В настоящее время ген, кодирующий токсин, выделен и секвенирован. Токсин производится и применяется в виде рекомбинантного белка. Ген может быть также включен в различные виды растений.

Таким образом, можно использовать готовые микробные белки (биопестициды) или защищать растения путем встраивания гена, кодирующего токсичный белок, который экспрессируется в ткани растения. Большое число компаний в настоящее время включилось в исследования, разработку и производство токсина B. thuringiensis. Кроме него на рынке постепенно появляется ряд новых грибковых и вирусных пестицидов. В природе распространены многочисленные виды энтомопатогенных грибков, поражающих широкий круг насекомых, используя различные механизмы, включая контактный, что облегчает их применение. Грибковые биопестициды имеют ряд преимуществ перед бактериальными.

Применение вирусов в качестве биопестицидов ограничено изза сложности получения их в необходимых количествах. Для решения этой проблемы необходимы развитие технологии клеточных культур насекомых, отбор и модификация штаммов вирусов.

Микроорганизмы или продукты их жизнедеятельности, которые могут использоваться в качестве биологических агентов при борьбе с насекомыми-вредителями, должны отвечать следующим требованиям: действовать не хуже чем химические пестициды; быть безопасными, иметь низкую токсичность для других видов животных, не являющихся мишенями; быть стабильными при хранении и дешевыми при их массовом производстве; применяться с помощью обычной технологии без значительных изменений методов, обычно используемых в сельском хозяйстве. Имея указанные выше характеристики, микроорганизмы найдут постоянный рынок сбыта.

Биогербициды. Гербициды – химические препараты, предназначенные для борьбы с сорняками, составляют около 50 % суммарного рынка химикатов для сельского хозяйства. Им свойственны те же недостатки, что и пестицидам. Поэтому необходимость в создании биогербицидов очевидна. Их можно получить на основе микроорганизмов-патогенов растений, ферментов, а также полупродуктов, получаемых биоконверсией. Для борьбы с отдельными видами сорняков, устойчивых к химическим препаратам, применяют специфические и токсичные для них микроорганизмы. Наиболее часто используют грибковые фитопатогены и фитотоксины. Для расширения сферы их применения необходимо получение грибковых форм, более устойчивых по отношению к изменяющимся условиям внешней среды. Бактериальные фитопатогены, в отличие от грибковых, менее чувствительны к факторам внешней среды, но и в меньшей степени поражают растения. Последние разработки в данном направлении обещают значительные перспективы. Кроме биопестицидов и биогербицидов, для защиты растений все шире применяют биологические препараты для борьбы с возбудителями заболеваний. В целом масштабы применения различных препаратов для борьбы с вредителями и возбудителями болезней сельскохозяйственных культур все более расширяются.

Биоудобрения. Интенсивное растениеводство обедняет почву азотом, так как значительная его доля ежегодно выносится из нее вместе с урожаем. С древних времен для восстановления и улучшения почв существует практика использования бобовых растений, способных в симбиозе с азотфиксирующими микроорганизмами восполнять почвенные запасы азота в результате диазотрофности. Большой положительный эффект от возделывания бобовых побудил ученых к изучению этого процесса. Как только была выяснена роль симбиотических бактерий рода Rhizobium в азотфиксации, стали разрабатывать способы внесения этих микроорганизмов в почву и применять для инокуляции семян. Наиболее простой способ инокуляции основан на использовании почвы после выращивания на ней бобовых растений.

Азотфиксирующие микроорганизмы имеют специфический фермент нитрогеназу, в активном центре которой происходит активирование инертной молекулы N2 и превращение её в NH3:

N2 + 8 H+ + 8 e– + n АTФ 2 NH3 + H2 + n АДФ + n Ф.

В качестве носителя для бактерий были опробованы различные композиции: смеси торфа с почвой, добавки люцерны и соломы, перегнившие опилки, бентонит и активированный уголь.

Бактерии рода Azotobacter являются свободноживущими азотфиксирующими микроорганизмами и обладают высокой продуктивностью азотфиксации. Помимо связывания атмосферного азота эти бактерии продуцируют биологически активные соединения (витамины, гиббериллин, гетероауксин и др.). В результате этого инокуляция азотобактерином стимулирует прорастание семян и ускоряет рост и развитие растений. Более того, Azotabacter способен продуцировать фунгицидные вещества. Этим угнетается развитие в ризосфере растений микроскопических грибов, многие из которых тормозят развитие растений. Однако бактерии рода Azotobacter весьма требовательны к условиям среды, особенно концентрации в почве фосфатов и микроэлементов, и активно развиваются только в плодородных почвах. В последние годы для изучения биологической азотфиксации стали применять методы молекулярной биологии и новейшие методы генетики. Обнаружены плазмиды, несущие гены азотфиксации, относительно легко передающиеся при конъюгации от одного штамма бактерии к другому. После этого появились надежды на получение методами клеточной и генетической инженерии растений, способных фиксировать атмосферный азот. Однако перенос генов азотфиксации и их экспрессия – чрезвычайно сложная задача. Основными трудностями являются неизученность регуляции взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и кофакторов, необходимых для функционирования нитрогеназы; необходимость проведения интенсивных исследований генетики растений с целью подбора эффективных растений-хозяев, а также исследований, направленных на модификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями, но и, например, хлебными злаками.

Снабжение растений фосфатами. Фосфатные ионы в почве, как известно, не очень подвижны, поэтому вокруг корневой зоны растений часто возникает дефицит фосфора. Везикулярно-арбускулярная (ВА) микориза играет существенную роль в плодородии почвы, так как способствует поглощению растениями фосфатов из почвы. Эндои экзомикоризы представляют собой особые структуры, формирующиеся внутри или вокруг мелких корешков растений в результате заражения почвенными непатогенными грибами. Благодаря этой микоризе рост растений на бедных фосфатами почвах улучшается. Одновременно с поступлением фосфатов растения также обогащаются микроэлементами.

Доказано, что в растениях с микоризой концентрация гормонов роста выше, чем в ее отсутствии. Если ВА-микориза формируется в присутствии азотфиксирующих бактерий, у бобовых усиливается процесс образования клубеньков и азотфиксация. Для размножения эндофитов в почве нужна их инокуляция. Однако размножение грибов происходит только в присутствии растения-хозяина. Для получения положительного эффекта необходимо вносить 2–3 тонны инокулята на 1 гектар. Получать такие количества инокулята ВА-микоризы пока не представляется возможным. Для улучшения питания сельскохозяйственных культур фосфатами эффективен метод применения фосфобактерина. Препарат получают на основе спор культуры Bacillus megaterium (var. рhosphaticum). Эти бактерии превращают трудно усвояемые минеральные фосфаты и фосфорорганические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды) в доступную для усвоения растениями форму. Следует отметить, что фосфобактерин не заменяет фосфорные удобрения и не действует без них. При его наличии урожайность сельскохозяйственных культур повышается на 10 %.

Для защиты растений на основе бактерии Pseudomonas fluorescens получен препарат «P-2-79», подавляющий развитие свыше 40 видов микроорганизмов, поражающих пшеницу, ячмень, рожь. С помощью этого препарата проводят защиту семян сорго и кукурузы от антрактоза и ризоктониоза, хлопчатника и сои – от вилта и ряда других заболеваний. Для борьбы с фитофторозом яблонь предложено применение почвенной бактерии Enterobacter aerogenes. Защита многих овощных культур от заболеваний, вызываемых некоторыми видами микроскопических грибов, обеспечивается использованием препарата на основе культур Trichoderma polysporum и T. viride.

Контрольные вопросы

1. Какова разница между традиционными и современными методами изменения пород животных и сортов растений?

2. Какова роль фарм- и биопрепаратов в развитии животноводства?

3. Назовите основные пути использования трансгенных животных и растений в сельском хозяйстве.

4. Каковы преимущества и недостатки получения и применения биопестицидов и биоудобрений?

5. Каковы основные пути применения методов клеточной и генетической инженерии в улучшении свойств культурных растений?

Лекция 3. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПОЛУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКИХ

ВЕЩЕСТВ

В настоящее время c помощью биотехнологии получают большое разнообразие веществ, необходимых человеку. Основными из них являются алкалоиды, аминокислоты, антибиотики, антиметаболиты, антиоксиданты, белки, витамины, гербициды, инсектициды, коферменты, липиды, нуклеиновые кислоты, органические кислоты, пигменты, ПАВ, полисахариды, полиоксиалканоаты, растворители, сахара, стерины, ферменты, нуклеотиды, нуклеозиды, эмульгаторы и др.

Биотехнология позволяет разработать безотходные технологии, направленные на нужды общества, имеющего ряд проблем (нехватка продуктов питания, энергии, охрану окружающей среды и т.д.). По многим направлениям биотехнологии новые современные технологии только зарождаются и необходимы большие субсидии и усилия в их дальнейшем развитии, но потенциал их огромен и разнообразен и нет сомнения, что они будут играть все возрастающую роль в промышленном производстве будущего.

3.1. Органические кислоты Органические кислоты широко используют в пищевой и фармацевтической промышленности, в технике и в качестве химического сырья. Отдельные органические кислоты (лимонную, яблочную) можно получать экстракцией из природного растительного сырья; другие (уксусную, молочную) – путем органического синтеза. При производстве органических кислот экономический коэффициент по углероду может достигать 90 % и выше. В качестве продуцентов используют бактериальные, дрожжевые и грибковые культуры (Lactobacillus, Arthrobacter, Alcaligenes, Candida, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma). Способы ферментации в микробиологических процессах производства органических кислот разнообразны. Среди них – поверхностные жидко- и твердофазные процессы, а также глубинные, включая проточные культуры.

В последние годы разработаны принципиально новые и эффективные биотехнологии с использованием иммобилизованных ферментов и клеток. Субстраты, используемые в производстве органических кислот, также отличаются большим разнообразием.

Уксусная кислота (СН3СООН) широко используется в пищевой, химической, микробиологической промышленности и в медицине.

Получение уксусной кислоты из спиртосодержащих жидкостей было известно более 10 тыс. лет назад. Уксуснокислые бактерии способны окислять спирт кислородом воздуха с участием алкогольдегидрогеназы в уксусную кислоту СН3СН2ОН + О2 СН3СООН + Н2О.

Данный процесс может протекать при участии многих бактерий, но в промышленных технологиях для получения уксусной кислоты используют уксуснокислые бактерии рода Acetobacter. Большой интерес представляют также бактерии Gluconobacter. Большую часть уксусной кислоты получают, используя разведенный этиловый спирт.

В мире её производится около 500 млн литров в год.

Лимонная кислота широко используется в различных отраслях народного хозяйства, особенно в пищевой промышленности для улучшения вкуса, для предотвращения окисления, в качестве приправы и как консервант. С этой целью она производится с применением ферментативных процессов, включающих грибок Aspergilllus niger и мелассы в качестве субстрата. Ферментация может протекать как в статических культурах на поверхности поддонов или в глубоких емкостях, так и в огромных биореакторах.

Лимонная кислота с каждым годом находит новые области применения, что обусловило необходимость значительного увеличения ее выпуска. Мировое производство лимонной кислоты достигло около 0,5 млн тонн в год. В промышленности лимонную кислоту в основном получают способом периодического культивирования микроорганизмов. В последние годы начинают применятся биореакторы непрерывного действия.

В зарубежной литературе довольно широко изложены исследования по непрерывной ферментации на основе углеводов и нпарафинов, где длительность культивирования составляет 10-12 суток. Более высокая продуктивность при непрерывной ферментации наблюдается при использовании глюкозы в качестве субстрата.

Молочная кислота может быть получена путем ферментации (40%) или путем химического синтеза (60%).

Кроме уксусной, лимонной и молочной кислот на основе микробиологического синтеза получают более 50 органических кислот, таких как пропионовая, итаконовая, глюконовая, фумаровая кислота и ряд других.

3.2. Аминокислоты Химический синтез аминокислот дает рацемат – продукт, содержащий как L-, так и D-формы. За исключением глицина, который не имеет оптически активных изомеров, и метионина, усвояемого организмами в обеих формах, D-изомеры обладают токсичностью.

Микробиологический метод получения аминокислот, наиболее распространенный в настоящее время, основан на способности микроорганизмов синтезировать все L-аминокислоты, а в определенных условиях – обеспечивать их сверхсинтез.

Биосинтез аминокислот в микробных клетках протекает в виде так называемых свободных аминокислот. Аминокислоты с каждым годом находят все большее применение в качестве кормовых и пищевых добавок и приправ, сырья фармацевтической и парфюмерной промышленности. Все аминокислоты, из которых состоят белки, являются L-формами. Из 20 аминокислот – 8 (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, валин, фенилаланин) незаменимы для человека. Для сельскохозяйственных животных этот список дополняют гистидин и аргинин, а для молодняка птицы – еще и пролин.

Поэтому в больших количествах аминокислоты применяют для добавления в корма. Это сокращает расход дефицитных белков животного происхождения. Аминокислоты широко используются в производстве продуктов и напитков для улучшения вкуса, в качестве приправы или питательных добавок. Их производство в мире превышает 600 000 тонн в год. Основная доля приходится на Японию. Глютаминовая кислота и лизин – это аминокислоты, получаемые путем ферментативного процесса с участием бактерий Corynebacterium glutamicum и Brevibaсterium flavum соответственно. С помощью ДНК-технологии постоянно улучшаются их продуцирующие способности.

3.3. Биополимеры Термин «биополимеры» относится ко многим высокомолекулярным соединениям, включая полисахариды, белки и нуклеиновые кислоты (см. лекцию 1).

Полисахариды (гликаны) – полимеры, построенные не менее чем из 11 моносахаридных единиц. Полисахариды – обязательный компонент всех организмов – присутствуют как изолированно, так и в комплексах с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. Микробные полисахариды делятся на внутриклеточные, локализованные в цитоплазме, и внеклеточные – полисахариды слизей, капсул и чехлов.

Внеклеточные микробные полисахариды продуцируются обычно многими микроорганизмами и используются в пищевых продуктах для повышения вязкости и образования гелей. Они могут стабилизировать структуру продукта, улучшать его внешний вид и вкус. Чаще всего для получения полисахаридов (декстраны) используются Psendomonas и Lenconostoe mesenteroides. Некоторые виды Acetobacter могут продуцировать целлюлозу, которая служит основой некоторых восточных продуктов. С использованием промышленных продуцентов производятся различные полисахариды.

Ксантан продуцируется бактериями Xanthomonas campesrtis, обладает уникальными реологическими свойствами. В низких концентрациях он образует очень вязкие растворы, которые не изменяют свои свойства при изменении температуры, рН и концентрации солей в широких пределах. Его применяют в пищевой промышленности, при изготовлении гелевых дезодорантов, зубной пасты, при суспендировании сельскохозяйственных химикатов и при добыче нефти. Из всех других гликанов объемы производства ксантана наиболее крупнотоннажны. Выпускаемый продукт имеет разное товарное название – ксантан, келцан, келтрол. Ведущими странами – производителями полисахаридов можно назвать США, Францию (ксантан, курдлан), Россию (декстран), Японию (пуллан, курдлан). Продуцентами декстранов являются штаммы Leuconostac mesenteroides, растущие на средах с высоким содержанием сахарозы (10–30 %), дестрана-«затравки», дрожжевого экстракта и минеральных солей. В зависимости от состава минеральных солей и природы «затравки» синтезируются высокомолекулярные (60–80 тыс.) линейные или имеющие низкую молекулярную массу (20–30 тыс.) разветвленные декстраны. Последние обладают наибольшей биологической активностью. Из декстранов производят плазмозаменители (клинический декстран, полиглюкин, плазмодекс, хемодекс и др.).

Курдлан. Бактерии Alcaligenes faecalis, штамм 10С3 синтезируют курдлан, представляющий собой полимер глюкозы. Важное свойство данного полисахарида – образование термически необратимых гелей.

Курдлан обладает противоопухолевой активностью, поэтому находит применение в медицине. Ацетильные производные курдлана применяют в качестве основы ультрафильтрационных полупроницаемых мембран для разделения веществ с молекулярной массой 200–2000 Да.

Пуллан. Полисахарид продуцируется дрожжеподобным грибом Aerobasidium pullulans на средах, содержащих 50 % глюкозы в течение 80–100 ч. Вязкость пуллана зависит от рН среды: она минимальна при рН 4.0, молекулярная масса при этом составляет около 200 000 Да, при увеличении рН вязкость возрастает. Пуллан используют в качестве биоразрушаемого упаковочного материала для пищевых продуктов.

Он проявляет также антиокислительные свойства.

Альгинат. Данный полисахарид ранее выделяли из морской водоросли Laminaria. Он обладает в определенных условиях прекрасными гелеобразующими, а также псевдопластическими свойствами в широком диапазоне рН и температур и используется в кондитерской и фармацевтической промышленности. Установлено, что альгинат является лучшим носителем для иммобилизации ферментов и особенно целых клеток. Сравнительно недавно среди бактерий Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter vinelandii идентифицированы продуценты полисахарида, близкого по свойствам к альгинату.

Склероглюкан. Склероглюкан (товарное название – политран) синтезируют грибы рода Sclerotium. Синтез данного полисахарида в отличие от большинства других максимален в ранней лог-фазе, 48-часовой культуры. Процесс разработан на средах с глюкозой, в том числе в проточном режиме, выход полисахарида от ассимилированной глюкозы составляет 50 %. В низких концентрациях (1,5% раствор) образует в воде прочные гели, которые не изменяют свои свойства в широком интервале температур. Используют в качестве покрытия семян, пестицидов, а также при производстве латексов и красителей.

Микробные поли (3-оксиалканоаты), (ПОА). ПОА – биополимеры оксипроизводных жирных кислот, синтезируются многими прокариотическими микроорганизмами в специфических условиях несбалансированного роста при избытке в среде углеродного и энергетического субстрата и дефиците минеральных элементов (азота, серы, фосфора и др.), а также кислорода. Среди наиболее перспективных продуцентов ПОА можно отметить Azotobacter, Bacillus, Methylomonas, Pseudomonas и Alcaligenes.

Наиболее изученным в настоящее время считается полиоксибутират – полимер -оксимасляной кислоты (С4Н8О2). Его молекулярная масса определяется условиями синтеза полимера, спецификой продуцента, а также процедурой экстракции полимера из биомассы. Помимо полиоксибутирата микроорганизмы способны синтезировать гетерополимерные ПОА – сополимеры оксибутирата и оксивалерата, оксибутирата и оксигексаноата, полиоксибутирата и полиоксигептаноата и др., а также трех-, четырех- и более компонентные полимеры.

Практический интерес и значимость данных исследований определяются свойствами полиоксиалканоатов, которые по своим базовым показателям близки к полипропилену, но обладают также рядом уникальных свойств, напрмер, биодеградабельностью.

Свойства ПОА делают их перспективными для применения в различных сферах: медицине (см. лекцию 1), в пищевой промышленности (предупреждение окисления напитков и продуктов, упаковочные материалы), сельском хозяйстве (обволакивание семян, покрытие удобрений и пестицидов), радиоэлектронике, торговле (разрушаемая тара и упаковочные материалы) и др.

3.4. Антибиотики и ферменты Антибиотики (антибиотические вещества, см. лекцию 1) – это продукты обмена микроорганизмов, избирательно подавляющие рост и развитие микроорганизмов – бактерий, микроскопических грибов и опухолевых клеток. Образование антибиотиков – одна из форм проявления антагонизма. Антибиотики – это вторичные продукты обмена микроорганизмов (идиолиты). Характерной особенностью развития продуцентов антибиотических веществ является ярко выраженная двухфазность: в первой фазе развития микроорганизмов происходит накопление биомассы, во второй – синтез антибиотика. При этом очень важно создать условия ферментации, адекватные этой двухфазности, с учетом ингибирующего действия антибиотика как продукта обмена на продуцент.

Согласно классификации все ферменты подразделяются на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы (синтетазы). Негидролитические ферменты – оксидоредуктазы, лиазы, изомеразы и лигазы применяются сравнительно редко. Наиболее широкое применение получили микробные гидролазы (гликозидазы, протеиназы, липазы), взаимодействующие с пептидами, гликозидами и другими соединениями с участием воды.

Все большее применение ферменты находят в тонком органическом синтезе в процессах получения различных сложных соединений (аминокислот, пептидов, нуклеотидов, полусинтетических антибиотиков), а также в медицине (см. лекцию 1).

Инвертаза (В-фруктофуранозидаза) гидролизует дисахарид сахарозу с образованием эквимолярной смеси глюкозы и фруктозы.

Фермент присутствует в клетках самых разных организмов и широко распространен у микроорганизмов. Основным источником получения инвертазы служат дрожжи сахаромицеты. В клетках Saccharomyces cerevisiae инвертаза представлена двумя формами: “легкой” внутриклеточной и “тяжелой” внеклеточной. Различие между двумя формами состоит в том, что легкая форма негликозилирована и локализована в цитозоле, тогда как тяжелая представляет собой гликопротеин, локализованный преимущественно в клеточной оболочке. Инвертаза находит разнообразное применение, она широко используется для получения глюкозофруктозного сиропа.

3.5. Биогидрометаллургия Микроорганизмы используются для полезной экстракции коммерчески важных элементов путем биовыщелачивания. Например, такие металлы как кобальт, медь, цинк, свинец или уран могут быть легко выделены из низкоценных руд.

Биологические реакции в экстрактивном выщелачивании металлов обычно связаны с окислением сульфидов. Во многих бактериях, грибках, дрожжах, водорослях и даже простейших протекают эти специфические реакции. Многие минералы тесно связаны с другими веществами, такими как сера, например, сульфид железа, который может быть окислен до свободного металла. Широко используемая бактерия Thiobacillus ferroxidaus может окислять и серу, и железо. Сера в рудных отходах может быть превращена бактериями в серную кислоту. Соответственно повышается окисление сульфида железа до сульфата железа.

В США почти 10 % всего производства меди получают с помощью данного метода. Подобную технологию используют в Индии, Канаде, США, Чили и Перу. Из бедных руд биовыщелачивание стоит в 2, а иногда и в 3 раза дешевле, чем прямая плавка.

С помощью бактериального выщелачивания возможно извлекать уран из низкосодержащих руд (0,01-0,5% U3О8), из которых получение его другими методами неэкономично. Только в США таким способом ежегодно экстрагируют 4000 тонн урана. Этот процесс вносит значительный вклад в экономику атомных электростанций, позволяя обогащать уран из низкоактивных ядерных отходов.

Разработаны непрерывные процессы, позволяющие легко контролировать микробную популяцию благодаря кислотности и возможности ограничивать субстрат. Технология выщелачивания продолжает оставаться наиболее эффективным и дешевым способом экстрагирования редких металлов, необходимых для современной индустрии. Основной недостаток этого метода заключается в медленном протекании процесса. Аналогичным путем микроорганизмы могут быть использованы для экстракции токсичных металлов из промышленных отходов с целью уменьшения загрязнения окружающей среды.

Другим важным потенциальным применением бактериального выщелачивания является удаление серосодержащих пиритов из угля, содержащего много серы. Такой уголь находит небольшое применение из-за загрязнения двуокисью серы. Однако по мере того как требуются все большие и большие запасы угля, он также начинает использоваться. Поэтому бактериальное удаление пирита из такого угля может иметь большое экономическое значение и играть важную роль в охране окружающей среды.

Бактерии, утилизирующие алифатические углеводороды, могут быть использованы для добычи нефти путем освобождения нефтепродуктов из нефтяного шельфа и гудронного слоя или при аварийных утечках нефти. При этом можно создать подобие природного биореактора, в котором вода и микроорганизмы проникают через породу и ликвидируют природные или техногенные утечки. Во всех этих технологиях необходим этап, обеспечивающий создание микроорганизмов для выполнения специфических функций.

В качестве одного из направлений применения этой области биотехнологии можно назвать охрану окружающей среды.

Контрольные вопросы

1. Какие химические вещества получают с использованием биотехнологических процессов?

2. Культуры каких микроорганизмов используются при производстве органических кислот?

3. В чем преимущество получения химических соединений с применением микроорганизмов?

4. Приведите примеры получения и применения биополимеров.

5. Биогидрометаллургия и её применение.

Лекция 4. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА Общество во всем мире идет по пути увеличения урбанизации и повышения индустриализации.

Общественное мнение требует усилить охрану окружающей среды и уже в настоящее время обратить больше внимания на улучшение экологии для будущих поколений.

Для достижения этого в развитых странах принят ряд законов, направленных на уменьшение опасности жидких, твердых и газообразных вредных отходов. В настоящее время деятельность любого предприятия оценивается не только по экономическим критериям. Все больший удельный вес в этой оценке приобретает экологический аспект – степень вредного воздействия производства на окружающую среду. Зачастую вопросы экологии становятся определяющими при решении судьбы предприятия. В большинстве развивающихся стран положение менее благополучно из-за недостатка финансирования. В связи с этим невозможна постройка cооружений для очистки сточных вод, уничтожения твердых отходов. Часто отсутствует персонал для обслуживания таких систем. Более того, во многих развивающихся странах отсутствует государственная контролирующая система, следящая за надлежащим уничтожением отходов. В этих странах идет активный процесс урбанизации и развития промышленности с сопутствующим загрязнением окружающей среды.

Накопление отходов – это процесс, связанный с производственной деятельностью, со сферой потребления. С увеличением экономического развития он имеет тенденцию к увеличению. Стоимость уничтожения отходов постоянно увеличивается и в настоящее время большее внимание должно уделяться эффективной их утилизации, включающей стоимость сбора, хранения и переработки или уничтожения. В связи с этим понятен большой интерес к этой проблеме общественности и ученых, усилия которых направлены на её решение.

4.1. Утилизация отходов Проблема взаимодействия биосферы с поступающими в нее чужеродными соединениями является одной из основных проблем, стоящих перед человечеством. В результате интенсивной деятельности человека в биосферу направлен мощный поток вредных веществ, включая ксенобиотики, которые наносят непоправимый ущерб живым организмам и нарушают стабильность биогеоценозов, приводя к их деградации. Ксенобиотики – это синтетические вещества, которые не образуются в результате природного биосинтеза и во многих случаях служат реколцитрантами. Примером таких соединений служат пестициды, ПАВ, красители, гербициды и т.п., которые практически не включаются в элементные циклы углерода, азота, серы или фосфора. Накапливаясь в окружающей среде, они вредно влияют на все живое. Их деградация происходит в результате действия комплекса физических, химических и особенно биологических факторов. Она существенно зависит от типа почвы, ее структуры, влажности, температуры и пр. Одни синтетические соединения могут быть обнаружены в очень высоких концентрациях в местах их производства, хранения, транспортировки и в результате аварий могут наносить большой вред, в то время как другие, например, диоксин, хотя и могут находиться в низкой концентрации, но из-за их высокой токсичности также будут очень вредны для здоровья людей.

Каждый вид отходов должен быть оценен на предмет его пригодности для использования в биотехнологических процессах. Если этих отходов будет довольно много в течение длительного периода, то можно разрабатывать и предлагать экономичный метод их утилизации.

Биотехнологические стратегии для утилизации отходов, содержащих органические вещества:

1. Оценка качества отходов с целью определения их пригодности к использованию.

2. Скармливание пищевых отходов сразу или после обработки птице, свиньям, рыбам или другим животным с однокамерным желудком, которые могут их утилизировать.

3. Скармливание пищевых отходов крупному рогатому скоту или другим жвачным животным в том случае, если эти отходы не пригодны для целей, указанных в п.2., например, из-за высокого содержания клетчатки.

4. Если отходы требуют дорогостоящей предварительной обработки для использования их в качестве корма, то из них можно получить биогаз, который представляет собой горючую смесь, содержащую 50-80 % метана, 15-45 % СО2, 5 % воды и следы некоторых других газов.

5. Определение пригодности отходов для других целей прямое использование в качестве топлива, строительных материалов, сырья для химического производства и т.д.

Большую часть общего объема отходов составляют отходы животноводства, растениеводства, промышленности и бытовые. Использование многих отходов, в частности, отходов животноводства, не представляет проблемы. Это хорошо видно на примере Китая, где из данного вида отходов делают компосты и получают биогаз. Он образуется благодаря биометанизации, саморегулирующегося симбиотического микробного процесса, протекающего при анаэробных условиях и температуре выше 30 оС. Однако интенсивное животноводство (комплексы) создают серьезную проблему утилизации отходов.

Микробные сообщества. Микробная экология – наука, которая изучает взаимоотношения между микроорганизмами и их живым (биотик) и неживым (абиотик) окружением. Увеличение научного и общественного интереса к экологии микробов связано главным образом с их центральной ролью в технологиях по охране окружающей среды. Микробы в их многовариантной форме способствуют упорядочению вещества и энергии (биогеохимический цикл) в мировых экосистемах. Благодаря большому разнообразию их метаболических процессов они трансформируют неорганические и органические вещества. Поэтому экология микробов – крайне важная научная дисциплина с практическим применением и может быть рассмотрена как одно из основных научных достижений в решении проблемы окружающей среды.

Биодеградация может быть определена как разложение веществ благодаря активности одного вида микроорганизма, но чаще их сообщества. В последние годы анализ ДНК широко используется для идентификации микроорганизмов. Микроорганизмы, найденные в почве и воде, очень многообразны, они утилизируют любое органическое вещество, которое служит им источником энергии и углерода, путем ферментативного расщепления до простых молекул, пригодных для абсорбции и усвоения. При подходящих условиях окружающей среды все природные органические соединения могут быть расщеплены, поэтому не происходит больших скоплений природных органических веществ в окружающей среде.

Современные разработки биотехнологии, связанные с охраной окружающей среды, фокусируются на оптимизации процессов и недопущении применения неэффективных технологий, а также процессов, переводящих одну проблему в другую, например, образованию канцерогенных нитрозаминовых соединений в результате взаимодействия некоторых микроорганизмов с органическими аминами и окисью азота. Безопасность окружающей среды не должна страдать в результате применения таких процессов.

Возможности микробных сообществ в отношении деградации многих токсичных соединений огромны. Доказано, что при повторном попадании в среду многих химических соединений время до начала их трансформации (так называемый адаптационный период микроорганизмов по отношению к данному субстрату) значительно короче по сравнению с первым попаданием этого соединения. В результате естественным путем возникают микробные популяции, которые могут сохраняться в почве в течение нескольких месяцев после полной деградации токсического вещества. Поэтому к моменту нового поступления этого соединения в почву в ней уже присутствуют адаптированные микроорганизмы, способные его трансформировать. Таким образом, после попадания ксенобиотиков в окружающую среду из почвы можно выделить микробные виды, способные деградировать конкретные ксенобиотики и провести дополнительную селекцию на увеличение скорости деградации.

Термин “биодеградабельный” обычно означает безвредный для окружающей среды и многие рекламные компании указывают, что благодаря такому свойству, например, упаковочного материала его количество в окружающей среде быстро уменьшается. Этого не всегда удается достигнуть, поскольку биодеградация некоторых веществ может происходить только при действии микроорганизмов в условиях, которые не всегда встречаются в природе. Более того, биодеградация представляет собой сложный многофакторный процесс, механизмы которого еще не полностью выяснены. Биотехнология окружающей среды может быть рассмотрена как направление, изучающее применение биологических систем и процессов в утилизации или уничтожении отходов. В настоящее время разработано множество технологий для утилизации жидких, газообразных и твердых отходов.

4.2.Утилизация твердых отходов Технология с использованием почвы. Количество твердых отходов увеличивается пропорционально увеличению общего количества отходов современным урбанизированным обществом. Часть этих отходов состоит из стекла, пластмасс и т.д., однако большинство представляют собой твердые органические материалы, такие как бумага, отходы пищевой промышленности и животноводческих комплексов. В США, например, получается большое количество отходов комбикормовой промышленности.

В больших урбанизированных обществах значительная часть таких отходов составляет сложную проблему, которая решается успешно путем применения дешевой технологии с использованием почвы. По этой технологии твердые отходы помещаются слоями. Каждодневные отходы сортируются, органические отходы складываются, прессуются и засыпаются слоем почвы в огромные емкости. Полное заполнение таких емкостей может занимать месяцы или годы в зависимости от их размера и количества отходов. При неудачном исполнении они могут выглядеть негигиенично и издавать дурные запахи.

Кроме того, при наличии токсичных отходов могут возникать несколько проблем, связанных как со снижением интенсивности микробиологических процессов, так и утечкой токсических веществ. Из плохо выполненных емкостей вредные вещества могут попадать в глубокие слои и загрязнять не только почву, но и подземные воды. В то же время правильно сконструированные и изолированные земляные емкости могут быть использованы для производства метана.

Очень часто в качестве емкостей применяют естественные и искусственные углубления: овраги, карьеры и др. В настоящее время делаются попытки использовать прочные герметичные емкости, которые бы исключили загрязнение почвы и водных источников. Для этого они должны быть воздухо- и водонепроницаемыми. Регулярный мониторинг необходим для выявления загрязнений подземных вод, водоемов и окружающего воздуха. Такие емкости можно рассматривать как гигантский биореактор по производству полезного продукта метана.

Образование метана наблюдается обычно через несколько месяцев после создания конструкции и заполнения емкости. Оно имеет пик и заметно уменьшается через несколько лет.

В большинстве развитых стран такая технология уменьшает количество отходов и увеличивает безопасность их для окружающей среды. Она не только обеспечивает надежную утилизацию твердых отходов, но и позволяет получать полезный продукт биогаз. Повидимому, благодаря этому она будет использоваться и в обозримом будущем.

Компостирование. На начальной стадии биодеградации твердых отходов доминируют аэробные процессы, в ходе которых окисляются наиболее деградируемые компоненты. Затем деструкции подвергаются трудно и медленно окисляемые субстраты – лигнин, лигноцеллюлозы, меланины, танины и др. Для их разрушения применяются различные методы. Одним из таких методов является компостирование, в процессе которого твердые органические отходы превращаются в стабильные, безопасные в санитарном отношении, гумусоподобные материалы, которые значительно меньше в объеме и могут быть возвращены в окружающую среду. Этот метод очень эффективен, протекает при низкой влажности в том случае, если в качестве субстрата используются разлагаемые органические отходы.

Компостирование очень долго применялось не только для утилизации твердых органических отходов, но и как способ рециклирования органических веществ. Оно будет играть все более заметную роль в процессах утилизации отходов, поскольку этот способ пригоден для переработки органического материала, получаемого в виде бытовых, сельскохозяйственных отходов и отходов пищевой промышленности. Повышенный интерес к данному способу связан с растущими проблемами окружающей среды, в частности, с недостатками основных технологий, используемых при утилизации твердых органических отходов, например, сжигания или неправильно используемого метода с применением почвы. Как правило, экологические службы и жители выступают против применения этих методов на их территориях.

Компостирование проводится в упакованной подушке твердых органических отходов, в которых микроорганизмы растут и размножаются. Избыток свободного воздуха является важным моментом.

Отходы собирают в аэрированные кучи (валки), тоннели или во вращающиеся биореакторы (цилиндры). Вращающиеся барабаны различного размера используются для компостирования бытовых отходов во всем мире. Небольшие барабанные системы широко применяются для переработки отходов на садовых участках и могут быть использованы для получения удобрения. Туннельное компостирование проводится в закрытых пластиковых туннелях длиной 30 - 50 метров и диаметром 4 - 6 метров. Такие туннельные системы работают в течение нескольких лет при компостировании отходов, а также при приготовлении специальных субстратов для производства грибов.

Некоторые заводы могут перерабатывать до 10 000 тонн отходов в год.

При компостировании требуются некоторые виды предобработки сырья, такие как измельчение резанием или размалыванием. Основой химических реакций процесса компостирования является окисление смеси органических веществ кислородом с образованием СО2, воды и органических побочных продуктов. После того как процесс компостирования заканчивается, конечный продукт часто необходимо оставить на различное время для стабилизации. Успешное компостирование требует оптимизации условий роста микроорганизмов. При утилизации больших объемов наблюдается биологическое прогревание. Однако перегрев может серьезно снизить активность микроорганизмов. Процесс компостирования следует регулировать для предотвращения повышения температуры выше 55о. Уровень влажности органических субстратов должен быть между 45 – 60 %. При влажности выше 60 % свободная влага будет накапливаться внутри частиц субстрата и ограничивать аэрацию – ниже 40 % условия становятся слишком сухими для размножения микробов.

Твердые органические материалы медленно солюбилизируются экзогенными ферментами, секретирующимися микроорганизмами.

Эта стадия реакции обычно ограничивает скорость. Целлюлоза и лигнин – основные компоненты твердых отходов. Высокое содержание лигнина, например в соломе и материалах древесины, затрудняет процесс деградации. Лигнин особенно устойчив к деградации и поэтому во многих случаях может экранировать другие более легко деградируемые вещества. Достаточное количество воздуха и постоянное перемешивание также являются важными для создания оптимальных условий хорошего компостирования.



Pages:   || 2 | 3 |



Похожие работы:

«МИС «АРИАДНА»КОМПЛЕКСНАЯ АВТОМАТИЗАЦИЯ МЕДИЦИНСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ Медицинская информационная система «Ариадна» предназначена для использования в медицинских учреждениях любого размера и профиля от небольших коммерческих медицинских центр...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра Д.Л. Пиневич 2014 г. Регистрационный № ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ АДЕНОКАРЦИНОМ ШЕЙКИ МАТКИ инструкция по применению УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК: Государственное учреждение образования «Бел...»

«Юлия Попова Болезни почек и мочевого пузыря Текст предоставлен издательством «Крылов» http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=178003 Попова Ю. Болезни почек и мочевого пузыря. Полная энциклопедия. Диагностика, лечение, профилактика: Издательс...»

«Министерство здравоохранения РФ Департамент здравоохранения Воронежской области Бюджетное образовательное учреждение среднего профессионального образования Воронежской области «Бутурлиновский медицинский техникум» ПРОГРАММА УЧЕБНО...»

«Центр торакальной хирургии и Внутриторакальной сосудистой хирургии Заведующий: Проф.доктор мед. Мартин Тешнер Больница Дельменхорст Германия Информация Информация для врачей Больница Дельменхорст Хирургический Спектор Сервис Контакт A. От прошлого к настоящему Выбор-главы B. Торакальная хирургия сегод...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра Д.Л. Пиневич 23.12.2011 Регистрационный номер №141-1211 МЕТОД ПРОФИЛАКТИКИ УПОТРЕБЛЕНИЯ ПСИХОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ СРЕДИ МЛАДШИХ ШКОЛЬНИКОВ инструкция по применению Учреждения-разработчики: ГУ «РНПЦ психического здоровья» УЗ «Городской клини...»

«Преэклампсия: гемодинамический адаптационный синдром. АГ-инфо. 2002. N3. С. 9-12. Примечание: при чтении оригинального текста статьи просим учесть, что журнальный вариант публикуется с сокращениями и содержит ошибки,...»

«АРБИТРАЖНЫЙ СУД НОВГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ Большая Московская улица, дом 73, Великий Новгород, 173020 http://novgorod.arbitr.ru Именем Российской Федерации РЕШЕНИЕ Великий Новгород Дело № А44-3544/2012 21 августа 2012 года Резолютивная часть решения объявлена 14.08.2012 года. Полный текст реш...»

«Евгений Иванович Гусев Георгий Серафимович Бурд Александр Николаевич Коновалов Неврология и нейрохирургия OCR sardonios http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=160986 Неврология и нейрохирургия: Медицина; 2000 ISBN 5-225-00969-7 Аннотация В учебнике представлены...»

«Д.Г. Альтман, К.Ф. Шульц, Д. Мохер, М. Эггер, Ф. Давидофф, Д. Элбурн, П.К. Гёче, Т. Ланг Пересмотренный вариант единых стандартов представления результатов рандомизированных контролируемых испытаний (CONSORT): р...»

«ТРАДИЦИОННЫЕ И АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПОДХОДЫ К ПРОБЛЕМЕ БОЛИ В МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА Сборник научных трудов II Казахстанской научнопрактической конференции с международным участием, посвященной 20-летию Независимости Республики Казахстан (10-11 ноября...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина » СОГЛАСОВАНО о науке и инновациям Н.А.Балакирев...»

«Каракулова Ольга Викторовна ЛИЧНОСТНАЯ ОБУСЛОВЛЕННОСТЬ СКЛОННОСТИ К МАНИПУЛИРОВАНИЮ ОКРУЖАЮЩИМИ ЛЮДЬМИ В ЮНОШЕСКОМ ВОЗРАСТЕ 19.00.13 – психология развития, акмеология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата психологических наук...»

«МУЛЬТИМОДАЛЬНАЯ АНАЛГЕЗИЯ С ПОЗИЦИЙ ДОКАЗАТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ Кобеляцкий Ю.Ю. БУС-4, г.Киев, Феофания, 26 октября 2012 года, 14.00-14.15 ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ НАРКОТИЧЕСКИХ АНАЛГЕТИКОВ Депрессия дыхания Избыточная седация Тошнота и рвота Угнетение перистальтики Задержка...»

«Андрей Владимирович Курпатов Пространство психосоматики shum29 http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=164841 Пространство психосоматики: ОЛМА, Издательский Дом «Нева»; СПб.,М.; 20...»

«Косова Елена Германовна ПСИХИЧЕСКАЯ РИГИДНОСТЬ КАК ФАКТОР РАЗВИТИЯ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО СТРЕССОВОГО РАССТРОЙСТВА У СОТРУДНИКОВ ОПЕРАТИВЫХ ПОДРАЗДЛЕНИЙ, ПЕРЕНЕСШИХ БОЕВЙ СТРЕСС Специальность 19.00.04 – «Медицинская психология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата психологических наук ТОМСК 2005 Работа выпо...»

«На пра вах р ук о пис и СТОЯНОВА Ирина Яковлевна ПРАЛОГИЧЕСКИЕ ОБРАЗОВАНИЯ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ Специальность 19.00.04–«Медицинская психология» АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора психологических наук Томск-2007 Исследование выполнено в ГУ НИИ психического здоровья Томского научного...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра Д.Л. Пиневич июня 2013г. «12» Регистрационный № 061-0513 МЕТОД АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК СО СНИЖЕННОЙ ИНТЕНСИВНОСТЬЮ РЕЖИМА КОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С РЕЦИДИВАМИ...»

«Епанчинцева Галина Александровна РАЗВИВАЮЩАЯ ПСИХОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА В ОБРАЗОВАНИИ Специальность 19.00.13 – психология развития, акмеология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора психологических наук Томск – 2010 Работа в...»

«13. Соколов О. М. Основы имплицитной морфологии русского языка. – М.: Изд-во РУДН, 1997. – 203с.14. Эндрюс Э. Н. Русские глагольные приставки. Практикум. Продвинутый уровень. – М.: Русский язык, 2009. ПСИХОЛОГИЯ УДК 159.9 РАЗДЕЛЬНОПОЛОСТЬ ЧЕЛОВЕКА В КОНТЕКСТЕ СОВРЕМЕННЫХ ПРЕД...»

«1. Планируемые результаты освоения учебного предмета «Генетика человека» В результате изучения обучающиеся должны приобрести новые знания и умения. Овладеть основными терминами и понятиями, используемыми в генетике человека, в психогенетике, медицинской и эволюционной генетике...»







 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.