WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«РЕФЕРАТ Отчет 72 с., 1 ч., 17 рис., 8 табл., 23 источника. РАК ЖЕЛУДКА, ПРОТЕОМНЫЕ МАРКЕРЫ, ВЕСТЕРН-БЛОТ АНАЛИЗ, ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Объектом ...»

РЕФЕРАТ

Отчет 72 с., 1 ч., 17 рис., 8 табл., 23 источника.

РАК ЖЕЛУДКА, ПРОТЕОМНЫЕ МАРКЕРЫ, ВЕСТЕРН-БЛОТ

АНАЛИЗ, ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ.

Объектом исследования являются протеомные маркеры

злокачественных опухолей желудка диффузного и интестинального типов.

Цель выполнения НИР. Идентификация наиболее информативных протеомных маркеров для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга рака желудка (РЖ) интестинального и диффузного типа; создание высокочувствительных тест-систем для детекции идентифицированных маркеров в биологических образцах. Выполнение НИР должно обеспечивать достижение научных результатов мирового уровня, подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научнопедагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.

Цель работы второго этапа — выбор белков со стабильным повышением в злокачественных опухолях желудка на основе оценки генной экспрессии и синтеза белков, предварительно выбранных в качестве потенциальных протеомных маркеров рака желудка, в образцах опухолей и нормальной ткани от больных раком желудка, а также по результатам поиска с использованием мировых баз данных по микроРНК.

В процессе работы проводились исследования по оценке уровня экспрессии (по мРНК) генов потенциальных маркеров рака желудка методом ПЦР с обратной транскрипцией и синтеза белка методом Вестерн-блот анализа в тканях нормальной слизистой и рака желудка, полученных при оперативном вмешательстве от больных раком желудка с интестинальным и диффузным типом злокачественных опухолей.



Проведен биоинформатический поиск потенциальных протеомных маркеров рака желудка по мировым базам данных микроРНК. Проведены дополнительные исследования по сбору клинического материала от больных раком желудка и обследование здоровых доноров для получения образцов крови и формирования базы данных контрольной группы.

Результаты, полученные при проведении 2 этапа работы. Выбраны белки, синтез которых стабильно повышен в образцах опухолевой ткани больных раком желудка по сравнению с нормальной слизистой. Выявлены белки, ассоциированные с раком желудка, на основе модифицированного алгоритма биоинформационного поиска и идентификации потенциальных белковых опухолевых маркеров по анализу микроРНК. Дополнена база данных клинического материала по больным раком желудка. Собрана коллекция крови от здоровых доноров и создан компьютерный регистр.

Представлен научно-технический отчет. Достигнуты заявленные значения программных индикаторов и показателей по подготовке и закреплении в сфере науки молодых научных кадров.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….........8

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Поиск белков со стабильным повышением синтеза в опухолях желудка……13 1 Анализ уровня синтеза белков методом Вестерн-блота в образцах замороженных тканей больных раком желудка …………

1.1 Оценка синтеза белков методом Вестерн-блота в тотальных экстрактах нормальной и опухолевой ткани пациентов с раком желудка…………….…14 1.1.1 Методика приготовления тотальных образцов опухолевой и нормальной ткани………………………………………………………………..14 1.1.2 Оценка синтеза Inhibin Beta-1 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани……………………………………………………………..14 1.1.3 Оценка синтеза белка RAI3 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани……………………………………………………………….16 1.1.4 Оценка синтеза белка SOD-2 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани……………………………………………………………….19 1.1.5 Оценка синтеза белка CEACAM6 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани……………………………………………….22





1.2 Оценка синтеза белков методом Вестерн-блота в растворимой фракции белков, полученной из нормальной и опухолевой ткани пациентов с раком желудка………………………………………………………………………..…26 Получение растворимой белковой фракции из образцов 1.2.1 нормальной и опухолевой ткани желудка……………………………………..26 1.2.2 Оценка синтеза белка CEACAM6 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани ……………………………………………….27 1.2.3 Оценка синтеза белка Inhibin Beta-1 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани………………………………………………..29 1.2.4 Оценка синтеза белка SOD2 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани……………………………………………………………….30 1.2.5 Оценка синтеза белка RAI3 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани………………………………………………………………..31 2 Выбор белков со стабильными изменениями синтеза в опухолевой ткани на основе анализа микроРНК………….……………….………….…………....36 3 Сбор образцов биопсийного и операционного материала, крови больных и образцов крови здоровых лиц с клинико-морфологической характеристикой……………………………………………………………….....42

3.1 Формирование группы контроля……………………………………………42

3.2 Дополнительный набор клинического материала………………………....46 4 Оценка экспрессии генов выявленных белков в опухолевой и нормальной ткани методом ПЦР в реальном времени.………………………………….......50 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.…………………….……………….………….……………......64 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.………..……….……….....68

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности на планете, составляя более 25% случаев всех смертей в развитых странах. Рак желудка (РЖ) остается одним из лидеров по показателям смертности среди больных со злокачественными новообразованиями во всем мире. В мире ежегодно регистрируется более миллиона новых случаев заболевания РЖ, более 50 тысяч которых диагностируется в РФ. Пятилетний уровень выживаемости при раке желудка варьирует от 5% до 15%, повторное возникновение опухоли отмечается у 80% пациентов. В течение первого года после постановки диагноза 56% больных умирают, что объясняется высокой запущенностью в связи с отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания, а также отсутствием достаточно чувствительных методов молекулярной диагностики. Доказано, что ранняя первичная диагностика большинства типов злокачественных опухолей, а также точный прогноз клинического течения заболевания значительно повышают вероятность эффективного лечения. Однако проблема поиска информативных диагностических и прогностических молекулярных маркеров, в том числе белковой природы, не решена для большинства наиболее распространённых видов опухолей в связи с высокой вариабельностью механизмов канцерогенеза и отсутствием высокочувствительных методов идентификации опухолевых маркеров. В настоящее время в клинической практике ограниченно применяется лишь несколько тестов по диагностике и прогнозированию течения рака желудка, которые имеют низкую чувствительность и специфичность. Большинство опухолей желудка относится к карциномам и подразделяется на два основных гистологических подтипа: интестинальные и диффузные опухоли, которые имеют разный молекулярный патогенез и прогноз клинического течения. Это делает целесообразным поиск маркеров, ассоциированных с тем или иным типом РЖ, которые могли бы выступать, во-первых, в качестве дифференциальных критериев диагностики, а, во-вторых, использоваться как критерии прогноза. Несмотря на достаточно интенсивные поиски, в клинической практике пока нет новых эффективно работающих маркеров РЖ.

Идентификация наиболее информативных

Главные цели проекта:

протеомных маркеров для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга рака желудка (РЖ) интестинального и диффузного типа; создание высокочувствительных тест-систем для детекции идентифицированных маркеров в биологических образцах. Выполнение НИР должно обеспечивать достижение научных результатов мирового уровня, подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научнопедагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.

Достижение заявленных целей потребует решения следующих задач.

1. Идентификация потенциальных протеомных маркеров рака желудка различных гистологических типов.

2. Поиск белков со стабильным повышением синтеза в опухолях желудка

3. Отбор диагностических и прогностических маркеров рака желудка

4. Оценка эффективности детекции маркеров

5. Создание и тестирование наборов для ранней диагностики и прогнозирования течения заболевания В процессе выполнения первого этапа работы был проведен анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов по теме проекта, выполнены патентные исследования, что позволило обосновать актуальность выбранного направления исследований.

Поиск потенциальных диагностических и прогностических белковых маркеров рака желудка был осуществлен двумя методами. Первый - с помощью оригинального высокоэффективного алгоритма биоинформационного поиска по анализу экспрессии мРНК с использованием современных баз данных: dbEST, SAGE и Oncomine. В результате поиска было отобрано семь не идентифицированных ранее потенциальных прогностических маркеров РЖ, кодирующих белки, функционально вовлеченные в механизмы регуляции пролиферации и процессов метастазирования. Второй – на основе протеомных исследований, которые были проведены с использованием 2D электорофореза большого формата на материале замороженных пар образцов нормальной и опухолей слизистой желудка. Белки с повышенной концентрацией в опухоли идентифицированы масс-спектрометрически (MALDI-TOF/TOF). В результате сравнительного анализа уровня синтеза белков в интестинальных и диффузных опухолях желудка и нормальных тканях методом двумерного гель-электрофореза идентифицировано три белка, содержание которых значительно увеличивается в опухолях. Осуществлено сравнение эффективности поиска белковых маркеров РЖ методами 2D анализа и биоинформационного поиска в транскриптомной базе данных Oncomine, показавшее совпадение в 60% случаев.

На базе клиники НИИ онкологии СО РАМН собраны парные образцы опухолей и нормальных тканей, полученных при хирургическом вмешательстве, от 30 пациентов с диффузным и интестинальным типами первично-диагностированного рака желудка. Сформирован банк образцов крови (сывороток), а также тканей в парафиновых блоках. Все образцы тканей снабжены полной клинической документацией и охарактеризованы гистологически, диагноз подтвержден.

Полученные данные служат основанием для проведения следующего этапа работы по подтверждению стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка методами оценки генной экспрессии Вестерн-блоттинга в замороженных образцах ткани и (ОТ-ПЦР), иммуногистохимии на срезах тканей из парафиновых блоков.

В рамках решения запланированной на 2-й этап задачи по поиску белков со стабильным повышением синтеза в опухолях желудка будут проведены следующие исследования:

1. Анализ уровня синтеза белков методом Вестерн-блота в образцах замороженных тканей.

2. Выбор белков со стабильными изменениями синтеза в опухолевой ткани.

Сбор образцов биопсийного и операционного материала, крови 3.

больных и образцов крови здоровых лиц с клинико-морфологической характеристикой.

Оценка экспрессии генов выявленных белков в опухолевой и 4.

нормальной ткани методом ПЦР в реальном времени.

Потенциальные белковые маркеры выбирались на основе сведений о их сверхэкспрессии в ткани рака желудка по сравнению с нормальной слизистой. Принципиально важным для нашего исследования является знание о том, в каком из гистологических типов рака желудка – диффузном или интестинальном – наблюдается повышение экспрессии того или иного белка, однако в базах данных далеко не всегда представлены эти сведения. В частности, биоинформатический поиск на основе анализа мРНК, не позволил выявить белки, ассоциированные с тем или иным типом рака желудка. Среди белков, выявленных при проведении 2D электрофореза, обнаружены три, дифференциально экспрессирующиеся в диффузном и интестинальном типе РЖ. Мы также сочли возможным пополнить список потенциальных маркеров на основе данных, представленных в научных публикациях.

Анализ синтеза исследуемых белков в парных образцах замороженных тканей опухолей и нормальной слизистой желудка, полученных при оперативном вмешательстве у больных раком желудка, методом Вестерн-блоттинга позволяет получить данные о различиях уровня белка в опухоли и нормальной ткани одного и того же пациента, при этом исключается проблема межиндивидуальных различий синтеза белка.

Вестерн-блот является необходимым этапом исследований в данной области, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции. Однако использование коммерческих антител не всегда позволяет обнаружить низкокопийные белки, так как антитела недостаточно чувствительны.

В этой связи обязательным этапом наших исследований было проведение оценки генной экспрессии (по уровню мРНК) методом обратнотранскриптазной ПЦР.

Для получения достоверных результатов необходимы репрезентативные выборки больных, поэтому практически на всех этапах выполнения НИР предполагается пополнение регистра больных раком желудка, банка образцов биологического материала, а также формирование группы условно здоровых доноров.

Все вышесказанное определило проведение исследований, результаты которых представлены в отчете.

В исследованиях активное участие принимали студенты и аспиранты Томского государственного университета и Сибирского государственного медицинского университета. Полученные новые сведения будут включены в образовательные программы обучения студентов специалистов, магистров), программы (бакалавров, постдипломного образования ординаторов и аспирантов, выполняющих квалификационные работы по онкологии, патофизиологии, биохимии, иммунологии, программы научно-практических семинаров и конференций для молодых ученых и специалистов практического здравоохранения региона Сибири и Дальнего Востока.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ПОИСК БЕЛКОВ СО СТАБИЛЬНЫМ ПОВЫШЕНИЕМ

СИНТЕЗА В ОПУХОЛЯХ ЖЕЛУДКА

1 Анализ уровня синтеза белков методом Вестерн-блота в образцах замороженных тканей больных раком желудка На первом этапе работы были выбраны потенциальные белковые маркеры, для которых необходимо подтвердить экспрессию в ткани опухолей желудка, и насколько эта экспрессия выше, чем в нормальной ткани.

Фактически должна быть проведена идентификации белков, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто изменяется в опухолях желудка.

Выбор потенциальных маркеров был проведен по результатам 2D электрофореза образцов опухолевой и нормальной ткани от больных РЖ, биоинформатического поиска на основе генной экспрессии по базам данных dbEST, SAGE и Oncomine, а также с учетом сведений, представленных в мировой литературе.

Методом ПЦР с обратной транскрипцией был протестирован уровень транскрипции мРНК этих белков в опухолевой ткани и нормальной слизистой желудка, полученных от больных раком желудка при оперативном вмешательстве. Результаты исследования генной экспрессии подробно представлены в главе 4.

Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка использовали метод Вестерн-блота (с использованием коммерческих антител), который является «золотым стандартом» исследований в данной области, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции.

В настоящем параграфе представлены результаты Вестерн-блот анализа с использованием коммерческих антител. Мы протестировали синтез белков Inhibin Beta-1 (Cat. № NB110-61019), SOD2 (Cat. № NB100-1992), CEACAM6 (Cat.№ NBP1-33513), PI3 (RAI3) (Cat.№ NBP1-19001) c использованием первичных кроличьих антител против белков человека фирмы NOVUS Biologicals (USA), Beta-actin (Thermo Scientific, Cat.№ RB-9421-P1), PPIA (Santa Cruz, Cat.№ sc-20360-R).

1.1 Оценка синтеза белков методом Вестерн-блота в тотальных экстрактах нормальной и опухолевой ткани пациентов с раком желудка Первоначально эксперимент проводили с тотальными экстрактами нормальной и опухолевой ткани пациентов, полученной при оперативном вмешательстве. Использовали 7 пар образцов первичных опухолей желудка (T2N0M0, T3N1M0, T4N2M0, T4N3M0 и T4N1M1) и нормальных тканей, расположенных на расстоянии 10—20 см от опухоли. Образцы, полученные после резекции, максимально быстро замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80С. Отсутствие опухолевых клеток в образцах нормальных тканей подтверждали морфологическим анализом.

1.1.1 Методика приготовления тотальных образцов опухолевой и нормальной ткани Замороженный образец (масса образца в среднем 170 мг) помещали в охлажденную жидким азотом гильзу дисмембратора Mikro-Dismembrator U (Sartorius). Образец гомогенизировали при частоте встряхивания 2000 кГц в течение минут. Затем, полученный гомогенизированный образец переносили в охлажденные жидким азотом пробирки и замораживали при С. Ткани гомогенизировали с помощью шаровой мельницы Sartorius Mikro Dismembrator U (Германия) при 7200 об/мин в течение 60 сек при охлаждении жидким азотом. Половину материала непосредственно растворяли в 5-кратном буфере нанесения Лэммли. Белки из второй половины материала были экстрагированы солевым буфером (см. раздел 1.2.).

1.1.2 Оценка синтеза белка Inhibin Beta-1 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани Описание метода вестерн-блот-анализа с использованием системы SNAP id (Millipore). Белковые экстракты, содержащие 10 мкг белка в 10-15 мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20%). Для количественной оценки тестируемых полипептидов использовали белковый стандарт – ACTB США). После разделения белки подвергали (ThermoScientific, электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Использовали разведение кроличьих антител к человеческому Inhibin Beta-1 в отношение 1:1000 - 3 мкл антител растворяли в 3 мл 0.02-кратном блокирующем буфере (согласно рекомендации производителя системы SNAP id (Millipore)) (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко). Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В контейнер наливали блокирующий буфер (PBS, 1% Tween-20 и 5% обезжиренное сухое молоко) и блокировали в течение 1 часа. Открывали держатель, смачивали подложку mQ водой, укладывали мембрану белками вниз, удаляли пузыри, затем сверху накладывали сухой спейсер и устанавливали контейнер для сбора раствора антител. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали раствор первичных антител к Inhibin Beta-1 (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:1000 - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл 0.02-кратном блокирующем буфере), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20 (PBS-T), при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили в 0.02-кратном блокирующем буфере согласно рекомендациям производителя) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл 0.02-кратном блокирующем буфере, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS-T, при включенном насосе.

Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. №28-9068-38, GE Healthcare). После проявления пленки оказалось, что антитела не выявляли полипептид ожидаемого молекулярного веса – 45 кДа.

Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце тотальных белковых экстрактов, по-видимому, можно объяснить либо низкой чувствительностью данных антител, либо низкой копийностью исследуемого белка в тотальном экстракте.

1.1.3 Оценка синтеза белка RAI3 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани Белковые экстракты, содержащие 10 мкг белка в 10-15 мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20%). После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте спирте, затем промывали в воде mQ. В контейнер наливали блокирующий буфер (PBS, 1% Tween-20 и 5% обезжиренное сухое молоко) и блокировали в течение 1 часа.

Открывали держатель, смачивали подложку mQ водой, укладывали мембрану белками вниз, удаляли пузыри, затем сверху накладывали сухой спейсер и устанавливали контейнер для сбора раствора антител. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали раствор первичных антител к RAI3 (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:500 - 6 мкл антител разбавляли в 3 мл 0.02-кратном блокирующем буфере) (рекомендовано 1:100-1:1000), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tweenпри включенном насосе. Заливали вторичные антитела к 20, иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили в 0.02-кратном блокирующем буфере согласно рекомендациям производителя) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл 0.02-кратном блокирующем буфере, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38, GE Healthcare). После проявления пленки мы обнаружили неспецифическое свечение всей мембраны, что, вероятно, связано с высокой концентрацией АТ (ожидаемая масса исследуемого белка 40 кДа).

а) б) Рисунок 1 – Результаты вестерн - блот анализа содержания белков Inhibinа) и RAI3 в образцах опухоли желудка и нормальных образцах эпителия (б) В связи с тем, что на рентгеновской пленке при тестировании Inhibin Beta-1 (рисунок 1) отсутствовали не только специфические, но и неспецифические белковые сигналы, мы сочли необходимым подтвердить наличие белка на этой мембране. Для этого провели вестерн-блот анализ с антителами к референсному белку Beta-actin в соотношении 1:500 - 6 мкл антител разводили в 3 мл 0.02-кратном блокирующем буфере. На рисунке 2 представлена ожидаемая масса полипептида (42 кДа), свидетельствующая о наличии Beta-actin, а, следовательно, и белка вообще, на исследуемой мембране.

Рисунок 2 – Результаты вестерн-блот анализа содержания -actin в образцах опухоли желудка и нормальных образцах эпителия В этой связи мы уменьшили концентрацию АТ (разведение антитела RAI3 в отношении 1:1000 - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл 0.02-кратном блокирующем буфере) (рисунок 3). Специфического сигнала не выявлено (ожидаемая масса белка 42 кДа). Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце тотальных белковых экстрактов, повидимому, можно объяснить низкой чувствительностью данных антител и и(или) низкой копийностью белка в тотальном экстракте.

Рисунок 3 – Результаты вестерн-блот анализа содержания белка RAI3 в образцах опухоли желудка и нормальных образцах эпителия 1.1.4 Оценка синтеза белка SOD-2 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани Белковые экстракты, содержащие 10 мкг белка в 10-15 мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20%).

После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В контейнер наливали блокирующий буфер (PBS, 1% Tween-20 и 5% обезжиренное сухое молоко) и блокировали в течение 1 часа. Открывали держатель, смачивали подложку mQ водой, укладывали мембрану белками вниз, удаляли пузыри, затем сверху накладывали сухой спейсер и устанавливали контейнер для сбора раствора антител. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали раствор первичных антител к SOD2 (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:5000) - 1 мкл антител разбавляли в 5 мл 0.02-кратном блокирующем буфере, инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе.

Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили в 0.02кратном блокирующем буфере согласно рекомендациям производителя) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл 0.02-кратном блокирующем буфере, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare). Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце тотальных белковых экстрактов (ожидаемая масса белка 25 кДа), по-видимому, можно объяснить либо низкой чувствительностью данных антител либо низкой копийностью исследуемого белка в тотальном экстракте.

Рисунок 4 – Результаты вестерн-блот анализа содержания белка SOD2 в образцах опухоли желудка и нормального эпителия Проверка антитела к SOD2 на позитивном контроле. Растворяли 5 мкг чистого белка SOD из печени быка (коммерческие антитела имеют перекрестную реактивность к человеческому белку), в 10мкл mQ воды. На одну часть мембраны наносили 5 мкл раствора белка, другую – смочили в 70% этиловом спирте, промывали водой mQ и наносили 3 и 2 мкл. Затем сухую часть смачивали в 70% этиловом спирте, промывали водой, укладывали сверху мембрану, разглаживали, чтобы не было пузырей, сверху укладывали сухой спейсер. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали 30 мл коммерческого блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор. Заливали раствор первичных антител к SOD (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:1000 - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл буфере для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко)), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, включаем насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare).

Судя по рисунку 5, мы можем говорить о специфическом связывании тестируемого АТ с белком SOD в двух случаях, где количество белка составляло 2,5 мкг (номер 1, Рисунок 5) и 1,5 мкг (номер 2, Рисунок 5). В случае, где количество белка составляло 1 мкг, специфического связывания с белком не выявлялось, что подтверждает низкую чувствительность этого антитела.

Рисунок 5 – Результаты дот-блот анализа белка SOD2 на позитивном контроле Вывод: Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце тотальных белковых экстрактов, по-видимому, можно объяснить низкой чувствительностью данных антител.

1.1.5 Оценка синтеза белка CEACAM6 в тотальном экстракте опухолевой и нормальной ткани Белковые экстракты, содержащие 10 мкг белка в 10-15 мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20%). После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В держатель укладывали мембрану, сверху помещали сухой спейсер, разглаживали. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали 30 мл блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор. Устанавливали контейнер для сбора раствора антител, заливали раствор первичных антител к CEACAM6 (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:200) - 15 мкл антител разбавляли в 3 мл буфера для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко) (рекомендовано 1:500 – 1:3000).

Инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare).

Рисунок 6 – Результаты вестерн блот анализа содержания белка CEACAM6 в образцах опухоли желудка и нормальных образцах эпителия Вывод: не обнаружено специфического связывания (ожидаемая масса белка 32 кДа), несмотря на высокую (выше указанной в рекомендации производителя) концентрацию антител, взятых в реакцию. Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце тотальных белковых экстрактов, по-видимому, можно объяснить либо низкой чувствительностью данных антител либо низкой копийностью исследуемого белка в тотальном экстракте. Отмечено неспецифическое связывание на уровне 200 кДа.

Для подтверждения того, что тестируемое антитело к CEACAM6 не подверглось инактивации в процессе поставки и находится в рабочем состоянии, мы провели его проверку на позитивном контроле (лейкоциты + линия Molt4). Лизированные лейкоциты, клеточный лизат линии Molt4 и образцы опухолевой и нормальной ткани пациента с диагнозом рак желудка подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10-20%). После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В держатель укладывали мембрану, сверху помещали сухой спейсер, разглаживали. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали 30 мл блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор. Устанавливали контейнер для сбора раствора антител. Заливали раствор первичных антител к CEACAM6 (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:1000) - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл буфера для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко) (рекомендовано 1:500 – 1:3000), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, включаем насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare).

Вывод: на рекомендованных в качестве контроля клетках линии Molt выявляется ожидаемая миграция белка, соответствующая CEACAM6(ожидаемая масса белка 32 кДа). Это дает основания говорить о том, что антитела обладают специфической активностью. Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце тотальных белковых экстрактов, полученных из замороженных тканей (опухоли и нормальной слизистой) желудка, по-видимому, можно объяснить низкой чувствительностью данных антител и невозможностью в связи с этим идентифицировать низкокопийный белок в тотальном экстракте.

Рисунок 7 – Результаты вестерн-блот анализа содержания белка CEACAM6 в лейкоцитах, клеточной линии Molt4, опухоли желудка и нормального образцах эпителия

1.2 Оценка синтеза белков методом Вестерн-блота в растворимой фракции белков, полученной из нормальной и опухолевой ткани пациентов с раком желудка На втором этапе была экстрагирована растворимая фракция белков образцов нормальной и опухолевой ткани 10 пациентов.

1.2.1 Получение растворимой белковой фракции из образцов нормальной и опухолевой ткани желудка К гомогенизированному образцу ткани на холоду добавляли 800 мкл буфера для экстракции (0,12M NaCl, 20mM Tris (pH 7.5), 20 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF), пипетировали в течение 30 секунд до полного его растворения. Затем центрифугировали при 13 тыс.об/мин 10 минут при +4°С. Супернатант переносили в 3 пробирки, добавляли 4 объема ацетона в каждую, выдерживали при -20°С в течение 16 часов. Осадок растворяли в 200 мкл буфера Лэммли. Затем пробирки с супернатантом центрифугировали при 13 тыс.об/мин 10 минут при +4°С, ацетон удаляли, осадок подсушивали при комнатной температуре, растворяли в 150 мкл 5кратном буфере Лэммли, выдерживали при +100°С в течении 10 минут.

Полученный образец подвергали электрофоретическому разделению.

Проводили электрофоретическое разделение белков, окрашивали по Кумасси, оценивали качество экстракции (пример для двух образцов ткани опухоли и нормальной слизистой желудка представлен на рисунке 8).

8 – Результат электрофоретического разделения растворимой фракции белков из образцов нормальной и опухолевой ткани, окраска по Кумасси Примечания 1 T – total- тотальный лизат 2 S – supernatant – экстракт 3 P – pellet – осадок Экстракты растворимой фракции белков (после переосаждения ацетоном) и осадки растворенные в 150 мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле После разделения белки подвергали электропереносу на (10-20%).

поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. На материале 6 пациентов получены 3 мембраны (по 2 пациента на каждой).

1.2.2 Оценка синтеза белка CEACAM6 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В держатель укладывали мембрану, сверху помещали сухой спейсер, разглаживали. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор.

Заливали 30 мл блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор. Устанавливали контейнер для сбора раствора антител. Заливали раствор первичных антител к CEACAM6 разведение (использовали коммерческих антител в отношении 1:1000 - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл буфере для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко)) (рекомендовано 1:500 – 1:3000), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер.

Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare).

Ожидаемая масса полипептида составляет 30-32 кДа, однако, на рисунке 9 видно, что ожидаемой миграции белка не наблюдается. Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце растворимой фракции белковых экстрактов, полученных из замороженных тканей (опухоли и нормальной слизистой) желудка, по-видимому, можно объяснить низкой чувствительностью данных антител и невозможностью в связи с этим идентифицировать низкокопийный белок.

Рисунок 9 – Результаты вестерн-блот анализа содержания белка CEACAM6 в растворимой фракции белков из образцов нормальной и опухолевой ткани 1.2.3 Оценка синтеза белка Inhibin Beta-1 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани Затем эту же мембрану в течение ночи обрабатывали блокирующим буфером (PBS, 1% Tween-20 и 5% обезжиренное сухое молоко) при +4°С, затем в течение 1 часа инкубировали с первичными антителами к белку INHBA в соотношении 1:1000 - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл 0.02-кратном блокирующем буфере рекомендовано После (1:500, 1:100-1:1000).

трёхкратной отмывки мембран буфером PBS с 0,01% Tween-20 их инкубировали в течение часа с конъюгатами пероксидазы хрена с вторичными антителами к IgG кролика. Промывали без использования системы SNAP, чтобы исключить возможную техническую ошибку, связанную с системой SNAP. Затем мембрану укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare).

Рисунок 10 – Результаты вестерн-блот анализа содержания белка INHBA в растворимой фракции белков образцов нормальной и опухолевой ткани Ожидаемая масса полипептида составляет 45-50 кДа, однако, на рисунке 10 видно, что ожидаемой миграции белка не наблюдается.

Отсутствие специфического связывания тестируемого антитела на образце растворимой фракции белковых экстрактов, полученных из замороженных тканей (опухоли и нормальной слизистой) желудка, по-видимому, можно объяснить низкой чувствительностью данных антител и невозможностью в связи с этим идентифицировать низкокопийный белок.

1.2.4 Оценка синтеза белка SOD2 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани Вторую мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В держатель укладывали мембрану, сверху помещали сухой спейсер, разглаживали. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали 30 мл блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор. Устанавливали контейнер для сбора раствора антител.

Заливали раствор первичных антител к SOD2 (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:1000 - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл буфере для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare). Время экспозиции составило 30 минут, на рисунке 11(а) видно слабое свечение на отметке 55 кДа, хотя ожидаемая масса полипептида составляет 28 кДа.

1.2.5 Оценка синтеза белка RAI3 в растворимой фракции опухолевой и нормальной ткани Третью мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В держатель укладывали мембрану, сверху помещали сухой спейсер, разглаживали. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали 30 мл блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор. Устанавливали контейнер для сбора раствора антител, заливали раствор первичных антител к RAI3 (использовали разведение коммерческих антител в отношении 1:500 - 6 мкл антител разбавляли в 3 мл буфере для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко) (рекомендовано 1:100-1:1000), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер.

Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat.

№ RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare). Время экспозиции составило 30 минут. На рисунке 11(б) наблюдается интенсивное неспецифическое свечение всей поверхности мембраны (ожидаемая масса полипептида составляет 40 кДа). Когда мембрану экспонировали в течение 30 секунд, результат аналогичный, т.к. свечение всей мембраны видно невооруженным глазом.

а) б) Рисунок 11 – Результаты вестерн-блот анализа содержания белка SOD2 (а) и RAI3 (б) в растворимой фракции белков образцов нормальной и опухолевой ткани Экстракты растворимой фракции белков (после переосаждения ацетоном) и осадки, растворенные в 150 мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле После разделения белки подвергали электропереносу на (10-20%).

поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Использовали разведение кроличьих антител к человеческому циклофиллину в соотношении 1:500, для которого мы ранее в другом исследовании показали повышение синтеза в опухолях желудка. Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В держатель укладывали мембрану, сверху помещали сухой спейсер, разглаживали. Закрывали держатель, переворачивали, устанавливали его в прибор. Заливали 30 мл блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор. Устанавливали контейнер для сбора раствора антител, заливали раствор первичных антител к циклофиллину (PPIA) в отношении 1:200 - 15 мкл антител разбавляли в 3 мл буфера для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко) (рекомендовано 1:100 – 1:1000), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tween-20, при включенном насосе. Заливали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare). Видна ожидаемая миграция белка (ожидаемая масса полипептида составляет 17 кДа), что подтверждает обоснованность использования данной системы (для постановки реакции Вестерн-блота) для выявления низкокопийных белков в экстракте.

Рисунок 12 – Результаты вестерн блот анализа содержания белка циклофиллина в растворимой фракции белков образцов нормальной и опухолевой ткани Примечание - (S) – супернатант - экстракт растворимой фракции белков Мы предположили, что невыявление специфического связывания протестированных АТ может быть обусловлено тем, что они обладают низкой чувствительностью и специфичностью, поэтому увеличили объем наносимого материала Сделали большие (тестирование CEACAM6).

карманы, 40 мкл. Экстракты растворимой фракции белков (после переосаждения ацетоном) растворенные в 150 мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле После разделения белки подвергали электропереносу на (10-20%).

поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Мембрану после электропереноса белков смачивали в 70% этиловом спирте, затем промывали в воде mQ. В держатель укладывали мембрану, сверху помещали сухой спейсер, разглаживали. Закрывали держатель, переворачивали, установливали его в прибор. Заливали 30 мл блокирующего раствора (ChemiBLOCKER, Cat.№ 2170, Millipore), сливали блокирующий раствор.

Устанавливали контейнер для сбора раствора антител, заливали раствор первичных антител к CEACAM6 в отношении 1:1000 - 3 мкл антител разбавляли в 3 мл буфера для гибридизации (PBS, 1% Tween-20 и 0,1% обезжиренное сухое молоко) (рекомендовано 1:500 – 1:3000), инкубировали в течение 10 минут, включали насос, откачивали раствор в контейнер, снимали контейнер. Промывали 3 раза в течение 30 секунд 30 мл PBS с 0,01% Tweenпри включенном насосе. Заливали вторичные антитела к 20, иммуноглобулинам кролика (конъюгаты пероксидазы хрена с вторичными антителами овцы к IgG кролика, полученные по стандартной методике ОАО "ВНЦДиЛ", разводили согласно рекомендациям производителя в буфере для гибридизации) в соотношении 1: 5 000 - 1 мкл антител разводили в 5 мл буфера для гибридизации, инкубировали 10 минут, инкубировали 10 минут, включали насос. Затем промывали 3 раза 30 мл PBS-T, при включенном насосе. Мембрану, укладывали в кассету, удаляли лишнюю влагу салфеткой, инкубировали 5 минут с растворами ECL (2 мл раствора А и 50 мкл раствора В (Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents, Cat. № RPN2132, GE Healthcare). Затем мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой (Amersham Hyperfilm ECL, Cat. № 28-9068-38GE Healthcare).

Рисунок 13 – Результаты вестерн блот-анализа содержания белка CEACAM6 в растворимой фракции белков образцов нормальной и опухолевой ткани Ожидаемая масса полипептида составляет 30-32 кДа, однако на рисунке 15 видно, что ожидаемой миграции белка не наблюдается.

Таким образом, на основании проведения Вестерн-блот анализа с использованием коммерческих антител для идентификации белков в экстрактах нормальных и опухолевых тканей желудка получены данные, свидетельствующие о низкой чувствительности и специфичности коммерческих антител. Это свидетельствует о необходимости клонирования белков или их фрагментов в бактериях в достаточных количествах для их выделения и очистки с тем, чтобы осуществить получение сиквенсспецифичных поликлональных монореактивных антител с использованием оригинальной технологии, разработанной участниками проекта, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью.

2 Выбор белков со стабильными изменениями синтеза в опухолевой ткани на основе анализа микроРНК В настоящее время в развитых странах мира онкологические заболевания являются второй по распространённости причиной смертности после сердечнососудистых заболеваний [1]. Отчасти это связано с отсутствием доступной возможности диагностики заболевания, эффективной уже на ранних стадиях, когда такие радикальные методы лечения, как хирургия, дают наилучшие результаты. Это делает востребованным разработку диагностических наборов, нацеленных, прежде всего на доступную и неинвазивную – сывороточную – диагностику заболевания.

Выявление опухолеспецифичных диагностических маркеров позволяет получить к ним антитела, которые могут быть использованы для массового скрининга сывороток крови и других биологических образцов пациентов из групп повышенного риска с использованием иммунологических тестов [2].

Традиционные подходы к поиску маркеров различных видов рака не позволяют выявлять маркерные белки с достаточно низким уровнем синтеза в нормальных и опухолевых тканях. Тем не менее, именно эта группа белков представляет наибольший интерес – пригодные для использования в сывороточной диагностике белки должны обладать чрезвычайно низким уровнем синтеза в различных нормальных тканях организма; однако такие белки и в опухоли не будут обладать достаточно высоким уровнем синтеза, детектируемым такими традиционными методами скрининга протеомных изменений как хроматография.

Такие точные и 2D-электрофорез, чувствительные методы как иммуно-ПЦР здесь непригодны, поскольку носят целевой характер и не могут быть применены для крупномасштабного поиска низкокопийных белков с более высокой экспрессией в опухоли по сравнению с нормальной тканью. В то же время, методы крупномасштабного транскриптомного скрининга позволяют лучше изучать гены с низким уровнем экспрессии, однако их применение позволяет получить лишь данные об изменении в исследуемой ткани уровня транскрипта, но не белка.

Что касается рака желудка, исследования с использованием вышеуказанных подходов привели к внедрению в клиническую практику лишь одного диагностического теста, основанного на ПЦР-детекции микрометастазирования в перитонеальной жидкости [3].

МикроРНК – важнейший фактор, определяющий связь уровня синтеза белка и кодирующей его мРНК. Экспрессия микроРНК (в настоящее время у человека идентифицировано более их видов), приводит к посттранскрипционному ингибированию синтеза продуктов целого ряда генов (в среднем около трёхсот на одну микроРНК) в результате гибридизации микроРНК и мРНК-мишеней. Было показано, что ингибирование синтеза микроРНК в опухолевых клетках приводит к активации ряда онкогенов, тогда как активация синтеза микроРНК позволяет блокировать экспрессию генов, супрессирующих развитие опухоли [4]. Учёт изменений microRNAome может послужить своеобразным мостом в применении транскриптомных методов для поиска протеомных маркеров.

В настоящее время не существует альтернативных подходов к молекулярной диагностике опухолей, приближающихся по специфичности и информативности к методу профилирования экспрессии микроРНК [5].

Существующие методы поиска онкомаркеров, основанные на профилировании экспрессии микроРНК в различных опухолях, отборе тех микроРНК, для которых характерно понижение уровня их экспрессии, и дальнейшая идентификация их потенциальных мРНК-мишеней, имеют два существенных недостатка: во-первых, оценка регуляции трансляции проводится только с одной стороны – в то время как часть микроРНК, для которых данная изоформа мРНК является мишенью, обладают пониженным уровнем экспрессии в опухоли, другая часть микроРНК, непосредственно влияющая на трансляцию с данных мРНК, может быть сверхэкспрессирована и подавлять синтез белка – потенциального онкомаркера. Во вторых, необходим учёт изменений экспрессии гена не только на уровне трансляции, но и транскрипции – требуется оценка уровня мРНК, кодирующей данных белок в опухоли по сравнению с нормой.

Предложенный биоинформатический метод поиска потенциальных сывороточных онкомаркеров решает эти две задачи – метод основан на двойном отборе – идентификации генов, для которых повышение экспрессии происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. При этом также проводится оценка степени влияния микроРНК, как с пониженным, так и с повышенным уровнем экспрессии в опухоли.

На первом этапе подход предполагает анализ данных литературы и отбор микроРНК, содержание которых изменено в исследуемом типе опухолей. Далее при помощи базы данных TargetScan [6] осуществляется предсказание потенциальных мРНК-мишеней отобранных микроРНК. При этом каждой паре микроРНК-мРНК ставится в соответствие число (score в TargetScan), отражающее как точность предсказания, так и уровень влияния микроРНК на трансляцию данной мРНК-мишени.

Таким образом, для каждой мРНК может быть вычислено значение скоринг-функции S, отражающее вероятность повышения уровня экспрессии на уровне трансляции:, где и - значения по базе данных TargetScan для микроРНК с понижением и повышением содержания в опухоли, соответственно. В качестве наиболее перспективных отбираются гены с наибольшими значениями S. Коэффициент 2 перед суммой score для микроРНК с повышением уровня экспрессии может быть также увеличен с целью ужесточения критериев отбора генов-кандидатов.

Далее метод предполагает проведение идентификации секреторных белков, которые могут попасть в кровоток. Основной отбор секреторных белков осуществляется при помощи веб-сервиса Babelomics [7].

Дополнительная проверка проводилась по базе GeneCards [8]. Дальнейший отбор белков-кандидатов проводится с применением баз данных Oncomine [9], dbEST (Expressed Sequence Tags database) [10] и SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) [11]. Обязательным условием стало присутствие, как минимум в двух из трёх этих баз, сведений о повышении (в 2 раза или более) уровня мРНК соответствующего гена в рассматриваемом типе опухоли.

Метод применён для поиска сывороточных маркеров рака желудка.

Исходя из данных литературы (проанализировано около 100 источников), идентифицирован ряд микроРНК с дифференциальной экспрессией в опухоли.

В него входит 55 микроРНК, для которых экспериментально показано понижение уровня экспрессии при раке желудка:

hsa-let-7, hsa-miR-101, miR-122a, miR-126, miR-128b, miR-129, miRb, miR-139-5p, miR-141, miR-143, miR-145, miR-148, miR-148a, miR-152, miR-155, miR-15b, miR-16, miR-188, miR-192, miR-215, miR-195, miR-196a, miR-196b, miR-197, miR-19b, miR-200, miR-212, miR-218, miR-24, miR-27a, miR-29, miR-31, miR-331-3p, miR-338, miR-370, miR-375, miR-378, miR-383, miR-433, miR-451, miR-490, miR-497, miR-503, miR-512-5p, miR-545, miR- 551a, miR-567, miR-575, miR-611, miR-630, miR-649, miR-652, miR-663, miR- 768-3p, miR-9;

и 35 микроРНК, для которых показано повышение:

hsa-miR-106a, miR-20a, miR-20b, miR-21, miR-212, miR-221, miR-222, miR-23a, miR-25, miR-26b, miR-27a, miR-30a-5b, miR-320, miR-340, miR-34b, miR-34c, miR-379, miR-409-3p, miR-421, miR-432, miR-518b, miR-650, miRmiR-93.

Для 15998 генов из всего генома человека имелась хотя бы одна соответствующая регулирующая микроРНК из списка отобранных (со всеми, включая и крайне малые значения). Из них выявлено 934 гена, кодирующих секреторные белки. Исходя из значений скоринг-функции S из них отобрано 100 наиболее перспективных.

На следующем этапе при помощи веб-ресурса GeneHub GEPIS (Gene Expression Profiling In Silico) [12] в dbEST определено количество клонов для клонотек нормальной и опухолевой ткани, при помощи Oncomine – ожидаемые изменения уровня транскрипта по данным исследований, в которых оценка экспрессии проводилась с использованием технологии микрочипов [13].

Также проведена оценка изменений уровня мРНК по базе данных SAGE (таблица 1). В качестве окончательных кандидатов отобрано 16 генов, кодирующих секреторные белки, для которых увеличение уровня экспрессии происходит наиболее вероятно, как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции: WNT4, FGF12, NID2, LOXL2, SGCB, EFEMP1, SPON1, F8, LOX, CTGF, C2, MMP11, TNC, IGF2, HSPG2.

Таблица 1- Перечень белков с увеличением уровня экспрессии в опухолях желудка Белок mir Score Mir-down Score Mir-Up Score Mirs down Mirs up WNT4 1,291359 1,862208224 0,285424593 11 2 FGF12 1,579436 2,763878152 0,592221295 9 2 NID2 1,403514 2,533946478 0,565216161 6 2 LOXL2 1,353998 1,884020065 0,265010988 7 1 SGCB 2,126431 3,855861322 0,864714975 12 4 EFEMP1 1,145616 1,747788718 0,301086133 6 1 SPON1 2,683202 3,499118806 0,407958511 10 2 F8 2,327425 2,832457852 0,252516421 11 1 LOX 1,974482 1,974482079 0 5 0 CTGF 1,761459 2,622482223 0,43051162 8 1 C2 1,330409 1,860431422 0,265010988 5 1 MMP11 1,301171 1,301170733 0 6 0 Продолжение таблицы 1 TNC 1,143245 1,940441212 0,398598102 3 2 IGF2 1,043891 2,605056574 0,780582739 12 2 HSPG2 1,193598 1,193597554 0 4 0 В качестве наиболее перспективных из них отмечены гены, обладающие ключевыми регуляторными функциями:

этот секреторный сигнальный белок, кодируемый

1. WNT4 – высококонсервативным геном WNT4, по данным литературы является онкоассоциированным. Он участвует в процессах развития, дифференцировке клеток. Его участие в онкогенезе показано для рака молочной железы и гепатоцеллюлярной карциномы.

2. FGF12 – фактор роста фибробластов. Члены этого семейства ответственны за митогенную клеточную активность, выживание клеток в различных условиях. Также они вовлечены в эмбриональное развитие, рост клеток, морфогенез, репарацию ткани, опухолевый рост и инвазию. Для этого белка показана связь с развитием рака лёгкого и пищевода.

3. EFEMP1 – гликопротеин внеклеточного матрикса, член семейства фибулинов. Ген содержит тандемные повторы, аналогичные последовательностям гена эпидермального фактора роста. Показано повышение уровня экспрессии в глиомах, считается также, что он ответственен за степень инвазивности этого типа опухолей. Однако для ряда других опухолей отмечено снижение уровня его экспрессии: для рака печени и молочной железы.

4. CTGF – митоген, секретируемый сосудистым эндотелием. Содействует пролиферации и дифференциации хондроцитов. Участвует в клеточной адгезии. Показана ассоциация с развитием различных видов рака.

5. HSPG2 – протеогликан, участвующий практически во всех клеточных процессах. Несмотря на то, что он является потенциальным ингибитором пролиферации клеток гладкой мускулатуры, он необходим для поддержания активности факторов роста (например, FGF2 или FGF12), таким образом, стимулируя регенерацию и пролиферацию эндотелиальных клеток. Показано повышение уровня синтеза для рака поджелудочной железы и понижение – для рака молочной железы.

Тем не менее, разработанный подход обладает рядом недостатков – проводится учёт микроРНК только с изменённым в опухоли уровнем синтеза, в то время как влияние микроРНК, для которых такие изменения по данным литературы не выявлены, никак не учитывается; используемые для оценки изменений уровня мРНК базы данных Oncomine, SAGE и dbEST далеко не всегда согласуются между собой и не обладают достаточной информативностью для генов с низким уровнем экспрессии.

Для валидации диагностических и прогностических белковых маркеров, выбранных на основе МикроРНК, необходимы дальнейшие исследования, позволяющие подтвердить повышенный синтеза выявленных белков в опухолях желудка с учетом гистологического типа (интестинального или диффузного), оценить их прогностическую значимость при использовании иммуногистохимических методов, а также рекомендовать наиболее информативные из них в качестве сывороточных маркеров рака желудка. Чувствительность и специфичность этих маркеров должна быть проверена с использованием сывороток от больных раком желудка и условно здоровых доноров.

3 Сбор образцов биопсийного и операционного материала, крови больных и образцов крови здоровых лиц с клинико-морфологической характеристикой

3.1 Формирование группы контроля В процессе выполнения проекта предполагается выявление растворимых белков, для которых будет показана прогностическая значимость, в плане оценки прогноза клинического течения рака желудка.

Для них будут получены высокоаффинные антитела. Для решения задачи получения информативных сывороточных маркеров необходимо проведение оценки эффективности полученных антител методом иммунопреципитации с последующим Вестерн-блот анализом на сыворотках крови, полученных от больных раком желудка и практически здоровых лиц.

Группу контрольных лиц набирали из числа условно здоровых индивидуумов в процессе организованного рекрутирования добровольцев на основе подписания информированного согласия, одобренного этическим комитетом НИИ онкологии СО РАМН. На каждого добровольца заполнялась анкета и была взята кровь из вены для получения сыворотки.

При формировании группы контроля условно здоровым лицам проводили исследование иммунного статуса, индивидуальные данные приведены в табличном виде (Приложение А). Комплексный анализ популяций лимфоцитов периферической крови проводили на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II с использованием готового набора 6 – цветных реагентов (BD Multitest 6-color TBNK Reagent with TruCount Tubes).

Для оценки гуморального звена в сыворотке крови обследуемых лиц определяли IgA, IgM, IgG методом ИФА с использованием тест системы «Иммуноскрин G, M, A –ИФА – БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово).

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови определяли методом, основанном на принципе селективной преципитации комплексов антиген-антитело в 3,6 % растворе полиэтиленгликоля-6000 с последующим фотометрическим определением преципитата (полиэтиленгликоля-6000 (Германия), натрий тетраборнокислый, борная кислота отечественного производства).

При индивидуальном анализе полученных данных не выявлено выраженных нарушений в показателях иммунного статуса у обследованных условно здоровых лиц.

Для создания банка сывороток от здоровых лиц необходимы сведения, подтверждающие, что добровольцы не страдают тяжелыми патологиями (злокачественные новообразования, инфекционные заболевания, предраковые состояния желудка), которые получают в процессе заполнения анкеты врачом в процессе беседы с обследуемым и последующего проведения тестов, позволяющих объективно исключить предраковые состояния желудка Основным методом выявления морфологических изменений слизистой оболочки желудка в настоящее время является гастроскопия с последующим гистологическим исследованием биоптатов. Однако с созданием тест-систем, основанных на технологии иммуноферментного анализа (ИФА), по анализу крови можно определить состояние и функциональную активность всей слизистой оболочки желудка. Этот новый метод исследования является неинвазивным, безопасным и удобным для пациента. В большинстве случаев, с помощью определения трех показателей: наличие антител IgG к Helicobacter pylori и их количество, уровни пепсиногена I, пепсиногена II становится возможным выявить факт инфицирования Helicobacter pylori, наличие атрофии, оценить степень и локализацию процесса. В итоге получают результаты исследования состояния и функциональной активности слизистой оболочки желудка, аналогичные результатам эндоскопии с биопсийным исследованием.

Пепсиногены предшественники протеолитического фермента

– пепсина. Пепсиноген I вырабатывается главными клетками тела желудка (в отличие от пепсиногена II, который вырабатывается во всех отделах желудка и в 12-перстной кишке).

Пепсиноген I секретируется в полость желудка, некоторое количество выявляется в крови. Уровень пепсиногена 1 (PG1) в крови коррелирует с количеством главных клеток в слизистой тела желудка. Атрофия слизистой тела желудка с потерей главных клеток коррелирует со снижением концентрации в крови пепсиногена 1.

Ценную дополнительную информацию о состоянии слизистой оболочки желудка дает количественный анализ сывороточного пепсиногена II а также определение соотношения концентраций (PG2), PG1/PG2.

Использование результатов определения PG1, PG2 и соотношения PG1/PG2 позволяет дифференцировать функциональную диспепсию от серьезной органической гастропатологии (как опухолевой, так и иной этиологии), требующей для установления окончательного диагноза проведения дополнительных исследований. Своевременное выявление патологических изменений и эрадикация инфекции у лиц с H. pylori—ассоциированным атрофическим гастритом или язвенной болезнью предотвращает прогрессирование заболевания, снижает риск осложнений.

Для корректного формирования группы контроля условно здоровым лицам, у которых собраны образцы крови, будет проведен комплекс тестов, для исключения лиц с атрофическим гастритом, как входящих в группу повышенного риска по раку желудка. Эти тесты позволят выявить наличие Helicobacter pylori—ассоциированного гастрита, определить локализацию патологического процесса в желудке (антральный отдел, тело желудка) и оценить характер изменений (является ли гастрит атрофическим).

В панель исследования будет включено минимум 3 показателя:

количественное определение уровня IgG антител к Helicobacter pylori, уровни Пепсиногена I и Пепсиногена II. Всем пациентам с высокими уровнями антител IgG к Helicobacter pylori определяли концентрацию маркёра рака желудка СА 72-4 в сыворотке крови.

Для измерения уровней Пепсиногенов I и II и количественного определения антител IgG к Helicobacter pylori использовались наборы для ИФА анализа компании «Вектор-Бест». Для определения уровня СА 72-4 использовалась тест система компании DRG.

Helicobacter pylori - вид бактерий, часто колонизирующих слизистую желудка человека (до 50% общей популяции). Инфекция может быть бессимптомной или проявляться в виде диспептических расстройств. В настоящее время признано, что именно инфекция Helicobacter pylori является самой распространённой причиной развития хронического гастрита.

Воспалительный ответ, провоцируемый H. pylori, может инициировать далее патологические процессы, которые приводят к развитию атрофического гастрита, пептической язвы, рака желудка.

Для прогноза и принятия клинических решений важно иметь представление о характере и степени тяжести патологического процесса, а также его топографии.

Наличие атрофического H. pylori—ассоциированного гастрита — наиболее существенный независимый фактор, повышающий вероятность развития рака желудка, и один из ведущих факторов развития язвенной болезни. Показано, что у людей со здоровой слизистой риск развития рака желудка низок. Тяжёлый атрофический гастрит тела желудка повышает риск развития рака желудка в среднем в 5 раз по сравнению с остальной популяцией. Тяжёлый атрофический процесс, локализованный в антральном отделе, повышает риск рака желудка в 20 раз, риск язвенной болезни — в 25 раз. При тяжёлом диффузном повреждении всей слизистой желудка риск рака желудка возрастает в 90 раз.

В настоящее время получены сыворотки крови от 40 условно здоровых лиц, которые включены в группу контроля на основании опроса и исследования иммунного статуса.

Проведение комплекса описанных выше исследований позволит исключить из группы контроля лиц, у которых высока вероятность заболевания раком желудка.

3.2 Дополнительный набор клинического материала В отчетный период осуществлялся сбор образцов биопсийного и операционного материала, крови больных с заполнением компьютерного регистра клинико-морфологическими данными. На базе клиники НИИ онкологии СО РАМН собраны дополнительно к имеющемуся банку биологических образцов парные образцы опухолей и нормальных тканей, полученных при хирургическом вмешательстве, от 20 пациентов с диффузным и интестинальным типами первично-диагностированного рака желудка. Все образцы тканей снабжены полной клинической документацией и охарактеризованы гистологически, диагноз заболевания к настоящему времени подтвержден.

–  –  –

В процессе динамического наблюдения осуществляются клиникоинструментальные методы обследования больных для выявления рецидивов или отдаленных метастазов. Осуществляется забор крови на этапах наблюдения. Создание регистра и банка различного типа образцов биологического материала дает возможность адекватного выбора образцов для исследований в соответствии с решаемыми задачами.

4 Оценка экспрессии генов выявленных белков в опухолевой и нормальной ткани методом ПЦР в реальном времени В главе 1 представлены результаты тестирование уровня синтеза белков в опухолевой и нормальной ткани желудка от больных раком желудка.

Использование коммерческих антител не позволило выявить в экстрактах, полученных из замороженных образцов ткани, соответствующих белков, что мы объясняем низкой чувствительностью тестируемых антител, недостаточной для выявления низкокопийных белков.

Для подтверждения экспрессии генов потенциальных белковых маркеров был проведен анализ уровня экспрессии указанных белков в замороженных образцах опухолевых тканей методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией.

Объект исследования. В исследование включены 35 больных раком желудка Т1-4N0-3M0, находящиеся на лечении в клинике НИИ онкологии СО РАМН, с морфологически верифицированным диагнозом и комбинированным лечением. Оценивали основные клиникоморфологические параметры заболевания: возраст пациентов, стадия (TNM), гистологический тип опухоли (таблица 3).

–  –  –

3 N – лимфогенное метастазирование 4 M – гематогенное метастазирование Материал. Материалом для исследования послужили операционный материал рака желудка (РЖ) и образцы нормальной ткани, взятые во время проведения операции. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288), получено разрешение этического комитета института и информированное согласие всех исследованных.

Выделение РНК. Нормальная ткань подвергалась морфологическому исследованию для подтверждения отсутствия опухолевых клеток. После резекции опухоли образцы максимально быстро помещались в жидкий азот и хранились при -80°С. Собранные образцы тканей гомогенизировали с помощью шаровой мельницы Sartorius Mikro Dismembrator U (Eppendorf) при 7200 об/мин в течение 60 сек и охлаждении жидким азотом. Далее измельчённую ткань помещали в раствор RNAlater (Sigma, Inc) и сохраняли для дальнейшего выделения при температуре -800С. Суммарную РНК из опухоли выделяли с помощью набора RNasy mini Kit (Qiagen, Inc). Качество выделенной РНК оценивали электрофоретически по наличию выраженных областей ожидаемой миграции 28S и 18S рибосомальной РНК (рисунок 14).

–  –  –

Рисунок 14 - Электрофореграмма тотальной РНК, выделенной RNasy mini Kit (Qiagen, Inc) из опухоли желудка (1). Маркер молекулярной массы (2) 100bp Видны области ожидаемой миграции: 28 S и 18 S рибосомальной РНК 28S/18S2 Концентрацию и чистоту РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Termo Scientific, USA), пример количественной оценки представлен на рисунке 15 (данный образец был выделен с помощь набора RNasy mini Kit (Qiagen, Inc)). На рисунке видны концентрации РНК от 20-52 нг/мкл и чистота А280/А260 нм = 2,00-2,05 А260/А230 нм = 1,90-2,31 Рисунок 15 - Концентрация РНК в образцах, выделенных из опухоли больных до лечения 20-52 нг/мкл, соотношения А260/А280= 2,00-2,05 и А260/А230= 1,90-2,31 Оценка экспрессии генов. Экспрессию исследуемых генов оценивали с помощью метода обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени. Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAidtm (K1622) (Ферментас, Литва).

Далее с полученной кДНК проводилась ПЦР в режиме реального времени.

Реакционная смесь на 1 пробу (общий объём 15 мкл) содержит: 1,5 мкл буфера для Taq-полимеразы 10-ти кратного (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Трис-HCI, вместе с 15mM MgCl2, 0,1% Tween-20 (поставляется полимеразой)), 1,5 мкл кДНК, 0,75 мкл 50mM MgCl2, 1,5 мкл 2,5 mM dNTP (Сибэнзим, Россия), 0,1 мкл Taq ДНК-полимеразы E 338 (Сибэнзим, Россия), по 1мкл каждого из праймеров с концентрацией 10пмоль/мкл, 1мкл зонда с концентрацией 10 пмоль/мкл и вода milliQ до 15 мкл. Сверху наслаивалось для предотвращения испарения 15 мкл минерального масла Ultra Pure Grade (Медиген, Россия). Для проведения ПЦР применяли пробирки на 0,2 мл (Axygen, USA). Готовили пробирки с праймерами и зондом, в которые добавляли реакционную смесь (из общего пула) вместе с матрицей.

Реакционную смесь раскапывали по 12 мкл в пробирки. 2х-шаговая программа на амплификаторе состоит из следующих этапов: 1 цикл – 94оС в течение 2-х минут для предварительной денатурации; 42 цикла – 94оС в течение 12 сек и 61оС в течение 25 сек с оценкой интенсивности флуоресценции на длине красителя FAM. Относительный уровень экспрессии (по отношению к гену рефери актину-бета ACTB) оценивался по методу Сt с помощью программы Rotor-Gene 6000 Series Software 1.8 (Build 11), ISO 9001:2000 (Reg № QEC21313) (рисунок 16).

Рисунок 16 – Окно программы Rotor-Gene 6000 Series Software 1.8 (Build 11) с отображением кривых флуоресценции исследуемых генов Последовательность праймеров и зондов (FAM) подбирали при помощи программы Oligo Analysis Vector NTI 9.0 с использованием генетического банка данных www.ncbi.nlm.nih.gov.

Использовали следующие праймеры и зонды оригинального дизайна:

RNA CEACAM6 (793bp - 813bp, direct) 0bp Sense 5'-GTGAAATACAGAACCCAGCGA-3' no dimer and duplex Tm=51.8 RNA CEACAM6 (837bp - 857bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-GCCATAGAGGACATTCAGGGT-3' no dimer and duplex Tm=52.1 RNA CEACAM6 (815bp - 833bp, direct) 0bp Probe FAM 5'-TGCCAACCGCAGTGACCCA-3' BHQ1 2 dimer 1 duplex Tm=60.4 RNA GPRC5A (580bp - 596bp, direct) 0bp Sense 5'-CGCCTGCTGCCCTCTTG-3' no dimer and duplex Tm=55 RNA GPRC5A (647bp - 668bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-AGGGACTGTTGTAGCCATTCTG-3' no dimer and duplex Tm=52.5 RNA GPRC5A (605bp - 628bp, direct) 0bp Probe FAM5'-AAGCAGCACCAAGTTCACGGCCAA-3'BHQ1 1 dimer and no duplex Tm=65.3 RNA STK31 (1050bp - 1070bp, direct) 0bp Sense 5'-TCAAACCAGTCAACCTTCAGC-3' no dimer and duplex Tm=51.8 RNA STK31 (1159bp - 1179bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-TAAAGTCACCAACAGCCAAAC-3' no dimer and duplex Tm=49.6 RNA STK31 (1111bp - 1134bp, direct) 0bp Probe FAM5'-TGAAGGATGAAAATGATGCAGGCA-3'BHQ1 3 dimer and no duplex Tm=60.3 RNA NEK6 (216bp - 234bp, direct) 0bp Sense 5'-CCTGTGCATCCTCCTGACC-3' 1 dimer and no duplex Tm=52.4 RNA NEK6 (294bp - 313bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-TGTCCTCGGCCTATCTTCTT-3' 1 dimer and no duplex Tm=51.9 RNA NEK6 (238bp - 257bp, direct) 0bp Probe FAM5'-AGAGGCATCCCAACACGCTG-3'BHQ1 no dimer and no duplex Tm=57.3 RNA ACTB (391bp - 407bp, direct) 0bp Sense 5'-GTGCTGCTGACCGAGGC-3' no dimer and no duplex RNA ACTB (459bp - 477bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-GGCTGGGGTGTTGAAGGTC-3' no dimer and no duplex RNA ACTB (421bp - 444bp, direct) 0bp Probe FAM5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3'BHQ1 no dimer and no duplex RNA INHBA (583bp - 605bp, direct) 0bp Sense 5'-AATGAATGAACTTATGGAGCAGA-3' no dimer and duplex Tm=50.2 RNA INHBA (669bp - 686bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-GGTCACTGCCTTCCTTGG-3' no dimer and duplex Tm=49.

9 RNA INHBA (615bp - 637bp, direct) 0bp Probe FAM5'-TCATCACGTTTGCCGAGTCAGGA-3'BHQ1 1 dimer and duplex Tm=61.3 RNA PI3 (361bp - 380bp, direct) 0bp Sense 5'-TGTTTCGTTCCCCAGTGAGA-3' no dimer and duplex Tm=51.1 RNA PI3 (430bp - 450bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-AGCAGGGACTTAGGACCAGAT-3' no dimer and duplex Tm=51.1 RNA PI3 (403bp - 423bp, direct) 0bp Probe FAM5'-TGTGCCGTCCCCAGAGCTACA-3'BHQ1 3 dimer 1 duplex Tm=60.1 RNA SOD2 (427bp - 448bp, direct) 0bp Sense 5'-TGGTGGTGGTCATATCAATCAT-3' 1 dimer and no duplex Tm=51.5 RNA SOD2 (494bp - 512bp, complementary) 0bp AntiSense 5'-CTTCCAGCAACTCCCCTTT-3' no dimer and no duplex Tm=50.8 RNA SOD2 (468bp - 489bp, direct) 0bp Probe FAM5'-TCAGCCCTAACGGTGGTGGAGA-3'BHQ1 no dimer and no duplex Tm=60.3 Экспрессию генов выражали в долях единицы по отношению к конститутивно-экспрессируемому гену-рефери ACTB.

Статистическую обработку материала проводили с помощью пакета программ “STATISTICA 6.0”. Сравнение уровня экспрессии генов проводили с помощью непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни.

Сравнения частот проводили с помощью теста расхождения.

Результаты. В ходе проделанной работы был определён уровень экспрессии генов GPRC5A, CEACAM6, PI3(RAI3), SOD2, NEK6, INHBA и STK31 в опухолевой и нормальных тканях 35 больных РЖ. В результате сравнения уровней экспрессии исследуемых генов в нормальной ткани и в ткани опухоли желудка в общей группе больных, определенных относительно ACTB, статистически-значимые различия были получены для гена INHBA (p=0,00008). Экспрессия данного гена в опухоли по сравнению с нормальной тканью была более чем в 2,5 раза выше, о чем судили по средним значениям экспрессии данного гена (таблица 4).

Таблица 4 – Уровень экспрессии генов CEACAM6, INHBA, NEK6, PI3(RAI3), STK31, SOD2 и GPRC5A в нормальной и опухолевой ткани в общей группе обследованных больных раком желудка Ген Экспрессия M±SE p Опухоль (n=35) Норма (n=34) CEACAM6 0,114±0,018 0,081±0,012 0,249227 0,015±0,003 0,006±0,002 0,000079 INHBA NEK6 0,028±0,004 0,029±0,004 0,791739 PI3 0,040±0,008 0,033±0,007 0,522432 STK31 0,010±0,004 0,010±0,005 0,254192 SOD2 0,087±0,012 0,067±0,006 0,125394 GPRC5A 0,094±0,048 0,187±0,099 0,193026 Примечания 1 М – среднее арифметическое 2 SE – стандартная ошибка По другим генам статистически значимой разницы между средними уровнями экспрессии в опухолевой и нормальной ткани не отмечено.

Полученные данные свидетельствует о перспективности дальнейшего исследования INHBA в плане возможности его использования для диагностики.

При изучении взаимосвязи экспрессии генов с размером первичного опухолевого узла не установлены корреляционные связи в опухоли и в нормальной ткани. Экспрессия генов также не коррелировала с лимфогенным метастазированием.

Из всех исследованных генов только экспрессия гена CEACAM6 в опухоли больных T1-2 достоверно ниже, чем в опухолевой ткани больных Т3-4 (0,07 против 0,14, р=0,048), но разницы между нормальной и опухолевой тканью у больных Т1-2 не установлено. Есть статистически значимые отличия по уровню экспрессии гена CEACAM6 в нормальной и опухолевой тканях у больных Т3-4 (таблица 5). Известно, что группа белков CEACAM – это адгезивные молекулы, карциоэмбриональные антигены, гликопротеиды, находящиеся на поверхности клеток и играющие важную роль в клеточной адгезии. В норме экспрессия данных генов прекращается до рождения организма, однако экспрессия генов CEACAM повышается при развитии ряда опухолей, например, карцином желудка, лёгких, толстой кишки и др.

–  –  –

Есть сведения, что разные CEACAM белки, хотя и имеют сходное расположение в клетке, могут играть кардинально разные роли в её жизнедеятельности [14]. Так, CEACAM1-4L стимулируют контактное торможение клеточного роста, в то время как экспрессия CEACAM6 и других CEACAM в ряде опухолей приводит к активации пролиферации и уходу от контактного ингибирования роста [15, 16]. Гиперэкспрессия гена CEACAM6 наблюдается при раке лёгкого, раке молочной железы, толстой кишки и др.

Она ассоциирована с инвазией и метастазированием [15, 17]. При этом в исследованиях in vitro было показано, что подавление экспрессии данного гена приводит к полной остановке этих патологических процессов [18]. В этой связи ряд авторов склонны считать CEACAM6 биомаркером метастазов, а его раннюю экспрессию – маркером развития рака желудка [19]. Однако практическое использование этого маркера не подтвердило его информативности для ранней диагностики.

Экспрессия INHBA в опухоли Т1-2 почти в 6 раз выше, чем в нормальной ткани этих же больных (0,018 против 0,0037, р=0,0009), а у больных Т3-4 эта разница заметно меньше (таблица 5). Дифференциальная (различия между опухолью и нормой) экспрессия INHBA наблюдается независимо от статуса лимфогенного метастазирования.

Продукт данного гена – активин А, который образуется при гомодимеризации двух субъединиц INHBA – in vitro воздействует на опухолевые клетки, индуцируя апоптоз и ингибируя активность теломеразы в клетках рака желудка SNU-16 [20]. Однако при клинических исследованиях злокачественных новообразований различных локализаций гиперэкспрессию этого гена в клетках опухоли на ранних стадиях, в основном, связывают с неблагоприятным прогнозом течения заболевания [20, 21, 22, 23].

Возможно, INHBA активируется в ответ на пролиферацию ткани.

Патологический темп деления при этом должен быть скомпенсирован активацией апоптоза и инактивацией теломеразы. Однако при необратимых изменениях в клетках опухоли (нарушение апоптоза и активация теломеразы) INHBA может выступать как фактор более высокой агрессивности течения заболевания.

Таким образом, у больных с более запущенным процессом статистически значимо повышается экспрессия ракового эмбрионального антигена (CEACAM6), что подтверждает данные литературы о его взаимосвязи с прогнозом при раке желудка. Учитывая высокий уровень дифференциальной экспрессии INHBA на ранних стадиях РЖ, этот ген может быть наиболее вероятным кандидатом для ранней диагностики рака желудка.

На следующем этапе мы оценивали уровень экспрессии исследованных генов при диффузном и интестинальном гистологических типах РЖ. При сравнении ткани опухоли диффузного гистологического типа с интестинальным, были отмечены статистически значимые различия в экспрессии гена PI3 (рисунок 17), но дифференциальная экспрессия этого гена ни при диффузном, ни при интестинальном РЖ не была установлена. По уровню экспрессии других генов диффузный и интестинальный РЖ не различались.

–  –  –

Дифференциальной экспрессии при диффузном РЖ не было установлено ни по одному гену. На уровне тенденции наблюдались отличия по экспрессии генов CEACAM6, INHBA и GPRC5A (таблица 6), возможно при увеличении выборки значения дифференциальной экспрессии результаты станут статистически значимыми.

–  –  –

Таким образом, в результате исследования генной экспрессии исследуемых белков выявлены белки, дифференциально экспрессирующиеся в опухолевой и нормальной ткани желудка, с гиперэкспрессией в ткани опухоли. Исследование экспрессии генов в группах больных с диффузным или интестинальным гистологическим типом рака желудка позволило установить гиперэкспрессию генов белков CEACAM6, INHBA и GPRC5A в опухолях диффузного типа и INHBA в опухолях кишечного типа. Это указывает на перспективность исследования указанных белков иммуногистохимическим методом для подтверждения их экспрессии в ткани опухоли с использованием парафиновых блоков.

При этом будет определена их локализация в клетках и связь с прогностическими факторами рака желудка, а также с объективными показателями, характеризующими клиническое течение процесса – рецидивированием, отдаленным метастазированием, продолжительностью жизни после лечения. Это позволит оценить прогностическую значимость указанных маркеров. Для белка GPRC5A будет проведена оценка синтеза в растворимой белковой фракции, полученной из замороженных образцов нормальной и опухолевой ткани, с использованием коммерческого антитела.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем отчете о научно-исследовательской работе по государственному контракту № 02.740.11.0769 от «12» апреля 2010 г.

представлены результаты, полученные при выполнении второго этапа исследований. Разработан новый алгоритм биоинформатического поиска потенциальных белковых маркеров для диагностики и прогнозирования опухолей желудка. Метод включает следующие этапы: 1) идентификацию микроРНК, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто понижается в опухолях; 2) поиск мРНК-мишеней, трансляция которых регулируется микроРНК; 3) сравнительный анализ уровней транскрипции потенциальных мишеней в нормальных и опухолевых тканях. В результате поиска было отобрано семнадцать не идентифицированных ранее потенциальных прогностических маркеров РЖ, кодирующих белки, функционально вовлеченные в процессы клеточной пролиферации и метастазирования.

Проведен анализ экспрессии генов, кодирующих отобранные потенциальные протеомные маркеры рака желудка. Анализ, основанный на оценке уровня синтеза мРНК с использованием обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), позволил выявить те маркеры, содержание которых в опухолевых тканях по сравнению с нормальной слизистой повышалось не менее, чем в 3 раза, у более половины пациентов (INHBA1, SEACAM6, PI3 (RAI3), GPRC5). Анализ уровня синтеза кодируемых идентифицированными генами белков методом Вестернблоттинга с использованием коммерческих антител показал отсутствие сигнала, как в тотальных белковых экстрактах, так и в отдельных фракциях растворимых и нерастворимых белков, полученных после экстракции белков из образцов опухолей и нормальных тканей желудка солевым буфером.

Контрольные эксперименты показали, что это связано: 1) с недостаточной чувствительностью коммерческих антител; 2) с низким уровнем синтеза идентифицированных белков в нормальных и опухолевых тканях.

Дополнены базы образцов биологического материала от пациентов с диффузным и интестинальным типами рака желудка. Сформирована группа условно здоровых лиц, у них собраны образцы крови, составлен электронный регистр. На следующем этапе предполагается исследование комплекса параметров в сыворотке крови, включающих определение инфицированности Helicobacter pylori (по наличию антител IgG), уровня пепсиногена I, пепсиногена II, которые позволят получить сведения о состоянии и функциональной активности слизистой оболочки желудка, аналогичные результатам эндоскопии с биопсийным исследованием. На основе этих результатов будет определены лица с высоким риском развития рака желудка и проведено их исключение из предварительно сформированной контрольной группы. Образцы сыворотки контрольной группы вместе с образцами сыворотки от больных раком желудка будут использованы для тестирования антител, полученных в нашем исследовании, с целью подтверждения их информативности для детекции предложенных нами сывороточных белковых маркеров, ассоциированных с раком желудка.

Регистр и база образцов биологического материала постоянно пополняя.тся. На базе клиники НИИ онкологии СО РАМН собраны дополнительно к имеющемуся банку биологических образцов парные образцы опухолей и нормальных тканей, полученных при хирургическом вмешательстве, от 20 пациентов с диффузным и интестинальным типами первично-диагностированного рака желудка. Все образцы тканей снабжены полной клинической документацией и охарактеризованы гистологически, диагноз заболевания к настоящему времени подтвержден.

Пополнена коллекция образцов опухолей в парафиновых блоках от больных раком желудка (110 человек), для которых есть сведения об отдаленных результатах лечения с глубиной наблюдения от года до 10 лет.

Эти образцы необходимы для проведения исследований по определению прогностической значимости белковых маркеров. Прогностический потенциал идентифицированных в работе маркеров будет оценен в коллекциях опухолей желудка интестинального и диффузного типа, различающихся по агрессивности злокачественного процесса, на следующих этапах НИР. На основе идентифицированных белковых молекул, ассоциированных с РЖ, должна быть создана тест-система для прогнозирования течения заболевания, с учетом различных гистологических типов опухоли.

Таким образом, на отчетном этапе выполнения НИР решена поставленная задача по идентификации протеомных маркеров рака желудка диффузного и интестинального гистотипов на основе оценки генной экспрессии, которые являются перспективными для дальнейшего исследования. Установлено, что чувствительности и специфичности коммерческих антител не хватает для выявления белков в нормальной и опухолевой тканях методом Вестерн-блота, что подтверждает необходимость получения высокоаффинных антител с использованием модифицированного участниками проекта метода. Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных на данном этапе белков в опухолях желудка будет использован иммуногистохимический метод оценки экспрессии белка в опухоли и нормальной ткани желудка с использованием коммерческих антител. Недостаточная чувствительность коммерческих антител при анализе синтеза белка методом вестерн-блота в образцах замороженной ткани может объясняться низкой его концентрацией ввиду разведения при приготовлении экстракта. При ИГХ анализе повышается вероятность выявления белков в ткани. Прогностический потенциал идентифицированных в работе маркеров будет оценен иммуногистохимическим анализом обширной коллекции парафиновых блоков опухолей желудка с использованием коммерческих антител на основе корреляции между повышением уровня синтеза белка и данными о выживаемости пациентов, полученными в результате долговременного наблюдения. Обнаружение белков с избирательно повышенным уровнем синтеза в интестинальном или диффузном типах опухолей откроет возможность создания тест-систем для дифференциальной диагностики рака желудка. Очевидно, что аффинность коммерческих антител к секреторным маркерам будет недостаточной для надёжной детекции маркера, поэтому будет осуществлено получение высокоаффинных поликлональных антител к идентифицированным маркерам с использованием оригинальной технологии. На основе идентифицированных белковых молекул, ассоциированных с раком желудка, предполагается создание тест-системы для диагностики и прогнозирования течения заболевания, с учетом различных гистологических типов опухоли.

Участие студентов из Томского государственного университета и Сибирского государственного медицинского университета и молодых экспериментаторов и специалистов клинического профиля в выполнении НИР обеспечило эффективное освоение ими научных и методических отечественных и мировых достижений в области фундаментальной онкологии и разработки маркеров диагностики и прогноза рака. Студенты выполняют магистерские работы по результатам, полученным в процессе реализации проекта. Опубликовано 2 статьи по теме проекта в центральных российских журналах участниками проекта, принята в печать 1 статья.

Достигнуты заявленные на конец 2010 года значения программных индикаторов и показателей выполнения работ по закреплению в сфере науки и образования научных кадров.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Jemal A., Cancer statistics / A. Jemal, R. Siegel, J.Xu, E.Ward // CA Cancer J Clin. – 2010. – Vol. 60, № 5. – P. 277-300.

2. Jellema P., Value of symptoms and additional diagnostic tests for colorectal cancer in primary care: systematic review and meta-analysis / P. Jellema, D.A.van der Windt, D.J. Bruinvels et al. // H.C. BMJ. – 2010. – Vol. 340. c1269.

3. Fujiwara Y., Genetic detection of free cancer cells in the peritoneal cavity of the patient with gastric cancer: present status and future perspectives / Fujiwara Y. et al. // Gastric Cancer. – 2007. – Vol. 10. – P. 197-204.

4. Bandyopadhyay S., Development of the human cancer microRNA network / S. Bandyopadhyay, R. Mitra, U. Maulik, M.Q. Zhang // Silence. – 2010. – Vol. 1, 6.

5. Lu J., MicroRNA expression profiles classify human cancers / G. Getz, E.A.

Miska et al. // Nature. – 2005. – Vol. 435. – P. 834-8.

6. Friedman R.C., Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs / R.C. Friedman, K.K. Farh, C.B. Burge, D.P. Bartel // Genome

Res. – 2009. – Vol. 19, № 1. – P. 92-105. Режим доступа:

http://www.targetscan.org.

–  –  –

8. Safran M., GeneCards Version 3: the human gene integrator / M. Safran, I.

Dalah, J. Alexander et al. // Database., Oxford. – 2010. – P. baq020. Режим доступа: http://www.genecards.org.

9. Rhodes D.R., Oncomine 3.0: genes, pathways, and networks in a collection of 18,000 cancer gene expression profiles / D.R. Rhodes, S. KalyanaSundaram, V. Mahavisno et al. //Neoplasia. – 2007. – Vol. 9, № 2. – P. 166Режим доступа: https://www.oncomine.org/resource/main.html.

10.Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest

11.Режим доступа: http://cgap.nci.nih.gov/SAGE

12.Zhang Y., GeneHub-GEPIS: digital expression profiling for normal and cancer tissues based on an integrated gene database / Y. Zhang, S.M. Luoh, L.S. Hon et al. // Nucleic Acids Res. – 2007. – Vol. 35. – P. W152-8.

13.Chen X., Variation in gene expression patterns in human gastric cancers / X.

Chen, S.Y. Leung, S.T. Yuen et al. // Mol Biol Cell. – 2003. – Vol. 14, № 8. – P.3208-15.

14.Singer BB., Deregulation of the CEACAM expression pattern causes undifferentiated cell growth in human lung adenocarcinoma cells / B.B.

Singer, I. Scheffrahn, R. Kammerer et al. // PLoS One. – 2010. –Vol. 5, №1. – P. e8747.

15.Litkouhi B., Overexpression of CEACAM6 in borderline and invasive mucinous ovarian neoplasms / B. Litkouhi, B. Litkouhi, E. Fleming et al. // Gynecol. Oncol. – 2008. – Vol. 109, №2. – P. 234-9.

16.Blumenthal R.D., Expression patterns of CEACAM5 and CEACAM6 in primary and metastatic cancers / R.D. Blumenthal, E. Leon, H.J. Hansen, D.M. Goldenberg // BMC Cancer. – 2007. – Vol. 7. – 2 p.

17.Lasa A., High expression of CEACAM6 and CEACAM8 mRNA in acute lymphoblastic leukemias / A. Lasa, E. Serrano, M. Carricondo et al. // Ann Hematol. – 2008. – Vol. 87, №3. – P. 205-11.

18. Lewis-Wambi J.S., Overexpression of CEACAM6 promotes migration and invasion of oestrogen-deprived breast cancer cells / J.S. Lewis-Wambi, H.E.

Cunliffe, H.R. Kim et al. // Eur. J. Cancer. – 2008. – Vol. 44, №12. – P.1770Yasui W., Search for new biomarkers of gastric cancer through serial analysis of gene expression and its clinical implications / W. Yasui, N. Oue, R. Ito, K. Kuraoka, H. Nakayama // Cancer Sci. – 2004. – Vol. 95, №5. – P.385-92.

20.Kim Y.I., Cell growth regulation through apoptosis by activin in human gastric cancer SNU-16 cell lines / Y.I. Kim, B.H. Kim, I. Khang et al.

//Oncol. Rep. – 2009. – Vol. 21, №2. – P. 491-7.

21.Katik I., Activin inhibits telomerase activity in cancer / I. Katik, C.

Mackenzie-Kludas, C. Nicholls et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2009. – Vol. 389, №4. – P. 668-72.

22.Chang K.P., Overexpression of activin A in oral squamous cell carcinoma:

association with poor prognosis and tumor progression / K.P. Chang, H.K.

Kao, Y. Liang et al. // Ann. Surg. Oncol. – 2010. – Vol. 17, №7. – P. 1945Seder C.W., Upregulated INHBA expression may promote cell proliferation and is associated with poor survival in lung adenocarcinoma / C.W. Seder, W. Hartojo, L. Lin et al. // Neoplasia. – 2009. – Vol. 11, №4. P. 388-96.

–  –  –



Похожие работы:

«2 Паспорт теоретического задания заключительного этапа Всероссийской олимпиады профессионального мастерства обучающихся по специальности среднего профессионального образования 09.02.03 Программ...»

«.П.Р....Р.А...М.И.С.Т У...ОГ..М.... П. Торстейнсон, Г. А. Ганеш.NET 2-Е ИЗДАНИЕ (ЭЛЕКТРОННОЕ) Перевод с английского В. Д. Хорева под редакцией С. М. Молявко Москва БИНОМ. Лаборатория знаний УДК 004.7 ББК 32.973.202 Т61 С е р и я о с н о в а н а в 2005 г. Торстейнсон П. Т61 Криптография и безопасност...»

«КОРРЕКТОРЫ СПГ741 Методика поверки РАЖГ.421412.020 ПМ2 РАЗРАБОТАНА: ЗАО НПФ ЛОГИКА (г. Санкт-Петербург) СОГЛАСОВАНА: ФГУП ГЦИ СИ ВНИИМС (г.Москва) Лист утверждения РАЖГ.421412.020 ПМ2 – ЛУ Корректоры СПГ741. Методика поверки 3 Содержание Введение 1 Операции поверки 2 Условия поверки 3 Средства поверки 4 Схема поверки 5 Требован...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северный (Арктический) федеральный университет имени M B. Ломоносова» СМ. Потапенко Задачи регионального содер...»

«Моделирование климата и его изменений В.П. Дымников Институт вычислительной математики РАН Климатическая система (T. Slingo, 2002) Физико-математические основы построения моделей климата Климатическая система Земли включает в себя взаи...»

«Управление, вычислительная техника и информационные технологии УДК 004.93 С.Д. Двоенко, д-р физ.-мат. наук, проф., (4872) 35-36-37, dsd@tsu.tula.ru (Россия, Тула, ТулГУ), Д.В. Шанг, асп., (950) 908-6...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского Факультет вычислительной математики и кибернетики Кафедра математического обеспечения ЭВМ Материалы с...»

«Попробуйте двоичный код! Предлагается веб-сайтом «Попробуй себя инженером» www.tryengineering.org Тема занятия Занятие посвящено принципу действия двоичного кода и его применению инженерами вычислительной техники. В ходе заня...»

«Правила заполнения формы “Анкета застрахованного лица” (АДВ-1) 1. Документ заполняется в соответствии с указанными ниже правилами.2. Документ заполняется чернилами, шариковой руч...»

««УТВЕРЖДАЮ» Декан факультета информатики Э.И. Коломиец _2016 г. ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНЫХ ИСПЫТАНИЙ В МАГИСТРАТУРУ ПО НАПРАВЛЕНИЮ ПОДГОТОВКИ 01.04.02 ПРИКЛАДНАЯ МАТЕМАТИКА И ИНФОРМАТИКА В 2017 ГОДУ Раздел «Математический анализ»1. Достаточны...»

«Краевой конкурс учебно-исследовательских и проектных работ учащихся «Прикладные вопросы математики» Алгебра Численные методы решения алгебраических уравнений и систем уравнений Булычев Сергей, МОУ «Лицей №1» г. Перми, 11 кл Анферов Сергей Дмитриевич, преподаватель инф...»

«Р. Н. Залата АГРЕГАЦИЯ И СТАТИСТИЧЕСКАЯ ПРЕДОБРАБОТКА АККАУНТИНГОВОЙ ИНФОРМАЦИИ С ЦЕЛЬЮ ОПТИМИЗАЦИИ ОПЕРАЦИЙ С СУБД ДЛЯ СИСТЕМ УЧЕТА И МОНИТОРИНГА КОРПОРАТИВНЫХ СЕТЕЙ В процессе разработки систем мониторинга и расчета трафика...»

«Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Национальный исследовательский университет Учебно-научный и инновационный комплекс «Модели, методы и программные средства» Основная образовательная програм...»

«230 УПРАВЛЕНИЕ, ВЫЧИСЛИТЕЛЬНАЯ ТЕХНИКА И ИНФОРМАТИКА УДК 37.018.46:339.138 И.И. Веберова Исследование рынка потребителей как основа позиционирования и продвижения программы дополнительного профессионального образования Рассмотрена одна из ключевых проблем маркетин...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СОГЛАСОВАНО: УТВЕРЖДАЮ: Первый Заместитель Министра Заместитель Министра Российской Федерации по связи образования Российской Федерации и информатизации _ В.Д. Шадриков _ Ю.А. Павленко 10 032000 г. 23_...»

«ДОКЛАДЫ БГУИР №4 ОКТЯБРЬ–ДЕКАБРЬ УДК 621.373.1:621.396.6 ПРОЕКТИРОВАНИЕ ШИРОКОДИАПАЗОННОГО СИНТЕЗАТОРА ЧАСТОТ В.А. ИЛЬИНКОВ, В.Е. РОМАНОВ Белорусский государственный университет информатики и радиоэлектроники П. Бровки, 6, Минск, 220013, Беларусь...»

«Второй (заключительный) этап академического соревнования Олимпиады школьников «Шаг в будущее» по общеобразовательному предмету «Информатика» 10 класс, февраль, 2016 г. Вариант № 2. Задание 1 (12 баллов) Определить...»

«Э. Хант, Д. Тома ПРОГРАММИСТ ПРАГМАТИК Путь от подмастерья к мастеру г* Как бороться с недостатками программного обеспечения _ _ Как создать динамичную и адаптируемую программу Т • ч Как осуществлять эффективное тестирование |Г Как формировать команды...»

«Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова Факультет Вычислительной Математики и Кибернетики Кафедра Математических Методов Прогнозирования ДИПЛОМНАЯ РАБОТА СТУДЕНТА 517 ГРУППЫ Генерация текстурных признаков для биометрической идентификации личности по из...»

«УНИВЕРСИТЕТСКИЙ УЧЕБНИК СЕРИЯ «ПРИКЛАДНАЯ МАТЕМАТИКА И ИНФОРМАТИКА» В. Н. КРУПСКИЙ, В. Е. ПЛИСКО ТЕОРИЯ АЛГОРИТМОВ Допущено Научно методическим советом по математике Министерства образования и науки Российск...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.