WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:   || 2 |

«ТРАНСФОРМАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫХ КАРБОАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В МОДЕЛЬНЫХ И ПРИРОДНЫХ СИСТЕМАХ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ЯРОСЛАВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. П.Г.ДЕМИДОВА»

На правах рукописи

Лебедев Антон Сергеевич

ТРАНСФОРМАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫХ

КАРБОАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В МОДЕЛЬНЫХ И

ПРИРОДНЫХ СИСТЕМАХ

02.00.03 – Органическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Орлов В.Ю.

Ярославль – 2014 Содержание Введение

1. Обзор литературных источников

1.1. Возможные пути трансформации ФКАС в природных средах и продуктах промышленного производства

1.1.1. Неферментативная трансформация

1.1.1.1. Гидролиз

1.1.1.2. Образование металлорганических комплексов

1.1.1.3. Окисление

1.1.1.4. Реакции альдегидов с аминогруппами

1.1.1.5. Декарбоксилирование

1.1.2. Ферментативная трансформация ФКАС

1.1.2.1. Реакции, идущие по карбоксильной группе

1.1.2.2. Дегалогенирование

1.1.2.3. Окисление

1.1.2.4. Ферментативный гидролиз



1.2. Современные подходы к идентификации и количественной оценке ФКАС... 36

1.3. Применение методов квантовой химии для прогнозирования процессов трансформации

2. Экспериментальная часть

2.1. Оборудование и реактивы

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Методика синтеза и очистки протокатеховой кислоты

2.1.3. Используемое оборудование

2.2. Общий алгоритм проведения лабораторных экспериментов по исследованию путей трансформации ФКАС

2.2.1. Состав модельных полиреагентных сред

2.2.1.1. Приготовление модельных сред для изучения процессов трансформации бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой, 2хлорбензойной, протокатеховой, галловой кислот, метилового, этилового, пропилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, фенола, пирокатехина и амида 2-гидроксибензойной кислоты

2.2.1.2. Приготовление модельных сред для изучения трансформации левомицетина и левомицетина сукцината натрия

2.2.1.3. Приготовление модельных сред для изучения трансформации фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты

2.2.1.4. Приготовление модельных сред для изучения трансформации 2гидроксинафталина

2.2.1.5. Приготовление модельных сред для изучения трансформации фенилбензола

2.2.2. Методики количественного определения ФКАС в модельных средах методом ВЭЖХ-УФ

2.2.2.1. Получение электронных спектров ФКАС

2.2.2.2. Подготовка модельных сред перед ВЭЖХ анализом

2.2.2.3. Условия хроматографического разделения

2.2.2.4. Определение величин отношений сигналов абсорбции

2.2.2.5. Калибровка методик идентификации и количественного анализа ФКАС в модельных средах

2.2.2.6. Расчет концентраций ФКАС в модельных водно-органических средах..... 61 2.2.3. Методики идентификации продуктов трансформации ФКАС

2.2.3.1. Анализ методом ВЭЖХ-УФ

2.2.3.2. Анализ методом ГХ-МС

2.2.3.2.1. Подготовка образцов



2.2.3.2.2. Условия ГХ-МС анализа

2.3. Проведение квантово-химических расчетов

2.3.1. Поиск оптимальной геометрической конфигурации, расчет полной энергии соединения

2.3.2. Верификация оптимизированных геометрических конфигураций моделей. 65 2.3.3. Изучение процесса сближения субстратов с каталитическим центром до стадии отрыва воды и тирозинового фрагмента (Тир2) и оптимизация геометрической конфигурации модели субстрат-каталитический центр после отделения тирозинового фрагмента и воды от каталитического центра................. 66 2.3.4. Определение потенциальных реакционных центров микроцистинов........... 67

2.4. Расчет показателей валидации хроматографических методик

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Объекты исследования

3.2. Синтез протокатеховой кислоты из 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида....... 71

3.3. Отработка методов идентификации и количественной оценки ФКАС и продуктов их трансформации

3.3.1. Оптимизация методик количественного определения ФКАС в модельных средах методом ВЭЖХ-УФ

3.3.1.1. Характеристики электронных спектров

3.3.1.2. Определение состава модельных водно-органических сред и процедуры их пробоподготовки для ВЭЖХ

3.3.1.3. Подбор условий ВЭЖХ-разделения

3.3.2. Выбор условий идентификации продуктов трансформации ФКАС.............. 88

3.4. Направления процессов трансформации ФКАС в модельных системах.......... 91

3.5. Поведение силильных производных продуктов трансформации ФКАС при электронном ударе

3.6. Исследование динамики изменения концентрации ФКАС в модельных водноорганических средах

3.7. Оценка пути протекания процессов интрадиольной окислительной дециклизации ароматического кольца пирокатехина и протокатеховой кислоты 117 3.7.2. Выбор рабочей модели каталитического центра ИДДГ

3.7.3. Изучение стадии сближения субстратов с каталитическим центром ИДДГ120 3.7.4. Выявление реакционных центров микроцистинов

3.8. Разработка практических методик количественного определения ряда ФКАС в сложных аналитических матрицах

3.8.1. Методика определения остаточных количеств левомицетина в коровьем молоке методом ВЭЖХ-УФ

3.8.2. Методики количественного анализа эфиров 4-гидроксибензойной кислоты (парабенов) в образцах пищевых продуктов, фармацевтических препаратов и косметических изделий методом ВЭЖХ-УФ

4. ВЫВОДЫ

Список литературы

Приложение 1. Список сокращений

Приложение 2. Калибровочные кривые, уравнения регрессии и коэффициенты достоверности аппроксимации полученные для количественной оценки ФКАС в модельных системах

Приложение 3. Типичные хроматограммы ФКАС, полученные при ВЭЖХ-УФ анализе водно-органических модельных сред

Введение Актуальность работы На сегодняшний день функционализованные карбоароматические соединения (ФКАС, список используемых сокращений представлен в приложении 1), содержащие полярные гетероатомные функциональные группы: карбоксильные, гидроксильные, карбоксамидные, сложноэфирные фрагменты, – находят применение в различных производственных сферах. Прежде всего, следует отметить пищевую, косметическую, фармацевтическую отрасли промышленности. Широкое распространение получило внесение ФКАС в продукцию в качестве добавок – консервантов, обеспечивающих более длительные сроки хранения [1-13]. Многие из них используются как основные действующие компоненты в производстве фармацевтических препаратов [12-15]. Также ФКАС активно применяются в химической промышленности, лабораторной практике как исходные вещества для синтеза новых органических веществ, красителей, пластификаторов, лекарств, биологически активных добавок, в аналитической химии как реагенты, хромофоры, стандарты в калориметрическом анализе [16-20].

В виду широкого распространения подобных соединений происходит их эмиссия в окружающую среду с отходами и стоками производства [1-3], а также при утилизации бракованной и просроченной продукции. Немаловажным моментом является факт присутствия в природных средах и продуктах промышленного производства огромного числа компонентов, выступающих потенциальными реагентами для ФКАС [18, 21]. В связи с этим данные соединения подвергаются разнообразным процессам трансформации, которые могут приводить, в том числе, к образованию более токсичных продуктов, чем исходные структуры [7]. Следует отметить, что химическое поведение функционализованных карбоароматических соединений в лабораторно-контролируемых условиях в присутствии ограниченного количества реагентов достаточно хорошо изучено. Однако при их попадании в сложные по составу среды (природные системы, пищевые продукты, косметические изделия и др.), содержащие множество реакционноспособных компонентов, их превращения, а также динамика трансформации становятся малопредсказуемыми и, соответственно, нуждаются в детальном изучении. Именно поэтому в данной работе рассматривается поведение функционализованных карбоароматических соединений в модельных полиреагентных водно-органических системах, в том числе и в присутствии ферментов эстеразного и оксидазного действия, что еще более расширяет многообразие конкурирующих преобразований.

Другим немаловажным аспектом выступают вопросы идентификации и количественного определения ФКАС, а также продуктов их трансформации в различных сложных матрицах, что является базисом аналитического контроля.

Возникают ситуации, когда полученное в ходе количественного анализа значение не соотносится с реальной величиной, что может вызываться множеством причин, одни из которых – взаимодействие соединений с матрицей образца, трансформация, деструкция вызванная факторами технологического процесса. Эти факты, несомненно, нужно учитывать при идентификации и количественном определении содержания ФКАС в продуктах промышленного производства и природных объектах.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научной работы кафедры органической и биологической химии ЯрГУ, с ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы: НИР «Синтетические возможности функционализации молекулярных карбо-, гетероароматических систем и углеродных наноструктур в жидкой и твердой фазах»

(ГК П841), НИР «Разработка методов определения карбоциклических ароматических соединений и продуктов их деструкции в сложных природных матрицах» (ГК № 14.132.21.1452), программой «УМНИК» НИР «Разработка и оптимизация эффективных методик количественного анализа функционализованных аренов в продуктах питания, косметике, фармацевтических препаратах и природных матрицах» (ГК № 14/17150-2013), а также с проектом № 178 «Процессы формирования и структурные характеристики макро- и наноразмерных полифункциональных органических систем, моделирующих биологические и фармацевтические объекты: роль гомо- и гетеролитических реакций» в рамках базовой части государственного задания НИР ЯрГУ на 2014-2016 годы.

Цель и задачи работы На основе теоретических и экспериментальных данных выявить основные пути и особенности трансформации ФКАС следующих групп соединений:

ароматических карбоновых кислот, фенолов и полифенолов, сложных эфиров, амидов и нитро- производных, а также полиядерных ФКАС, в водно-органических системах.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1) Установление приоритетных путей трансформации ФКАС и продуктов их преобразования в сложных матрицах на основе экспериментальных данных;

2) Оценка динамики трансформации изучаемых соединений;

3) Изучение особенностей взаимодействия ФКАС и продуктов их трансформации с компонентами водно-органических сред, в том числе в присутствии ферментов эстеразного и оксидазного действия;

4) Изучение протекания ключевых стадий трансформации ФКАС на основе экспериментальных данных и результатов квантово-химического моделирования.

Научная новизна На основании полученных данных о структуре продуктов трансформации, а также о динамике изменения концентрации ФКАС в модельных водно-органических средах сделаны заключения о путях превращения ФКАС, в том числе с оценкой роли ферментативных факторов.

Показано влияние структуры реакционного центра и заместителей на характер превращения ФКАС: в рассмотренной системе при наличии сложноэфирной группировки в первую очередь происходит ее трансформация.

Впервые, установлено, что в зависимости от локализации сложноэфирного фрагмента в структуре молекул ацетилсалициловой кислоты, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, а также фенилового эфира 2гидроксибензойной кислоты реализация процесса гидролиза осуществлялась по различным путям (ферментативному и неферментативному), что определяется разными траекториями образования ключевого интермедиата.

Показано, что ключевую роль в трансформации бензойной, 4гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой, протокатеховой кислот, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, фенола, 2гидроксинафталина, фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты, пирокатехина играет процесс окислительной дециклизации ароматического кольца, который приводил к интрадиольному разрыву цикла.

Методами квантово-химического моделирования установлена пространственная структура каталитического центра ферментов пирокатехин-1,2диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы. Выявлены наиболее существенные пространственные параметры комплексов субстрат-каталитический центр у соответствующих ферментов. Впервые проведено моделирование стадии сближения пирокатехина и протокатеховой кислоты с каталитическим центром интрадиолдиоксигеназ. Установлено, что сближение субстрата с каталитическим центром возможно только после депротонирования гидроксильных групп соответствующих субстратов, отщепления воды и разрыва связи тирозин-Fe(III).

Практическая значимость Полученные результаты являются базисом для разработки дизайна и создания биомиметических систем – комплексов тридентатных лигандов с ионами переходных металлов, способных катализировать окислительную дециклизацию ароматического кольца, а также математических моделей прогнозирования сроков естественного очищения почв и водоемов.

Результаты проведенных исследований служат теоретической основой методических комплексов количественного анализа эфиров 4-гидроксибензойной кислоты и продуктов их трансформации в пищевых продуктах, косметических изделиях и фармацевтических препаратах методом ВЭЖХ-УФ; левомицетина в образцах сырого и пастеризованного молока методом ВЭЖХ-УФ.

Положения, выносимые на защиту

- Пути и закономерности преобразования ФКАС и продуктов их трансформации в водно-органических модельных средах;

- Структурные, энергетические и электронные параметры каталитического центра ферментов пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы, а также их комплексов с соответствующими субстратами;

- Особенности протекания стадии сближения субстрата с каталитическим центром фермента.

Апробация работы Результаты диссертационной работы были доложены на: II Международной научной конференции «Молодежная наука – пищевой промышленности»

(Ставрополь, 2011), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии, химии» (Ярославль, 2011), VI Международной молодежной научной конференции «Научный потенциал XXI века»

(Ставрополь, 2012), VII Всероссийской конференции «Научный потенциал - XXI»

(Обнинск, 2012), Конкурсном отборе инновационных проектов УМНИК-2012 (Ярославль, 2012), Научной школе-конференции на английском языке «Science Drive-2012» (Ярославль, 2012), Научно-практическом семинаре «Творчество молодых и охрана интеллектуальной собственности» (Ярославль, 2013), Летней научной школе «Инструменты развития молодого ученого» (Ярославль, 2013), XX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), 66-й научно-технической конференции студентов, магистрантов и аспирантов высших учебных заведений с международным участием (Ярославль, 2013), V Международной Научнопрактической конференции «Научно-техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2013), XIII Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2013).

Публикации Материалы диссертационной работы опубликованы в 5 статьях в рецензируемых журналах рекомендованных ВАК, в 5 материалах докладов и 2 тезисах докладов конференций различных уровней, получен 1 патент РФ.

Структура работы

Работа изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и основных результатов и выводов, приложения. Работа содержит 30 схем, 45 рисунков, 22 таблицы, 10 формул, 3 приложения, список литературы, включающий 196 наименований.

1. Обзор литературных источников

1.1. Возможные пути трансформации ФКАС в природных средах и продуктах промышленного производства Природные среды, а также продукция, производимая пищевой, косметической, фармацевтической и другими отраслями промышленности, преимущественно представлена сложными по составу матрицами, включающими обширную органическую и неорганическую составляющие. Это предопределяет возможность протекания широкого круга химических преобразований как абиотического (неферментативного), так и ферментативного характера. Особенно актуальным становится исследование путей и закономерностей трансформации ФКАС в виду широкого их применения в различных отраслях промышленности [1и необходимости разработки в связи с этим адекватных методик их идентификации и количественной оценки.

Саморегуляция – важнейшее свойство открытых систем, обеспечивающее динамическое постоянство определенных ее параметров. Одними из ключевых механизмов саморегуляции природных экосистем являются процессы трансформации ксенобиотиков (схема 1.1 на примере метилового эфира 4гидроксибензойной кислоты).

К числу основных реакций трансформации ФКАС неферментативной природы можно отнести: гидролиз, комплексообразование, окисление, реакции альдегидов с аминогруппами, декарбоксилирование [1, 3, 16, 20-49]. Зачастую неферментативные реакции являются подготовительным этапом для дальнейших преобразований [21].

Ферментативная трансформация ароматических соединений представлена следующими основными типами реакций: реакции, идущие по карбоксильной группе [21, 23, 46-69], дегалогенирование [21, 46-49, 70-83], дециклизация ароматического кольца [21, 46-49, 84-118], гидролиз [21, 47-49], восстановление [21, 46-49], дезалкилирование [21, 23], дезаминирование [21, 23], десульфирование [21, 23] и рядом других преобразований.

Процессы ферментативной трансформации крайне разнообразны и могут проходить в аэробных и в анаэробных условиях [21, 23, 47-49]. Анаэробные процессы преимущественно локализованы в местах ограниченного доступа кислорода (болота, донные отложения, глубинные слои почв и водоемов) и, как правило, сопровождаются восстановлением органических субстратов [21]. Аэробная трансформация ФКАС протекает намного быстрее анаэробной и вносит основной вклад в естественную очистку природных водоемов от загрязнителей [21]. Обычно в аэробных преобразованиях выделяют два основных этапа: подготовительный и основной. Подготовительный этап направлен на преобразование веществ до ключевых промежуточных продуктов, которые претерпевают дальнейшие превращения в ходе основного этапа.

Схема 1.1 Благодаря присутствию в составе сложных многокомпонентных сред огромного количества химических веществ круг возможных превращений ФКАС потенциально расширяется.

Частью такой многокомпонентной среды являются микроцистины. Это сильнейшие циклические пептидные токсины, продуцентами которых выступают живущие в естественных и антропогенных водоемах цианобактерии [119-125]. Основной мишенью микроцистинов являются сериновые фосфатазы клеток печени – гепатоцитов. Также они оказывают общее цитотоксическое действие, что выражается в нарушении структуры ДНК [119-123].

Их связи азот-углеродные связи медленно подвергаются гидролитическому расщеплению, в связи, с чем они обладают тенденцией к биоаккумуляции [120].

Микроцистины и продукты их трансформации могут реагировать, в том числе и с исследуемыми ФКАС, при этом образующиеся вещества, возможно, будут заметно превосходить по токсичности исходные соединения.

1.1.1. Неферментативная трансформация 1.1.1.1. Гидролиз

Гидролитическое расщепление показано для сложных эфиров, тиоэфиров, амидов, нитрилов [21]. Интенсивность протекания реакций гидролиза во многим зависит от величины pH среды [21, 23]. В целом высокий рН морской воды (pH ~ 8,2) обуславливает существенную роль гидролитических реакций в данной среде, делая их необратимыми, в противоположность этому очень мало природных сред характеризуется низкими значениями pH, достаточными для протекания кислотного гидролиза [21]. К средам с низкими значениями pH можно отнести подзолистые (pH ~ 3,5-4,0), дерново-подзолистые почвы хвойных лесов (pH ~ 5,5), болота, свалки, места сброса органических отходов [21]. В случае вышеуказанных природных сред pH снижается за счет ферментации органических соединений, сопровождающейся образованием органических кислот. Следовательно, необходимо проводить различие между щелочным, нейтральным и кислым гидролитическими механизмами. Следует также учитывать, что и гидролитический, и фотолитический механизмы могут работать одновременно, следовательно, продукты этих реакций не обязательно будут идентичными [21]. Скорость протекания гидролиза может ускоряться на поверхности твердой фазы в присутствии катионов железа, меди, марганца, алюминия, кальция, натрия [21, 23]. Данные процессы могут также катализироваться минералами глин и оксидов металлов. Наиболее существенный вклад вносят реакции на поверхности анатаза (TiO2), гематита (Fe2O3), гоэтита (FeOOH), -оксида алюминия (Al2O3) [23].

1.1.1.2. Образование металлорганических комплексов

Реакции комплексообразования представлены преимущественно взаимодействием гидроксилированных и карбокслированных карбоароматических соединений с металлами [6, 21]. Наиболее распространены комплексы с железом, которое присутствует в природных средах в виде растворимого Fe(II) и обычно нерастворимого Fe(III). Трехвалентное железо чаще всего представлено Fe(OH)3, который нерастворим в воде и не может напрямую участвовать в реакциях комплексообразования. Также трехвалентное железо координационно связано с гуминовыми и фульвокислотами [6, 21] и при определенных условиях может диссоциировать, образуя комплексы с ФКАС. Строение подобных металлоорганических соединений во многом определяется pH среды. Так в кислой среде при взаимодействии Fe(III) с 2-гидроксибензойной кислотой образуется моносалицилат Fe(III), в нейтральной и слабощелочной среде дисалицилат Fe(III) (рис. 1.1) [19].

Рис. 1.1. Комплексы моносалицилата и дисалицилата с Fe(III) Комплексные соединения салицилата с двухвалентным железом нестойки и под воздействием окислителей преобразуются в салицилаты Fe(III). Образование железоорганических комплексов также характерно для различных вин, которые изначально содержат в своем составе 2-гидроксибензойную; 3,4дигидроксибензойную; 3,4,5-дригидроксибензойную кислоты; 1,2дигидроксибензол (рис. 1.2) [10]. Концентрации свободных гидроксилированных субстратов находятся в равновесии с железосодержащими органическими комплексами.

Рис. 1.2. Пример комплекса с Fe (III) 1,2-дигидроксибензолом, образующимся в винах Немаловажную роль в комплексообразовании играют ионы двухвалентной меди [19]. В нормальных условиях концентрация Cu(II) в природных водах и почвах невысока, но применение медного купороса и ряда других медьсодержащих альгицидных и фунгицидных препаратов способствует эмиссии ионов Cu(II) в окружающую среду и предопределяет данный тип взаимодействий с ФКАС.

Способность ФКАС образовывать комплексы с соответствующими ионами металлов применяется в аналитической практике. Так, например, реакция фенольных соединений, а также некоторых ароматических карбоновых кислот с хлоридом железа (III) используется для их качественного обнаружения [19], образование комплексов Fe(III) с 2-гидроксибензойной и ацетилсалициловой кислотами применяются при анализе данных соединений в составе плазмы крови человека (рис. 1.3) [16, 17].

Рис. 1.3. Пример использования реакции комплексообразования при анализе 2-гидроксибензойной и ацетилсалициловой кислот в плазме крови [17]: 1 – комплекс ацетилсалициловой кислоты с Cu (II), 2 – комплекс 2-гидроксибензойной кислоты с Cu (II), 3 – свободная ацетилсалициловая кислота, 4 – свободная 2гидроксибензойная кислота Прочность комплексов ФКАС с металлами во многом зависит от природы комплексообразователя, от природы лиганда, pH среды, а также температуры.

Следует подчеркнуть тот факт, что образование металлорганических комплексов существенно затрудняет дальнейшую трансформацию как ФКАС, так и ионов тяжелых металлов, что способствует усилению их токсического воздействия и расширяет зону возможного распространения [3, 21].

1.1.1.3. Окисление

Еще одним способом неферментативной трансформации ФКАС является окисление. Чаще всего реакции протекают по радикально-цепному механизму вызываемые наличием гидроксильных радикалов [21, 25-38, 126]. Интенсивность реакций радикально-цепного окисления во многом определяются факторами внешней среды.

Наиболее значимыми условиями образования свободных гидроксильных радикалов выступают:

1) Фотолиз нитратов и нитритов [25];

2) Реакция Фентона (схема 1.2): взаимодействие H2O2 с Fe2+ в отсутствии или наличии светового воздействия [26];

3) Фотолиз фульвокислот в анаэробных условиях [27];

4) Реакции комплексов Fe(III) или Cu(II) гуминовых кислот с H2O2 [28].

Схема 1.2 [21]

Одними из наиболее актуальных для изучения выступают процессы радикального окисления фенольных соединений. Большой интерес к изучению полифенолов вызван широким распространением данных соединений в природе и продуктах питания, а также их свойством снижать риск развития атеросклероза, онкологических и сердечнососудистых заболеваний [29-35].

Подобные свойства объясняются высокой антиоксидантной активностью полифенолов, в результате чего данные соединения способны ингибировать процессы радикально-цепного окисления в организме, защищая биомолекулы от окислительного разрушения [33Механизм данного окисления представлен ниже (схема 1.3):

–  –  –

В ходе трансформации фенольных соединений могут образовываться соответствующие хиноны, а также различные димерные и конденсированные соединения (схема 1.4) [30].

–  –  –

С целью исследования антиоксидантов применяется широкий круг методов.

По способам регистрации проявляемой антиокислительной активности можно разделить методы на волюмометрические [127, 128], фотометрические [127, 129хемилюминесцентные [127, 132, 133], флуоресцентные [133], электрохимические [126, 127, 134-138] и ряд более специфических [127, 136, 137].

1.1.1.4. Реакции альдегидов с аминогруппами

Образование оснований Шиффа не является характерной реакцией трансформации ФКАС, т.к.

требует соблюдения ряда принципиальных условий:

неводная среда, а также нейтральный или щелочной pH. Такого рода реакции возможны при наличии эмульгированных липофильных компонентов, таких как жир или ПАВ. Наиболее интенсивное образование оснований Шиффа наблюдается в пищевых продуктах, а также косметических изделиях, в которых в качестве носителя альдегидной группы выступают различные ароматизаторы (ванилин, бензальдегид) и аминокислоты в качестве носителя аминогруппы (схема 1.5) [21].

Схема 1.5

Частным случаем образования оснований Шиффа выступает реакция Маяра [39, 40], представляющая собой взаимодействие альдегидной группы редуцирующих сахаров с аминогруппой аминокислот, проходящая при термическом воздействии [41-45]. Реакция Маяра на сегодняшней день еще недостаточно изучена, в том числе по причине большого разнообразия исходных реагентов, промежуточных и конечных продуктов. Продукты данной реакции имеют темноватый оттенок; образуются в ряде технологических процессов, таких как стерилизация молока-сырья, получение топленого масла и молока, нарушении условий пастеризации меда, производстве пищевых красителей-колеров [11, 14].

Реакция образования оснований Шиффа лежит в основе количественного определения аминокислот методом формольного титрования (метод Сёренсена) [139].

1.1.1.5. Декарбоксилирование

Для ароматических карбоновых кислот характерной реакцией является декарбоксилирование, протекающее при повышенных температурах. В связи с этим, интенсивность протекания данной реакции в природных условиях очень незначительна. Тем не менее, декарбоксилирование может наблюдаться в ходе производства пищевых продуктов (сухое молоко, яичный меланж; рис. 1.4), косметических изделий, фармацевтических препаратов при очистке и высушивании исходных соединений, различных процессах стерилизации, пастеризации, производстве пищевых красителей [11]. Наличие гидроксильных групп в орто- и пара- положениях, а также электроноацептоных заместителей в мета- положении для ароматических карбоновых кислот облегчает декарбоксилирование [21].

Рис. 1.4. Хроматограмма сыворотки сухого обезжиренного восстановленного молока: 1 – 2-гидроксибензойная кислота, 2 – фенол 1.1.2. Ферментативная трансформация ФКАС 1.1.2.1. Реакции, идущие по карбоксильной группе В литературе показаны реакции с аминокислотами (схема 1.6), сульфатами, ацетатами, глутатионом (схема 1.7), глюкуроновой кислотой (схема 1.8) с образованием сложноэфирной, тиоэфирной связей, а также одинарной связи азотуглерод [21, 23, 46-69]. Реакция протекает в две основные стадии: активационную и синтетическую [54]. Активационная стадия заключается в модификации субстрата с образованием соединения субстрат-HS-CoA (рис. 1.5) [56]. Далее следует присоединение конъюгата к активированному субстрату. Реакция требует затрат энергии АТФ [56]. При этом первая стадия проходит при непосредственном участии ферментов, в то время как вторая стадия может протекать и некаталитически, и ферментативно [60-63].

Данный тип реакций, прежде всего, направлен на увеличение гидрофильности субстрата, что приводит к облегчению его дальнейших преобразований [49]. Ниже приведены взаимодействия характерные для бензойной кислоты (рис. 1.11-1.13).

Рис. 1.5. Структура коэнзима А (HS - CoA) Схема 1.6 Схема 1.7

–  –  –

Взаимодействие карбоксильной группы бензойной кислоты с глутатионом может идти до образования бензоилглутатиона, также возможен вариант, в ходе которого глутатион подвергается гидролизу до цистеина с последующим ацилированием до меркаптуровой кислоты [46-49].

В связи с низкой летучестью продуктов конъюгации для анализа чаще применяют метод ВЭЖХ-МС [61, 64, 65] (рис. 1.6).

Рис. 1.6. Хроматограмма продуктов конъюгации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в моче собаки, идентифицированных методом ВЭЖХ-МС [61] 1.1.2.2. Дегалогенирование Наряду с реакциями окисления важное место в утилизации галогенсодержащих ароматических веществ играют реакции дегалогенирования.

Галогенорганические соединения, как правило, характеризуются высокой токсичностью и стабильностью в окружающей среде. В виду широкого применения в промышленности и сельском хозяйстве [21, 76-83] галогенорганические вещества поступают в окружающую среду. Из-за их низкой растворимости в воде и стабильности связей углерод-галоген, многие из этих веществ трудно поддаются трансформации в природе. Существует несколько возможных путей дегалогенирования [21, 33-37, 70-83].

Основной путь – замена галогена на гидроксильную группу (схема 1.9) [70включающий трехстадийное преобразование в 4-гидроксибензойную кислоту, которая в дальнейшем может окисляться по экстрадиольному или интрадиольному пути. Для протекания реакции необходимо образование активированного комплекса 4-хлорбензойной кислоты с коэнзимом А при затрате энергии АТФ [72].

Второй способ – удаление галогена после окислительного разрыва ароматического цикла только на стадии превращения 2-хлормуконлактона в трансдиеноллактон с высвобождением иона хлора (схема 1.10) [83].

–  –  –

1.1.2.3. Окисление Реакции ферментативного окисления большинства ФКАС сопровождаются гидроксилированием, декарбоксилированием или иными путями трансформации до ключевых промежуточных продуктов: 1,2-дигидроксибензола (пирокатехина; схема 1.11, 1.12), 3,4-дигидроксибензойной (протокатеховой) кислоты (схема 1.11, 1.13) [21, 46-49, 84-118], 2,5-дигидроксибензойной (гентизиновой) кислоты [140], 1,2,4тригидроксибензола [21] и др.

Промежуточным продуктом преобразований бензойной, 2гидроксибензойной кислот, фенола и ряда других органических соединений является 1,2-дигидроксибензол [84]. В случае нефенольных соединений требуемая для разрыва ароматического кольца 1,2–дигидроксибензольная структура формируется двойным гидроксилированием с участием ферментов диоксигеназ (схема 1.11).

Фенольные ароматические соединения гидроксилируются монооксигеназами. Один атом молекулярного кислорода включается в субстрат, а другой восстанавливается до воды. Донорами водорода могут служить пиридиннуклеотиды (NADH2 и NADPH). Ароматические вещества с двумя заместителями в положениях 1 и 3 или 1 и 4, а также с большим числом замещающих групп окисляются через образование 3,4-дигидроксибензойной кислоты. Ароматические кольца 1,2-дигидроксибензола и 3,4-дигидроксибензойной кислоты подвергаются разрыву (схема 1.11) и окисляются до янтарной и уксусной кислот, которые в свою очередь минерализуются до углекислого газа и воды.

Ключевую роль в окислительном процессе играет цитохром P 450.

Выделяют два основных пути окислительного разрыва цикла:

экстрадиольный и интрадиольный (схема 1.11). Так, в случае экстрадиольного пути разрыв связи кольца 1,2-дигидроксибензола происходит между атомами C2 и C3 до полуальдегида 2-гидроксимуконовой кислоты, 3,4-дигидроксибензойной кислоты между атомами C4 и C5 до полуальдегида 2-гидрокси 4-карбоксимуконовой кислоты, в случае интрадиольной дециклизации – у 1,2-дигидроксибензола между атомами C1 и C2 до цис,цис-муконовой кислоты, у 3,4-дигидроксибензойной кислоты между атомами C3 и C4 до 3-карбокси цис,цис-муконовой кислоты [97, 103].

Схема 1.11 Ферментативная трансформация – сложный и многостадийный процесс, который целесообразно рассмотреть на примере бензойной кислоты, как одного из типичных представителей ароматических карбоновых кислот.

Трансформация бензойной кислоты сопровождается реакциями оксигенирования, декарбоксилирования, дегидрирования, изомеризации, гидратации (схема 1.12). В этом процессе участвует ряд ферментов: бензоатдиоксигеназная система (БДОГС), пирокатехин-1,2-диоксигеназа, муконат-циклоизомераза, муконолактон-изомераза, 3-оксоадипат-сукцинил-CoA-трансфераза, 3оксоадипатеноллактон-гидролаза, оксоадипил-CoA-тиолаза [103].

БДОГС катализирует механизм преобразования NADH2-зависимого бензойной кислоты в 1-карбокси, 1,2-цис дигидроксициклогекса-3,5-диен, который далее трансформируется до 1,2-дигидроксиензола. БДОГС состоит из ()3субъединиц. Каждая -субъединица включает комплекс флавопротеинредуктазы, содержащей кластер Fe2-S2 (рис. 1.7), ферредоксин и оксигеназный домен (рис. 1.8) [103].

–  –  –

Рис. 1.7. Железосерный кластер флавопротеинредуктазы Рис. 1.8. Каталитический центр оксигеназного домена Данная стадия является лимитирующей, так как проходит с достаточно низкой скоростью и требует проведения реакций оксигенирования, декарбоксилирования, дегидрирования [89-101]. В ходе процесса оксигенирования перенос электронов осуществляется железосерным кластером флавопротеинредуктазы и ферредоксином [114]. На конечной стадии образуется 1карбокси-1,2-цисдигидроксициклогекса-3,5-диен (схема 1.14)

–  –  –

Далее следует декарбоксилирование 1-карбокси, 1,2-цис дигидроксициклогекса-3,5-диена, после чего происходит окисление, приводящее к восстановлению ароматического кольца и образованию 1,2-дигидроксибензола (схема 1.15) [21, 103].

–  –  –

Дальнейшее преобразование 1,2-дигидроксибензола может проходить по путям орто- (схема1.16) и мета- расщепления бензольного кольца с участием пирокатехин-1,2-диоксигеназы. Каталитическим центр в данном случае содержит Fe(III) в качестве координационного атома [114, 115] (рис. 1.9).

Рис. 1.9. Каталитический центр пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протокатехат-3,4-диоксигеназы

–  –  –

После образования муконовой кислоты (схема 1.17) следует ее изомеризация в муконолактон, а затем в 4-оксоадипатеноллактон (схема 1.18). Каталитическим центром муконат-лактонизирующего фермента выступает домен (/)7, включающий пять терминальных аминокислот: две – Асп, две – Лиз и одну – Глу [114, 115].

–  –  –

Далее к карбоксильной группе присоединяется HS–CoA, который активирует молекулу субстрата для дальнейшего гидролитического расщепления до Ac–CoA и янтарной кислоты (схема 1.19).

–  –  –

Помимо экстра- и интрадиольного способов окисления существует путь окисления гентизиновой кислоты (схема 1.20). Ключевым промежуточным продуктом в таком случае выступает 2,5-дигидроксибензойная кислота. Данный комплекс преобразований является минорным и связан с окислением 2гидроксибензоатов [21, 140] до фумаровой и пировиноградной кислот.

Схема 1.20

С позиций химии окружающей среды наиболее интересным для изучения выступает процесс окислительной дециклизации ароматического кольца. Это один из наименее изученных путей преобразования ароматических соединений.

Исследование механизма окислительной дециклизации, в частности стадии сближения ключевых субстратов каталитическим центром фермента, стадии включения молекулярного кислорода в структуру будущих промежуточных продуктов трансформации, конформационных отношений фермент-субстратных комплексов, а также поиск интермедиатов и переходных состояний на каждом этапе

– все это важные вопросы, на настоящий момент требующие детального изучения.

Это особенно актуально в свете развивающего направления, ставящего перед собой целью синтез химических соединений, способных осуществлять процесс окислительной дециклизации ароматического кольца без участия ферментных систем – комплексов тридентатных лигандов с переходными металлами [141-147].

1.1.2.4. Ферментативный гидролиз

Данный процесс наблюдается в средах, содержащих микроорганизмы, которые выступают источником гидролитических ферментов. Гидролизу могут подвергаться сложноэфирные, тиоэфирные группировки, карбоксамидные, фосфатные, эпоксидные и ряд других химических связей [21, 47-48]. В данной работе исходя из перечня объектов исследования (п. 3.1) наибольший интерес представляли реакции гидролитического разрыва сложноэфирных связей. Данный тип преобразований был возможен благодаря катализирующему действию эстеразных ферментов, которые облегчали образование необходимых промежуточных продуктов, в частности тетраэдрического интермедиата – ключевого компонента гидролиза. Для каталитических центров эстеразных ферментов показана достаточно широкая вариативность строения. Центральными и наиболее изученными выступают сериновые эстеразы, каталитический центр которых обычно включает аминокислотные остатки серина, гистидина и аспарагиновой кислоты. Часто также можно увидеть, что данная классическая структура может приобретать определенные, в том числе существенные, модификации: сериновый фрагмент может замещаться на тирозиновый или треониновый, гистидиновый фрагмент может быть замещен лизином или аргинином, а аспарагиновая кислота глутаминовой или иной органической кислотой [99]. Существуют различные данные о месте и роли ферментативного гидролиза в системе трансформации ФКАС. Ряд источников показывают, что гидролиз выступает подготовительной стадией для дальнейших преобразований [21, 23, 93, 124], другие источники приводят данные о возможности протекания гидролиза уже после, основного пула превращений, например, после гидроксилирования и разрыва ароматического цикла [166, 192]. В связи этим, данный вопрос на сегодняшний день нуждается в более детальном изучении.

1.2. Современные подходы к идентификации и количественной оценкеФКАС

В современной аналитической практике для проведения качественного и количественного анализа ФКАС существует большой спектр методов:

титриметрический, спектрофотометрический, электрохимические методы, газовая (ГХ) и высокоэффективная жидкостная (ВЭЖХ) хроматография, хромато-массспектрометрия (ГХ-МС, ВЭЖХ-МС), высокоэффективный капиллярный электрофорез (ВЭКЭ) [15-19, 148-168].

Имеется ряд существенных ограничений, затрудняющих проведение определения ФКАС в природных средах, а также в продуктах питания косметике, фармацевтических препаратах и других аналитических матрицах.

Во-первых, данные объекты, как правило, представлены сложными многокомпонентными образцами, содержащими огромное количество веществ, аналитические сигналы которых могут мешать определению целевых соединений – так называемая проблема селективности. Решение такого рода затруднений производится в ходе подбора оптимальных условий пробоподготовки, позволяющих исключить мешающие соединения из анализируемого образца, либо наоборот извлечь интересуемый аналит из сложной матрицы. Также существует способ подготовки образцов, направленный на получение новых химических соединений на основе структур аналита, тем самым целенаправленно изменяя требуемые физикохимические свойства и облегчая идентификацию и измерение величины сигнала.

Можно перечислить ряд примеров проведения таких преобразований: синтез летучих производных при анализе методом ГХ (силилирование, метилирование, ацетилирование; рис. 1.10), получение флуоресцирующих производных для анализа на флуориметре и хроматографе с флуориметрическим детектором, синтез окрашенных производных для колориметрического анализа [168]. Второй подход заключается в соответствующей настройке измерительного оборудования, способствующей селективному получения интересуемого сигнала.

Рис.1.10. Пример хроматограммы полученных летучих силильных производных фенольных соединений методом ГХ-МС [16]; без предварительного получения производных анализ был бы невозможен Вторым немаловажным затруднением при анализе ФКАС выступает проблема чувствительности. Содержание ФКАС, и, тем более, продуктов их трансформации в реальных аналитических матрицах иногда достигает следовых значений, а величина аналитических сигналов интересуемых соединений может колебаться чуть выше уровня шума. Решение подобных затруднений, как и в вышеуказанном случае, требует комплексного подхода. С одной стороны необходимо применять приемы концентрирования аналитов: увеличение навесок образцов, твердофазное экстрагирование (ТФЭ), упаривание растворителя. С другой стороны правильный подбор условий работы измерительного оборудования также позволяет повысить чувствительность. Определяющим критерием для оценки чувствительности выступает не сама величина сигнала, а её отношение к текущему уровню шума. Это отношение количественно выражается в определении предела обнаружения методики (ПОМ) и предела количественного определения (ПКО). Эти два показателя позволяют оценивать соответствует ли разработанная методика необходимым требованиям относительно критерия чувствительности. Также всегда стоит учитывать то, что приемы, направленные на повышение чувствительности часто вызывают увеличение сигналов не только целевых соединений, но и интерферирующих компонентов (рис. 1.11), что отрицательно сказывается на селективности, в связи с чем необходимо подбирать оптимальные условия подготовки образцов и параметры измерительного оборудования, позволяющие добиваться требуемого уровня чувствительности и селективности.

Рис. 1.11. Хроматограммы, полученные при анализе бензойной кислоты: 1 – с концентрированием, 2- без концентрирования. На хроматограмме (1) при применении приёмов концентрирования возрастают величины сигналов мешающих соединений Некорректное определение параметров аналитических сигналов также может быть сопряжено с проблемами интегрирования. Причиной этого является несовершенство алгоритмов программного обеспечения или некорректное задание критериев обработки сигналов со стороны оператора. Частично проблема решается при помощи «ручного» интегрирования, при этом может наблюдаться ухудшение повторяемости результатов, так как «ручное» интегрирование несет в себе элемент субъективности, исходящий от оператора. Оптимальным решением служит выбор адекватных параметров интегрирования и строгое соблюдение установленных условий анализа.

Для более эффективного решения вышеуказанных затруднений, все чаще в аналитической практике находят применение так называемые методы разделения:

ВЭЖХ, капиллярная ГХ, хромато-масс-спектрометрия, ВЭКЭ, так как они дают возможность более гибкого управления селективностью, чувствительностью и интегрированием. Они могут без существенных ограничений применяться как для идентификации и обнаружения, так и для количественного определения.

Метод капиллярной ГХ – один из наиболее распространенных методов анализа содержания органических соединений в различных природных матрицах и продуктах промышленного производства. Сфера его применения огромна: анализ содержания основного вещества, микропримесей, проверка подлинности продукции [169-172]. Среди достоинств можно выделить высокий уровень чувствительности и точности результатов, возможность проведения анализа для десятков и сотен химических соединений одновременно благодаря высокому значению эффективности разделения (104 – 105 теоретических тарелок для капиллярных колонок). Наряду с достоинствами, метод ГХ имеет существенные ограничения – затруднение или невозможность анализа термолабильных соединений, высококипящих и высокомолекулярных веществ. Примером таких соединений могут служить различные полимеры синтетического и биологического происхождения (пластмассы, пленки, белки, полисахариды), ароматические соединения (многие гидроксибензойные кислоты, антибиотики).

Метод ВЭЖХ нашел широкое применение при анализе ФКАС, так как применим для анализа высококипящих, термолабильных и высокомолекулярных веществ, благодаря возможности проведения анализа в более мягких условиях [11], чем в ГХ. Основным недостатком ВЭЖХ долгое время считалась сравнительно низкая эффективность разделения, в среднем на порядок уступающая капиллярной ГХ, но с появлением ультра-ВЭЖХ этот недостаток уходит на второй план.

Эффективность достигает величин, характерных для капиллярной ГХ, наряду с этим сокращается продолжительность анализа (обычно не более 10 минут). Также еще одним недостатком ВЭЖХ в сравнении с ГХ считается относительно низкий порог чувствительности детекторов в частности для наиболее применяемых в ВЭЖХ – СФМ и ДМД. Этот недостаток компенсируется большим объемом вводимого образца и различными приемами концентрирования.

В последние десятилетия наряду с ГХ и ВЭЖХ все более активно в аналитическую практику внедряется высокоэффективный капиллярный электрофорез (ВЭКЭ) [173]. Также как ГХ и ВЭЖХ данный метод позволяет разделять компоненты образца в капилляре с малым внутренним диаметром (обычно от 25 до 150 мкм) за счет различий миграции веществ в электрическом поле [173]. Графически результаты анализа представляются в виде электрофореграмм – аналога хроматограмм. Все более широкое распространение ВЭКЭ получает благодаря ряду преимуществ: быстрота анализа (обычно до 15 минут), крайне высокая эффективность разделения (105 – 106 теоретических тарелок), простая пробоподготовка, низкий уровень шумов, наличие большого количества методической информации, в том числе по косвенному детектированию (рис. 1.12), простота конструкции и относительно небольшая стоимость оборудования. В сравнении с ВЭЖХ высокая эффективность разделения обусловлена крайне низким размыванием электрофоретических зон, отсутствием мертвого объема системы, малым объемам ввода образца (обычно от 1 до 50 нл) и незначительным внутренним диаметром капилляра [173].

Следует отметить, что наряду с несомненными положительными сторонами метода ВЭКЭ существует и ряд недостатков:

1) Нестабильность времен миграции определяемых веществ, и как следствие, проблемы при идентификации;

2) Необходимость проведения калибровки перед каждой серий анализов;

3) Крайне высокие требования к чистоте буферных растворов.

Чувствительность метода даже к незначительным изменениям в качественном и количественном составе буфера. Буферному раствору при хранении свойственно поглощать минеральные и органические газы из воздуха, прежде всего это углекислый газ, который в водном растворе образует карбонаты, тем самым изменяет его ионную силу. Также буферные растворы, pH которых находится в интервале от 4 до 8, могут активно подвергаться микробиологическим воздействиям. Указанные изменения в составе буфера могут приводить не только к снижению или утрате селективности методики, но и к загрязнению и закупорке капилляра соединениями, продуцируемыми микроорганизмами;

4) Низкая доступность различных модификаторов, входящих в состав буфера: сульфокислот, четвертичных солей аммония, краун-эфиров, аминокислот, гексадиметринбромида и других.

Рис. 1.12. Электрофореграмма сахаров, полученная косвенным детектированием ДМД: 1- фруктоза, 2 – глюкоза, 3 – лактоза, 4 – сахароза [173] Хромато-масс-спектрометрический метод (ХМСМ) – гибридный метод анализа, сочетающий хроматографию (газовую или жидкостную) и массспектрометрию. Метод хорошо зарекомендовал себя при анализе следовых количеств веществ [174].

Среди существенных преимуществ ХМСМ можно выделить следующие:

1) Низкий порог чувствительности масс-селективного детектора, величина которого сильно зависит от способа ионизации и детекции (сканирующий режим или режим детектирования отдельных ионов);

2) Возможность идентификации интересуемых соединений без использования стандартных растворов. Это достигается сравнением получаемого масс-спектра с библиотечными данными. Следует справедливо отметить, что массспектр не является абсолютным критерием при идентификации, т.к. многие гомологи и изомеры дают схожую ионную картину;

3) Высокая селективность. Подбирается выбором измерения сигналов по характеристическим ионам. Более того, современные программы деконволюции позволяют выделить интересуемые сигналы даже при наложении нескольких пиков друг на друга, что является очень мощным аналитическим инструментом.

Несмотря на это, ХМСМ не лишена недостатков:

1) Высокая стоимость оборудования;

2) Наличие специальных требований к реактивам, соединительным устройствам, рабочим блокам. Так, например, для достижения требуемого уровня чувствительности ГХ-МС необходимо наличие вакуума в масс-селективном детекторе, использование более дорогостоящего гелия вместо азота. Для жидкостной хроматографии – запрет на использование нелетучих добавок в водный компонент подвижной фазы, генератор азота для ионизации электроспреем и т.д.

3) Длительная процедура включения масс-селективного детектора.

Каждый из описанных выше методов имеет свои преимущества и недостатки. Некоторые из них (спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, ГХ с детектором электронного захвата) могут быть использованы для анализа относительно узкого числа объектов, другие для более широкого круга соединения.

Специфичность метода зависит от ряда факторов, таких как уровень селективности детектора, порог его чувствительности, возможность или невозможность разделения исследуемой матрицы, конкретных условий подготовки образцов, условий измерения. Значения пределов обнаружения методик анализа ФКАС, соответствующие конкретным аналитическим методам приведены в таблице 1.1.

–  –  –

1.3. Применение методов квантовой химии для прогнозирования процессов трансформации На сегодняшний день эффективным инструментом изучения органических структур и процессов их превращения стала квантовая химия, методы которой сравнимы по точности и возможностям с инструментальными методами исследования. Развитие квантовой химии за последние десятилетия характеризуется как значительным возрастанием количества объектов исследования, так и расширением сферы ее интересов. Прежде всего, развивается направление, связанное с изучением динамики превращений молекулярных систем с более глубоким изучением поверхностей потенциальной энергии [175].

Существуют два принципиальных подхода к оценке структуры и свойств химических соединений. Первый подход заключается в проведении физикохимических испытаний, качественного и количественного анализа, кинетических исследований. Часто такого рода опыты и испытания требуют наличия определенной приборной базы, стабильных поставок расходных материалов, длительных временных затрат. При этом возникают затруднения при анализе неустойчивых соединений, молекул в возбужденных состояниях, интермедиатов [176]. Иной подход представляет собой квантово-химические расчеты (КХР), результатами которых выступают данные об интересуемых свойствах и параметрах молекулы. В современном варианте КХР проводятся при помощи мощной вычислительной техники и специализированных программ [177].

На сегодняшний день все большее распространение получают работы, посвященные моделированию реакций трансформации ФКАС [92-103]. В большинстве работ используются методы теории функционала плотности (DFT).

Это объясняется, с одной стороны, меньшей вычислительной нагрузкой, и следовательно, снижением временных затрат на получение необходимых данных, с другой стороны, полученные методами DFT данные в большинстве случаев хорошо соотносятся с экспериментальными значениями, т.е. являются довольно надежными.

В отличие от методов ab initio, которые концептуально начинаются с описания индивидуальных электронов, взаимодействующих с ядрами и всеми другими электронами в системе, теория функционала плотности начинается с рассмотрения полной электронной системы. В основу DFT положена модель Томаса

– Ферми, а также теоремы Хоэнберга – Кона.

В DFT полная энергия складывается из трех составляющих: кинетической энергии, кулоновской энергии взаимодействия всех заряженных частиц в системе и, так называемой, обменно-корреляционной энергии, которая учитывает все многочастичные взаимодействия [177]. Подход, основанный на теории функционала электронной плотности позволяет учесть корреляцию электронов, используя только единственный определитель. Основная идея этого подхода в том чтобы включить обменно-корреляционную энергию непосредственно в одноэлектронные уравнения [175, 176]. Узкое место этого метода в том, что точное выражение для обменнокорреляционной энергии неизвестно. Лучшее, что есть на сегодняшний день – это приближенное выражение, полученное из теории однородного электронного газа.

Поэтому методы функционала плотности не относятся к неэмпирическим методам.

DFT открывает перед исследователем широкие возможности в проведении расчетов больших систем (в том числе кристаллов). Однако в рамках подхода, основанного на функционале электронной плотности, существует еще одно направление, которое можно назвать «концептуальной теорией функционала плотности». Как выяснилось, аппарат метода DFT позволяет заново рассмотреть основы целого ряда химических концепций и принципов, таких, например, как электроотрицательность, теория мягких и жестких кислот и оснований и др. [176].

Обращение к теории функционала плотности позволяет лучше понять природу этих понятий, дать им формализованные определения и, наконец, рассчитать соответствующие величины.

Одним из наиболее эффективных и популярных на сегодняшний день является метод гибридных функционалов B3LYP (Becke, three-parameter, Lee-YangParr), обменно-корреляционный функционал которого выражается следующей формулой 1.1 [176]:

–  –  –

EcLDA – приближение локальной плотности VWN (Vosko-Wilk-Nusair) к корреляционному функционалу.

Таким образом, существует огромное количество возможных путей трансформации ФКАС, отличающихся еще более обильным перечнем возможных промежуточных и конечных продуктов. Установление приоритетных путей протекания процессов трансформации ФКАС позволит в дальнейшем более эффективно выработать адекватные способы ремедиации природных систем, создавать химические структуры катализирующие распад и модификацию ФКАС в менее токсичные соединения, разрабатывать методики идентификации и количественной оценки ФКАС и продуктов их преобразования в природных средах, косметике, напитках, продуктах питания, лекарственных средствах и других сложных полиреагентных средах. Идентификация с помощью инструментальных методов позволяет выявлять преобладающие пути протекания химического преобразования в тех или иных условиях, изучить кинетику превращений, идентифицировать и оценить количественно получаемые продукты. При этом для изучения механизмов реакций часто применения одних только инструментальных методов становится недостаточно. В этом случае используют методы квантовой химии и сопоставляют получаемые данные с результатами лабораторного эксперимента, что в целом повышает надежность исследования.

2. Экспериментальная часть 2.1. Оборудование и реактивы 2.1.1. Реактивы

HPLC-grade вода (вода первого класса чистоты для ВЭЖХ);

Бензойная кислота (БК), х.ч., ГОСТ 10521-78 после двойной перекристаллизации из HPLC-grade воды;

4-Гидроксибензойная кислота (4-ГБК), ч., ТУ 6-09-3646-74 после двойной перекристаллизации из HPLC-grade воды;

кислота имп., после двойной 2-Гидроксибензойная (2-ГБК), перекристаллизации из HPLC-grade воды;

Салициловый эфир уксусной кислоты (ацетилсалициловая кислота; АцСал), фарм., после экстракции хлороформом;

Метиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты (МП), имп.;

Этиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты (ЭП), имп.;

Пропиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты (ПП), имп.;

2-Хлорбензойная кислота (2-ХБК), имп., после двойной перекристаллизации из HPLC-grade воды;

Фенол (Фн), ч.д.а., ГОСТ 23519-79, после очистки методом колоночной хроматографии с силикагелем;

(пирокатехин; ПКХ), имп., после двойной 1,2-Дигидроксибензол перекристаллизации из толуола и очистки методом колоночной хроматографии с силикагелем;

синтезированный окислением пирокатехина оксидом 1,2-Бензохинон, серебра в безводном диэтиловом эфире;

4-Гидрокси-3-метоксибензальдегид (ванилин), х.ч., ГОСТ 16599-71, после двойной перекристаллизации из HPLC-grade воды;

3,4-Дигидроксибензойная (протокатеховая; ПКК) кислота, синтезированная из ванилина по п. 2.1.2.;

(галловая; ГК) кислота, ч., после 3,4,5-Тригидроксибензойная перекристаллизации из HPLC-grade воды, экстракции этилацетатом и очистки методом колоночной хроматографии с силикагелем;

Амид 2-гидроксибензойной кислоты (САм), ч., после перекристаллизации из HPLC-grade воды;

4-Нитрофенил-2-дихлорацетиламино-1,3-пропандиол (Левомицетин (ЛМ)), РСО 9348-152-00494189 с массовой долей основного вещества 99,15 %;

натрия 4-Нитрофенил-2-дихлорацетиламинопропандиол-1,3 3-сукцинат (Левомицетина сукцинат натрия (ЛМС)), фарм., ТУ 9348-89767728-2011;

Фениловый эфир 2-гидроксибензойной кислоты (ФнСал), имп., после экстракции в системе хлороформ-гидроокись натрия (10 %);

Фенилбензол (ФБ), ч.д.а., ГОСТ 4254-76, после экстракции в системе гексангидроокись натрия (10 %);

2-Гидроксинафталин (2-ГН), ч.д.а., ТУ 6-09-5418-88, после двойной перекристаллизации из 10 % гидроокиси натрия, экстракции хлороформом и очистки методом колоночной хроматографии с силикагелем;

N-триметилсилилимидазол, имп.;

Аммоний уксуснокислый, х.ч., ГОСТ 3117-78;

Гидроокись натрия, ч.д.а., ГОСТ 4328-77;

Гидроокись калия, ч.д.а., ГОСТ 24363-80;

Железистосинеродистый калий 3-водный, х.ч., ГОСТ 4207-75;

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76;

Цинк сернокислый 7-водный, ч.д.а., ГОСТ 4174-77;

2-Аминоэтансульфоновая кислота (таурин), имп;

Азид натрия, имп., 99 %;

Ацетонитрил, ос.ч. 1-й сорт, ТУ 6-09-14-2167-84;

Гексан, х.ч., ТУ 2631-061-44493179-01 с изм.1;

Диэтиловый эфир, х.ч., ТУ 2600-001-4385-2015-05;

Ортофосфорная кислота, имп.;

Пиридин, имп.;

Пропанол-2, х.ч., ТУ 2632-009-00207787-02;

Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья «Экстра», ГОСТ Р 51652-2000 с изм.;

Уксусная кислота ледяная, х.ч., ГОСТ 61-75;

Хлороформ, х.ч., ТУ 2631-066-44493179-01 с изм. № 1, 2;

Этилацетат, х.ч., ТУ 2634-058-44493179-01 с изм.1;

2.1.2. Методика синтеза и очистки протокатеховой кислоты

Ванилин подвергался двойной перекристаллизации из HPLC-grade воды и высушивался в сушильном шкафу при температуре не выше 70 oC.

В стакан из нержавеющей стали емкостью 100 мл помещалось 20,0 г.

гидроокиси калия и 5,0 г. гидроокиси натрия. Смесь щелочей нагревалась до перехода в жидкое состояние, и затем, не допуская вспенивания, порционно вносилось 9,0 г. очищенного ванилина. Постепенно температуру реакционной смеси доводилась до 185-190 oC. Затем сосуд быстро нагревался до температуры (245±0,3) o C. Данная температура поддерживалась в течение 6,5 минут. По истечению указанного времени нагрев прекращался, сосуд охлаждался до температуры ~ 60-70 o C. Далее сплав по каплям подкислялся раствором разбавленной ортофосфорной кислоты (~ 4 %) до значения pH ~ 6-7 (контроль по универсальной индикаторной бумаге).

Подкисленный раствор немедленно фильтровался через бумажный фильтр «красная лента» для отделения от раствора образующихся нерастворимых соединений. Фильтрат выстаивался около 16-18 часов при комнатной температуре.

Полученный коричневатый осадок отделялся центрифугированием с последующей декантацией образовавшегося осадка. Осадок подвергался перекристаллизации из воды. На 1 г. осадка брали 3 мл HPLC-grade воды. В результате соблюдения всех процедур синтеза получали кристаллы серовато-коричневого цвета. Для дополнительной очистки использовалась колоночная хроматография с силикагелевым адсорбентом, растворитель – этилацетат.

Подлинность и чистота проверялась методами ВЭЖХ (рис. 3.2, рис. 3.4), ИКспектроскопии, определением температуры плавления, которая для протокатеховой кислоты составляла 198-199 oC [178].

2.1.3. Используемое оборудование

ВЭЖХ-анализ проводился на хроматографической системе UltiMate-3000 фирмы Dionex, укомплектованной вакуумным дегазатором, градиентным насосом с возможностью смешивания до трех компонентов элюента, автоматическим пробоотборником с диапазоном ввода образца от 0,1 до 100,0 мкл, термостатом колонок, спектрофотометрическим детектором позволяющим регистрировать аналитические сигналы на четырех длинах волн одновременно, и хроматографической рабочей станцией Chromeleon 6.80.

ГХ-МС анализ осуществлялся с помощью системы Agilent GC 7890A c автосамплером (7693) и масс-селективным детектором (5975С). Особо чистую воду (HPLC-grade) получали на установке Simplicity UV (Merck Millipore). УФ-спектры анализируемых соединений снимали на спектрофотометре UNICO 2802PC, pH водного компонента подвижной фазы контролировали на потенциометре И-160М.

Исследуемые модельные среды термостатировали в термостате Sanyo MIR-254.

Центрифугирование проводили на центрифуге Взвешивание Sigma 2-6E.

осуществляли на весах 1-го класса точности AND GR-300.

2.2. Общий алгоритм проведения лабораторных экспериментов по исследованию путей трансформации ФКАС Для изучения приоритетных путей трансформации ФКАС было необходимо подобрать состав рабочих модельных сред, а также соответствующие аналитические подходы. Предварительно требовалось получить данные ряда физико-химических и аналитических характеристик исследуемых объектов (электронные спектры, растворимость в различных растворителях, сорбируемость на неполярных сорбентах и др.).

Изучение путей трансформации ФКАС проводилось с двух основных позиций: идентификация образующихся продуктов трансформация ФКАС в ходе протекания реакций трансформации, которая проводилась методами ВЭЖХ-УФ и ГХ-МС, а также изучение динамики изменения концентрации методом ВЭЖХ-УФ направленное на оценку вклада неферментативного и ферментативного факторов в процессы преобразования ФКАС.

2.2.1. Состав модельных полиреагентных сред

Состав модельных водно-органических полиреагентных сред (табл. 2.1) был выбран с учетом обеспечения возможности протекания как неферментативных, так и каталитических ферментативных процессов.

В качестве субстрата для протекания реакций трансформации в среду вносились исследуемые ФКАС, концентрация которых подбиралась для исходного индивидуально (от 1,6 до 100 мг/дм3). В ряде случаев для улучшения растворимости ФКАС в модельную среду вносилось от 0,5 до 2,5 % этилового спирта или ацетонитрила. Для поддержания стабильного pH (~ 6,86) в модельные среды вносились гидрофосфаты натрия и калия (до концентрации 0,025 М).

Источником действующих ферментов эстеразного и оксидазного действия (пирокатехин-1,2-диоксигеназы и протиокатехуат-3,4-диоксигеназы) выступала суспензия хемоорганогетеротрофных микроорганизмов (СХМ), предварительно выращенная на селективных питательных средах. Данная суспензия вносилась во все варианты модельных полиреагентных сред.

Для обеспечения возможности протекания исключительно неферментативных преобразований в модельные среды вносился ингибитор ферментативной активности – азид натрия до концентрации 500 мг/дм3.

Модельные образцы выдерживались в термостате при 25 oC без доступа света, длительность проведения реакций для каждого модельного раствора приведено ниже (табл. 2.2).

Для приготовления СХМ в 100 см3 стерильного мясного бульона при помощи бактериологической петли вносились культуры Pseudomonas putida, Pseudomonas аeruginosa, Rhodococcus opacus, выращенные методом накопительной культуры из образцов воды реки Волга; отбор образцов производился близ Ярославского судостроительного завода. В качестве селективной питательной среды для для P.

putida использовалась среда с глюкозой как единственным источником углерода и нитрофурантоином как ингибитором посторонней микрофлоры, для P. аeruginosa – среда ацетамидного агара, для Rh. opacus – минеральная среда с добавлением 4хлор-1,2-диоксибензола. Мясной бульон готовился следующим образом: в коническую колбу на 250 см3 помещалось 25 г. говяжьего фарша, который заливался 25 см3 подогретой водопроводной воды, раствор настаивался в течение двух часов.

Далее раствор кипятился 30 минут для денатурации белков и фильтровали сначала через вату, а затем через бумажный обеззоленный фильтр «красная лента», доводили полученный объем фильтрата до 50 см3 водопроводной водой, далее раствор снова кипятился в течение 30 мин. Мясной бульон с внесенными культурами помещался в термостат при 25 oC на семь суток

–  –  –

2.2.1.1. Приготовление модельных сред для изучения процессов трансформации бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой, 2-хлорбензойной, протокатеховой, галловой кислот, метилового, этилового, пропилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, фенола, пирокатехина и амида 2-гидроксибензойной кислоты В мерную колбу вместимостью 250 см3 количественно переносилось 0,025 г.

исследуемого ФКАС; 0,250 г. 2-аминоэтансульфоновой кислоты; 20 мкл суспензии СХМ, объем доводился до метки водным фосфатным буферным раствором (0,025 М Na2HPO4; 0,025 М KH2PO4; pH ~ 6,86). Для обеспечения протекания исключительно неферментативных процессов использовалась модельная среда идентичного состава с внесением 0,125 г. азида натрия.

2.2.1.2. Приготовление модельных сред для изучения трансформации левомицетина и левомицетина сукцината натрия В мерную колбу на 50 см3 при помощи 5 см3 этилового спирта и HPLC-grade воды количественно переносилось 0,005 г. левомицетина или левомицетина сукцината натрия. Объем доводился до метки водой. Концентрация ФКАС составляла 100 мг/дм3. 5 см3 данного раствора вносилось в мерную колбу на 100 см3.

В данную емкость с помощью фосфатного буферного раствора переносилось 0,100 г. 2-аминоэтансульфоновой кислоты и 8 мкл СХМ, объем доводился до метки фосфатным буферным раствором. Для обеспечения протекания исключительно неферментативных процессов модельная среда готовилась аналогичным образом, но с добавлением 0,050 г. азида натрия.

2.2.1.3. Приготовление модельных сред для изучения трансформации фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты В мерную колбу на 50 см3 при помощи ацетонитрила переносилось 0,010 г.

фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты. Концентрация фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты составляла 200 мг/дм3. Объем доводился до метки ацетонитрилом. Далее в мерную колбу на 100 см3 предварительно вносилось 1,5 см3 ацетонитрила, исходного 1 см3 ацетонитрильного раствора фенилового эфира 2гидроксибензойной кислоты. В данную колбу при помощи фосфатного буферного раствора переносилось 0,100 г. 2-аминоэтансульфоновой кислоты и 8 мкл СХМ, объем доводился до метки фосфатным буферным раствором. Для обеспечения протекания исключительно неферментативных процессов модельная среда готовилась аналогичным образом, но с добавлением 0,050 г. азида натрия.

2.2.1.4. Приготовление модельных сред для изучения трансформации 2-гидроксинафталина

В мерную колбу на 100 см3 при помощи ацетонитрила переносилось 0,025 г.

2-гидроксинафталина. Концентрация 2-гидроксинафталина составляла 250 мг/дм3.

Объем доводился до метки ацетонитрилом. Далее в сухую мерную колбу на 100 см3 вносилось 2 см3 исходного ацетонитрильного раствора 2-гидроксинафталина. В тот же сосуд при помощи фосфатного буферного раствора переносилось 0,100 г. 2аминоэтансульфоновой кислоты и 8 мкл СХМ, объем доводился до метки фосфатным буферным раствором. Для обеспечения протекания исключительно неферментативных процессов модельная среда готовилась аналогичным образом, но с добавлением 0,050 г. азида натрия.

2.2.1.5. Приготовление модельных сред для изучения трансформации фенилбензола

–  –  –

2.2.2. Методики количественного определения ФКАС в модельных средах методом ВЭЖХ-УФ 2.2.2.1. Получение электронных спектров ФКАС Диапазон сканирования – 190-380 нм, шаг сканирования – 1 нм, длина оптического пути – 10 мм. Перед получением УФ-спектров ФКАС растворялись в соответствующем растворителе. Концентрация ФКАС подбиралась исходя из анализа получаемых спектрограмм. Концентрация рабочего раствора для УФспектроскопии в дальнейшем снижалась при условии превышения одним из максимумов величины 1200 mAU или при диспропорционировании величины абсорбции для максимумов по отношению к предыдущему разведению.

2.2.2.2. Подготовка модельных сред перед ВЭЖХ анализом

Модельные среды, содержащие бензойную, 4-гидроксибензойную, 2гидроксибензойную, ацетилсалициловую, 2-хлорбензойную, протокатеховую, галловую кислоты, метиловый, этиловый, пропиловый эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, фенол, пирокатехин, или амид 2-гидроксибензойной кислоты), разводились в мерных колбах на 10 см3. Величина разведения подбиралась исходя из величины калибровочного диапазона и концентрации ФКАС (обычно проводилось десятикратное разведение). В случае модельных сред, включающих левомицетин, левомицетина сукцинат натрия, фениловый эфир 2гидроксибензойной кислоты, или фенилбензол 2-гидроксинафталин предварительного разведения не проводилось. Далее модельные растворы подвергались мембранному фильтрованию через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Фильтрат помещался во флаконы объемом 1,8 см3 для дальнейшего анализа методом ВЭЖХ-УФ.

2.2.2.3. Условия хроматографического разделения

В ходе подбора условий и оптимизации хроматографических разделений ФКАС в модельных средах методом ВЭЖХ-УФ использовались следующие общие условия анализа: предколонка (10x2,1 мм) Acclaim 120 (C18-фаза, 5 мкм, 120 );

колонка (150x2,1 мм) Acclaim 120 (C18-фаза, 3 мкм, 120 ); расход подвижной фазы

– 0,2 см3/мин; температура термостата колонок – 30,0 oC. Специфические условия хроматографического разделения приведены в таблице 2.3.

–  –  –

В качестве рабочих длин волн были выбраны каналы 210, 230, 254 и 278 нм (табл. 3.3-3.4).

2.2.2.4. Определение величин отношений сигналов абсорбции Сигнальные соотношения абсорбции – отношение величины аналитического сигнала, измеренного при одной длине волны к величине аналитического сигнала, полученного при другой [173]. Для расчета сигнальных отношений готовилось три стандартных раствора аналита, концентрации которого были:

1) на 50 % выше нижнего калибровочного уровня;

2) на 20-25 % ниже верхнего калибровочного уровня;

3) приблизительно в середине калибровочного диапазона.

Каждый раствор подвергался трехкратному хроматографическому анализу.

Условия хроматографирования соответствовали используемой методике.

Вычисление сигнальных отношений (R) проводилось согласно формуле 2.1:

(2.1) A1 – величина площади аналитического сигнала, измеренная при 1, mAU*min;

A2 – величина площади аналитического сигнала, измеренная при 2, mAU*min.

2.2.2.5. Калибровка методик идентификации и количественного анализа ФКАС в модельных средах Калибровка для количественных измерений проводилась в соответствии с методом внешнего стандарта на шести калибровочных уровнях. Для методик анализа бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой, 2-хлорбензойной, протокатеховой, галловой кислот, эфиров 4гидроксибензойной кислоты (МП, ЭП, ПП), фенола, пирокатехина и амида 2гидроксибензойной кислоты калибровочный диапазон составлял от 1,0 до 20,0 мг/дм3, для левомицетина, левомицетина сукцината натрия и 2-гидроксинафталина от 0,5 до 10,0 мг/дм3, для фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты и фенилбензола от 0,2 до 4,0 мг/дм3 (табл. 2.4).

Изначально готовился калибровочный раствор, концентрация которого соответствовала верхнему калибровочному уровню (опорный стандартный раствор).

Далее из опорного стандартного раствора с помощью разведения в мерных колбах получали калибровочные растворы соответствующих концентраций. Растворителем выступала смесь по составу соответствующая элюенту (табл. 2.3). Готовилось две серии растворов. Каждый раствор из серии хроматографировали дважды, находя среднее значение площади пика. Всего в построении калибровочных кривых для каждого соединения было использовано 12 точек.

–  –  –

Формула (2.2) для расчета концентрации ФКАС в модельной водноорганической системе (C, мг/дм3) имела следующий вид:

(2.2) A – площадь пика, mAU*min;

Kкал. – калибровочный коэффициент, мг/mAU*min*дм3.

D – фактор разведения, вычисляемый по следующей формуле 2.3:

(2.3) V1 – объем мерной колбы, взятой для разведения, см3;

V2 – объем исходного раствора, взятого для разведения, см3.

2.2.3. Методики идентификации продуктов трансформации ФКАС 2.2.3.1. Анализ методом ВЭЖХ-УФ Подготовка образцов модельных водно-органических сред при анализе продуктов трансформации включала мембранное фильтрование через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. В случае необходимости (ухудшение эффективности и (или) селективности системы) проводилось разведение исследуемых растворов рабочей подвижной фазой.

Объемная доля ацетонитрила в элюенте варьировалась от 20 до 0 об.%, величина pH водного компонента подвижной фазы изменялась в интервале от нейтрального (6,9) до кислого (3,1). Вводимый объем образца увеличивали двукратно относительно значений, указанных в таблице 2.3.

Идентификация продуктов трансформации проводилась по временам удерживания при сравнении со временем удерживания стандартного раствора предполагаемого соединения, а также по величинам сигнальных отношений.

2.2.3.2. Анализ методом ГХ-МС 2.2.3.2.1. Подготовка образцов

Продукты трансформации из модельной реакционной среды трижды см3 экстрагировались 20 смеси этилацетат-диэтиловый эфир в объемном соотношении 80:20. Полученный объединенный экстракт обезвоживался пропусканием через колонку с безводным сульфатом натрия. Обезвоженный экстракт упаривался в роторном испарителе досуха.

Сухой остаток растворялся в 1 см3 пиридина. Далее к полученному раствору добавлялось 2 см3 ТМСИМ. Данная смесь количественно переносилась в полипропиленовые пробирки на 10 см3 при помощи 1 см3 пиридина. Пробирки выдерживались в сушильном шкафу в течение 30 минут при температуре (60±2) oC.

После охлаждения смесь использовалась для анализа методом ГХ-МС.

2.2.3.2.2. Условия ГХ-МС анализа

Подвижная фаза: гелий ос.ч;

Скорость подачи газа-носителя: 2 см3/мин Колонка: HP-5MS (5%-фенил-95%-метилполисилоксан), внутренний диаметр 0,25 мм, длина 30 м, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм;

Объем ввода образца: 1 мкл, деление потока 1:100;

Температурный режим: испаритель – 250 oC; термостат – 100 oC (3 мин.), 100С, 10 °С/мин; 150 °С (2 мин.); 150-280 °С 10 °С/мин; 280 °С (14 мин.);

температура ионного источника – 200 oC;

Детектирование: масс-селективное, ионизация – электронный удар, энергия ионизации 70 эВ, задержка ионизации – 3 минуты.

2.3. Проведение квантово-химических расчетов

Компьютерный дизайн исследуемых структур проводился в программах ChemBioDraw, ChemBio3D и GaussView; визуализация полученных результатов расчета осуществлялась с помощью программы GaussView.

Для квантово-химических расчетов использовали программу Gaussian 09W.

Расчеты проводили с использованием теории функционала плотности (DFT) методом гибридных функционалов B3LYP с использованием следующих базисных наборов: STO-3G (d); 3-21G (d,p); LANL2DZ.

2.3.1. Поиск оптимальной геометрической конфигурации, расчет полнойэнергии соединения

Поиск равновесных геометрических конфигураций моделируемых структур выполнялся с использованием неограниченного приближения Хартри-Фока (UHF).

После формирования исходной исследуемой структуры проводили предварительную оптимизацию геометрии системы. При поиске равновесных геометрических конфигураций был использован метод последовательного приближения, позволяющий сократить время расчета. Суть указанного метода заключается в последовательной оптимизации пробного строения с постепенным усложнением метода расчета вплоть до достижения требуемого приближения.

Предварительная оптимизация проводилась с применением базисных наборов Поупла STO-3G (d) и 3-21G (d,p) с использованием d-диффузионных и рполяризационных функций для всех атомов.

Командная секция входного файла «X.gjf» для проведения начального поиска рабочей конфигурации системы имела следующий вид:

%nproc=3 # UB3LYP/STO-3G(d) Opt=EF SCF(XQC, Tight, MaxCycle=100) %nproc – определял количество используемых для вычисления ядер процессора. Данный параметр обеспечивал более эффективное использование вычислительной мощности процессора, проводя вычисления на нескольких ядрах.

По умолчанию программа работала, используя лишь одно ядро процессора;

UB3LYP – указывает на использование неограниченного приближения Хартри-Фока для метода B3LYP;

Opt – ключевое слово для запуска процедуры оптимизации:

Параметр EF декларировал использование при оптимизации алгоритма следования собственному вектору вместо алгоритма Berny, используемого по умолчанию. Введение в командную секцию ключевого слова «EF» позволяло использовать при оптимизации геометрической конфигурации моделей алгоритм следования собственному вектору. Данный алгоритм хотя и требовал более высоких вычислительных мощностей, но позволял чаще достигать сходимости, чем алгоритм Berny.

SCF – процедура процесса самосогласования поля:

XQC включал метод квадратичной сходимости вместо стандартного DIIS.

Метод QC более надежен, но несколько медленнее стандартного;

Tight – означал, что в процедуре самосогласования будут использованы улучшенные критерии сходимости. Введение параметра «Tight» предъявляло более высокие критерии самосогласования, что повышало точность конечных расчетов, но при этом также требовались большие вычислительные мощности;

MaxCycle – устанавливал максимальное количество шагов оптимизации.

Параметр ограничивал максимальное число вычислительных циклов оптимизации.

Выставление малого значения данного параметра при запуске предварительной оптимизации позволяло быстрее проводить селекцию рабочих моделей.

Командная секция входного файла «X.gjf» для проведения второго предварительного поиска рабочей конфигурации системы имела следующий вид.

%nproc=3 # UB3LYP/3-21G (d,p) Opt=EF SCF(XQC, Tight, MaxCycle=200) Конечные геометрические параметры системы вычисляли методом DFT B3LYP/LANL2DZ.

%nproc=3 # UB3LYP/LANL2DZ Opt=EF SCF(XQC, Tight, MaxCycle=500) 2.3.2. Верификация оптимизированных геометрических конфигураций моделей Контроль достижения стационарной точки осуществлялся в ходе проведения вычислений на наличие мнимых частот в колебательном спектре системы. Для этого проводили вычисления для моделей с уже оптимизированной геометрической конфигурацией. Командная секция входного файла «X.gjf» для расчета мнимых частот в колебательном спектре имела следующий вид:

–  –  –

SP – ключевое слово, запускающее расчет энергии в конкретной точке без оптимизации геометрической конфигурации молекулы;

Freq – ключевое слово, запускающее расчет частот нормальных колебаний и термодинамических свойств модели.

Также полученные пространственные характеристики моделей (длины связей, валентные углы) сравнивали с литературными данными рентгеноструктурного (X-ray) анализа.

2.3.3. Изучение процесса сближения субстратов с каталитическим центром до стадии отрыва воды и тирозинового фрагмента (Тир2) и оптимизация геометрической конфигурации модели субстрат-каталитический центр после отделения тирозинового фрагмента и воды от каталитического центра С целью нахождения зависимости полной энергии системы от длины связи 4(1)-OH-Fe(III) (4-OH-Fe(III) для протокатеховой кислоты и 4-OH-Fe(III) для пирокатехина) в редакторе совмещались предварительно оптимизированные структуры субстратов и каталитического центра ИДДГ. Пространственные характеристики моделей вводились в рабочий файл в виде внутренних координат (zматрицы). Значение длины связи 4-OH-Fe(III) устанавливали равной 3,0. Далее проводили оптимизацию геометрии моделей (по п. 2.4.1) при этом блокировали расчет длины связи 4(1)-OH-Fe(III) (1-OH-Fe(III)).

Исследовались следующие модели взаимодействия субстрата и каталитического центра ИДДГ:

1) Комплексы протокатеховой кислоты и пирокатехина с каталитическим центром без депротонирования гидроксильных групп субстратов;

2) Комплексы протокатеховой кислоты и пирокатехина с каталитическим центром после депротонирования гидроксильных групп субстратов и миграции протонов на тирозиновый фрагмент и гидроксильную группу каталитического центра;

Варьируя длину связи 4(1)-OH-Fe(III) моделей субстрат-каталитический центр в интервале от 1,4 до 4,0 с максимальным шагом 0,1 (вблизи минимума 0,01 ) вычисляли полную энергию для фиксированной конфигурации ядер. После получения данных проводилась полная оптимизация геометрии моделей субстраткаталитический центр, в которых тирозиновый фрагмент и вода были отдалены от атома Fe(III) на расстояние 4,5.

Определение потенциальных реакционных центров 2.3.4.

микроцистинов Расчеты производились методом РМ6 [179] в программном комплексе МОРАС 2009. Оценка параметров строения проводилась как для изолированной молекулы, так для континуальной модели растворителя (вода), которая учитывает сольватационные эффекты водного окружения при реоптимизации геометрических параметров и электронной структуры частицы, а также организацию сольватационного окружения (AMSOL 6.6 полуэмпирический метод SM 5.42).

2.4. Расчет показателей валидации хроматографических методик

Для вычисления предела обнаружения метода, а также величин относительного стандартного отклонения для времени удерживания и площади пика производилось последовательное введение в хроматографическую систему раствора аналита, концентрацией находящейся на уровне в два раза превышающем нижний предел калибровочного диапазона. Всего производилось 20 последовательных измерений.

Значения предела обнаружения метода (ПОМ, мг/дм3) вычислялось по формуле 2.4:

(2.4)

– величина стандартного отклонения концентрации аналита, мг/дм ;

t – значение t-критерия Стьюдента, соответствующее доверительному интервалу 0,99.

Значения предела количественного определения (ПКО, мг/дм3) вычислялось по формуле 2.5:

…………..…………………….(2.5)

– величина стандартного отклонения концентрации аналита, мг/дм ;

Значения, % относительного стандартного отклонения для времен удерживания и площадей пиков (, %) находились согласно следующему уравнению (2.6):

–  –  –

– абсолютная величина стандартного отклонения времени удерживания и площади сигнала исследуемого раствора;

__ X – среднее значение измеряемой величины.

Данные о пределе повторяемости (r, %) рассчитывались следующим образом (2.7):

–  –  –

f – коэффициент критического диапазона, равный 1,96 при n = 2;

– средняя величина стандартного отклонения концентрации аналита в испытуемых растворах;

__ X – среднее значение измеряемой величины.

–  –  –

В данной работе исследовались закономерности трансформации ряда функционализованных карбоароматических соединений, представленных следующими структурами: ароматические карбоновые кислоты, фенолы и полифенолы, сложные эфиры, амиды и нитро- производные аренов, а также полиядерные карбоароматические системы (таблица 3.1). Следует отметить, что многие соединения могут относиться сразу к нескольким структурным классам.

–  –  –

* – указаны возможные вариации радикалов (R) Химическое поведение подобных соединений в лабораторных условиях в присутствии ограниченного количества реагентов достаточно хорошо изучено. Но при попадании функционализованных карбоароматических продуктов в сложные среды (природные системы, пищевые продукты, косметические изделия, фармацевтические препараты, смеси и др.), содержащие огромное количество реагентов, в том числе и сложные полифункциональные молекулы, их превращения, а также динамика трансформации становятся малопредсказуемыми и, следовательно, нуждаются в изучении. В связи с этим в данной работе рассматриваются функционализованные карбоароматические соединения, их поведение в модельных водно-органических и сложных полиреагентных средах.

–  –  –

Была осуществлена оптимизация условий синтеза протокатеховой кислоты по критерию выхода целевого продукта в реакции щелочного плавления 4-гидроксиметоксибензальдегида (ванилина) (схема 3.1):

–  –  –

Основным фактором, способствующим уменьшению выхода, является распад протокатеховой кислоты, который наблюдался уже при температуре ее плавления (199-200 oC). Другой побочный продукт синтеза – ванилиновая кислота (схема 3.2, рис. 3.1), выход которой значительно возрастет даже при небольшом понижении (более 5 oC) рабочей температуры реакции окисления ванилина из-за снижения интенсивности процесса деметилирования метокси-группы в положении 3.

Схема 3.2

Поэтому параметрами оптимизации явились температура и время проведения процесса.

Данные, полученные в ходе подбора условий, приведены в таблице 3.2. Из них следует, что значение температуры необходимо поддерживать на уровне 245 oC при продолжительности процесса 6,5 мин. ВЭЖХ-анализ показал практически полное отсутствие примеси ванилиновой кислоты (рис. 3.2) после применения оптимизированных условий синтеза.

Оценку выхода целевого соединения проводили после перекристаллизации и очистки протокатеховой кислоты на колонке с силикагелем. Контроль чистоты проводился методом ВЭЖХ-УФ (рис. 3.1, 3.2), структура подтверждена ИКспектроскопией (рис. 3.3).

Рис. 3.1. Хроматограмма смеси 1 – протокатеховой и 2 – ванилиновой кислоты, полученная при проведении неоптимизированной методики синтеза

–  –  –

3.3. Отработка методов идентификации и количественной оценки ФКАС и продуктов их трансформации 3.3.1. Оптимизация методик количественного определения ФКАС в модельных средах методом ВЭЖХ-УФ Выбор методики анализа ФКАС определялся возможностью получения данных о динамике изменения концентрации исследуемых соединений при их трансформации в модельных водно-органических средах.

Выбор рабочего метода базировался на преимуществах ВЭЖХ-УФ:

относительно быстрая подготовка образцов, заключающаяся в разбавлении и мембранной фильтрации модельного раствора, достаточный уровень чувствительности, гибкие инструменты управления селективностью разделения, возможность применять несколько критериев идентификации: времена удерживания, сигнальные отношения.

Непосредственная разработка методик требовала предварительного изучения физико-химических свойств ФКАС, таких как растворимость, сорбируемость на неполярных сорбентах, pKa, электронные спектры, что достигалось анализом литературных данных и проведением экспериментов.

3.3.1.1. Характеристики электронных спектров

Проведение процедур идентификации и количественного определения ФКАС базируется на оценке характера аналитических сигналов. В свою очередь характер аналитических сигналов непосредственно определяется структурными особенностями соединений. В связи с этим было необходимо получить характеристики электронной спектроскопии исследуемых ФКАС. Также применение при хроматографическом разделении спектрофотометрического детектирования требовало подбора рабочих и контрольных длин волн, что позволяло бы добиваться необходимых параметров чувствительности и селективности. Результаты исследования электронных спектров приведены в таблице 3.3.

Их анализ показал наличие двух основных типов переходов электронов:

*, n*. Максимумам поглощения ФКАС в электронных спектрах отвечают электронные переходы с ВЗМО на НВМО это * переходы, для них преимущественно наблюдается три полосы поглощения: две высокой интенсивности и одна «длинноволновая» средней интенсивности. Первые две находятся в интервале 190-216 нм, в то время как третья расположена в диапазоне 230-290 нм. Наиболее четко третья полоса поглощения представлена для следующих функционализованных аренов: бензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, 2-гидроксибензойной кислоты, фенола, пирокатехина, протокатеховой кислоты, левомицетина, левомицетина сукцината натрия, галловой кислоты, амида 2-гидроксибензойной кислоты, фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты и фенилбензола.

–  –  –

(9,48*103), 4-ГБК (2,12*104) (3,20*104), МП (1,89*104)

–  –  –

(3,06*104), ЭП (1,35*104) (2,85*104), ПП (8,93*103) (1,53*104), 2-ГБК (8,07*103), (7,39*103)

–  –  –

(1,09*104), ПКХ (2,53*102) (1,03*103), (8,94*102), ПКК (3,21*102), (1,07*102) (7,31*103), ГК (5,53*102)

–  –  –

2-ГН (4,67*105) (5,18*104), ФБ (1,95*104) Сравнительно высокий показатель величины светопоглощения для 2гидроксинафталина (lg = 5) объясняется влиянием полиядерной ароматической структуры, требующей большей энергии электронного * перехода.

Также было выявлено, что в гомологическом ряду эфиров 4гидроксибензойной кислоты для максимумов поглощения 195 и 254 нм наблюдается гипохромный сдвиг с увеличением алкильного хвоста, при этом величина гипохромного сдвига для обоих максимумов была одинаковой, что также подтверждается сходными величинами сигнальных отношений (табл. 3.4).

Образование сложного эфира между спиртовой группой левомицетина и карбоксильной группой янтарной кислоты приводило к снижению светопоглощения при длине волны 278 нм, при этом заметного гипохромного сдвига у второго максимума (max=211 нм) не наблюдалось.

Возбуждения n* характеризуются значительно меньшей энергией перехода электрона, и поэтому вносят незначительный вклад в светопоглощающие свойства ФКАС. Данный тип переходов наблюдается для ФКАС, содержащих карбоксильные группы (201-206 нм), и их модификации: карбоксамидные (205-210 нм), сложноэфирные (209-213 нм) группировки.

3.3.1.2. Определение состава модельных водно-органических сред и процедуры их пробоподготовки для ВЭЖХ Состав модельных водно-органических сред определялся с учетом обеспечения возможности протекания, как абиотических процессов, так и преобразований в присутствии ферментов (таблица 2.1). Следует отметить, что в реальных природных средах последние определяются наличием микроорганизмов в реакционной среде. Поэтому готовились два варианта модельных раствора для каждого из исследуемых ФКАС: с ингибированием и без ингибирования микробного роста. В качестве бактерицидного агента выступал азид натрия. В модельных средах, содержащих ингибитор предполагалось протекание исключительно неферментативных процессов, в то время как в модельных средах без ингибитора ожидалось протекание как неферментативных, так и ферментативных процессов преобразования исходных структур.

Согласно литературным данным [46-49], наиболее вероятным процессом трансформации выступали реакции замещения, идущие по карбоксильной группе.

Для обеспечения возможности протекания данных процессов в модельную среду вносилась 2-аминоэтансульфоновая кислота. В качестве субстрата для протекания реакций в среду вносились исследуемые ФКАС, концентрация которых подбиралась для каждого индивидуально (от 1,6 до 100 мг/дм3). В ряде случаев для улучшения растворимости ФКАС в модельную среду добавлялось от 0,5 до 2,5 % этилового спирта или ацетонитрила. Для поддержания стабильного pH модельной среды все компоненты растворялись в фосфатном буферном растворе (pH ~ 6,86).

Критичными параметрами пробоподготовки для методик идентификации и количественного определения ФКАС в модельных водно-органических средах выступали трудоемкость и длительность анализа. Метод ВЭЖХ-УФ позволял применять быстрые приемы подготовки модельных образцов, включающие разведение для попадания в калибровочный диапазон и мембранное фильтрование, необходимое для удаления взвешенных частиц.

3.3.1.3. Подбор условий ВЭЖХ-разделения

Управление селективностью разделения компонентов реакционных смесей производилось путем изменения концентрации ацетонитрила, состава и pH элюента, а также выбором измерительной и контрольной длин волн спектрофотометрического детектора в соответствии с полученными данными электронной спектроскопии. Так увеличение объемной доли ацетонитрила в элюенте снижало селективность и коэффициент емкости при ВЭЖХ-анализе. В качестве водного компонента подвижной фазы применялись HPLC-grade вода, ацетатный буферный раствор, растворы ортофосфорной кислоты с различными величинами pH.

Использование воды как компонента элюента было оправдано при анализе неионогенных соединений и веществ, диссоциирующих в щелочной среде, для которых не было необходимости в контроле pH: фенилового эфира 2гидроксибензоной кислоты, фенилбензола, левомицетина, эфиров 4гидроксибензойной кислоты, фенола, амида 2-гидроксибензойной кислоты, пирокатехина. Поддержание pH подвижной фазы было необходимо для соединений, диссоциирующих в нейтральной среде, что провоцировало появление парных сигналов ФКАС на хроматограммах: депротонированной и протонированной формы (рис. 3.4).

–  –  –

Ацетатный буферный раствор применялся для анализа бензойной, 2гидроксибензойной и ацетилсалициловой кислот, но в дальнейшем выяснилось, что использование данного буфера негативно сказывалось на чувствительности и точности из-за заметного увеличения шума в диапазоне длин волн от 190 до 254 нм, но при этом данные методики все же отвечали критериям чувствительности и селективности. В отличие от ацетатного буфера растворы ортофосфорной кислоты обладали несомненными преимуществами: УФ-прозрачность, устойчивость к воздействию микроорганизмов, способность сохранять pH в течение длительных промежутков времени (более месяца, рис.3.5), следовательно, они были использованы в последующем при анализе ионогенных соединений, способных к диссоциации в нейтральных и слабокислых растворах: 4-гидроксибензойной кислоты, левомицетина сукцината натрия, 2-хлорбензойной кислоты, галловой кислоты, 2-гидроксинафталина, протокатеховой кислоты. Применение растворов ортофосфорной кислоты вместо фосфатного буфера объяснялось отсутствием в составе неорганических солей, способных выкристаллизовываться на тыльной стороне сальников поршней насоса.

Рис 3.5. График изменения pH водных компонентов подвижной фазы: 1 – раствор ортофосфорной кислоты (pHнач ~ 3,1), 2 – ацетатный буферный раствор (pHнач ~ 4,1) Выбор рабочих длин волн (табл. 3.4) базировался исходя из данных электронной спектроскопии и величин шумов на хроматограммах. Было подобрано четыре рабочих длины волны: 210, 230, 254 и 278 нм. Использование одновременно двух длин волн при анализе ФКАС позволяло вычислить сигнальные отношения аналитов, которые наряду со временами удерживания использовались в качестве критерия идентификации ФКАС и продуктов их трансформации (табл. 3.4).

–  –  –

Конечные условия хроматографического разделения ФКАС при анализе модельных водно-органических сред указаны в таблице 2.3. Времена удерживания для исследуемых ФКАС приведены в таблице 3.5. Типичные хроматограммы ФКАС, содержащихся в модельных средах, изображены в приложении 3.

–  –  –

3.3.2. Выбор условий идентификации продуктов трансформации ФКАС Для идентификации продуктов трансформации ФКАС требовалось модифицировать ВЭЖХ-методики анализа ФКАС в модельных водно-органических средах. Условия хроматографического анализа модельных сред на присутствие продуктов трансформации ФКАС подбирались исходя из необходимости повышения селективности разделения сигналов, увеличения коэффициента емкости слабосорбируемых соединений и чувствительности. В подавляющем большинстве случаев было достаточно снизить концентрацию ацетонитрила в подвижной фазе, т.к. большинство образующихся продуктов обладало меньшим сорбционным сродством к обращенно-фазовому сорбенту из-за преобладания реакций гидроксилирования и разрыва ароматического цикла, что заметно снижало сорбцию на неполярных носителях. В случае анализа эфиров 4-гидроксибензойной кислоты (МП, ЭП, ПП), фенилового эфира кислоты, 2-гидроксибензойной 2гидроксинафталина, фенилбензола, левомицетина и левомицетина сукцината натрия использовался градиентный режим элюирования, т.к. продукты трансформации обладали заметно меньшей величиной сорбции, чем исходные соединения. Для увеличения чувствительности увеличивался объем ввода образцов в хроматографическую систему.

Идентификация продуктов трансформации ФКАС методом ГХ-МС представлялась возможной только при условии получения летучих производных (дериватизации), т.к. многие продукты трансформации ФКАС обладали низкой летучестью или разлагались при воздействии высоких температур. Для дериватизации использовалась реакция силилирования с N-(триметилсилил) имидазолом (ТМСИА) (схема 3.3).

Схема 3.3

Данное соединение активно реагировало с карбоксильными и гидроксильными группами, что обеспечивало снижение температур кипения продуктов трансформации ФКАС, позволяя проводить идентификацию методом ГХ-МС. Согласно литературным данным силилирование с помощью ТМСИА в большинстве случаев не требует катализатора и проходит при нагревании [170]. Для подбора оптимальных условий реакции проводили силилирование гидроксильной и карбоксильной групп эталонных соединений – фенола и бензойной кислоты при различных температурах. Эффективная дериватизация (выход 98-100 %) o наблюдалась уже при достижении температуры 50 C (рис. 3.6), однако, в дальнейшем рабочая температура силилирования была установлена на 60 oC. Как показано на графике (рис. 3.6), силилирование карбоксильной группы проходило несколько медленнее, чем гидроксильной.

Для описания данных эффективности силилирования использовалась полиномиальная функция 3-й степени, при применении которой значение коэффициента аппроксимации было наивысшим (R2 = 0,9945 – для гидроксильной группы фенола и R2 = 0,9990 – для карбоксильной группы бензойной кислоты).

Рис. 3.6. Эффективность реакции силилирования: 1 – по гидроксильной группе фенола, 2 – по карбоксильной группе бензойной кислоты

3.4. Направления процессов трансформации ФКАС в модельных системах Было установлено, что в качестве основных процессов трансформации рассмотренных ФКАС наблюдались: гидролиз сложноэфирного фрагмента, протекающий как по неферментативному пути, так и в ходе ферментативного катализа, окислительный разрыв ароматического кольца, протекающий за счет взаимодействия субстрата с молекулярным кислородом в присутствии интрадиольных диоксигеназ (прирокатехин-1,2-диоксигеназы и протокатехат-3,4диоксигеназы), а также окисление протекающее по радикально-цепному механизму, которое было характерно для полифенолов.

В ходе ВЭЖХ-анализа исследованных реакционных систем, содержащих ацетилсалициловую кислоту был обнаружен был обнаружен сигнал 2гидроксибензойной кислоты, при этом концентрации ацетилсалициловой кислоты в обоих вариантах модельных водно-органических сред оставались сопоставимыми в течение всего периода измерений (рис. 3.15). На этом основании логично было предположить, что распад ацетилсалициловой кислоты происходил только за счет неферментативного гидролиза сложноэфирной связи до 2-гидроксибензойной и уксусной кислот. В среде с pH, близкой к нейтральному ацетилсалициловая кислота вследствие низкой pKa (~ 3,7) существует в виде ацетилсалицилат-аниона, который в ходе внутримолекулярной перестройки без участия молекул воды может медленно преобразовываться в комплекс 2 (схема 3.4) [124], этот факт предопределяет неферментативный характер расщепления сложноэфирного фрагмента, инициируя гидролитическое расщепление при попадании данного соединения в водноорганическую реакционную среду.

Схема 3.4

Согласно полученным данным (рис. 3.8, рис. 3.13, табл. 3.6-3.7) гидролиз сложноэфирной связи метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты до 4-гидроксибензойной кислоты и соответствующего спирта проходил исключительно ферментативным путем (схема 3.5; рис. 3.13), что, вероятно, было обусловлено стабильностью эфиров 4-гидроксибензойной кислоты в нейтральной среде. Факт гидролиза подтверждался идентификацией 4-гидроксибензойной кислоты в модельных средах без ингибитора ферментативной активности (табл. 3.6рис. 3.8).

Локализация гидроксильной группы в пара-положении относительно сложноэфирного фрагмента затрудняла перенос протона на карбонильный атом углерода сложноэфирного фрагмента, что в свою очередь мешало образованию тетраэдрического интермедиата, выступающего ключевой стадией протекания неферментативного гидролиза. Роль каталитического центра эстеразного фермента в таком случае заключалась в увеличении электрофильности субстрата, что облегчало нуклеофильную атаку со стороны гидроксильной группы молекулы воды, тем самым реализуя гидролитическое расщепление сложноэфирного фрагмента (схема 3.5).

Схема 3.5

Также было показано, что гидролиз сложноэфирного фрагмента фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты протекал как неферментативным, так и каталитическим ферментативным путями (схема 3.6; рис. 3.17). Гидролитический характер преобразования подтверждался наличием фенола и 2-гидроксибенйзойной кислоты в перечне обнаруженных продуктов трансформации (табл. 3.6-3.7, рис. 3.9).

На смешанный характер гидролитического расщепления указывало ускоренное снижение концентрации фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты в модельной среде без ингибитора ферментативной активности относительно среды с ингибитором (рис. 3.17). Расположение гидроксильной в орто-положении относительно сложноэфирной связи облегчало переход протона на карбонильный атом углерода сложноэфирного фрагмента, что детерминировало возможность протекания неферментативного гидролиза. Соответственно, в случае неферментативного гидролиза протонирование связи шло за счет C=O внутримолекулярной миграции иона водорода с в случае OH-группы, ферментативного гидролиза – за счет тирозиновых фрагментов каталитического центра (схема 3.6).

–  –  –

Также следует отметить, что никаких конкурирующих с гидролизом сложноэфирных связей процессов выявлено не было.

В дальнейшем (в том числе после гидролиза) распад большинства ФКАС проходил по пути окислительного разрыва ароматического кольца.

Ключевым продуктом трансформации при анализе модельных растворов бензойной, ацетилсалициловой кислот, фенола и 2-гидроксибензойной, 2гидроксинафталина, не содержащих ингибитора ферментативной активности, выступал пирокатехин. Сигнал данного продукта был обнаружен как на ВЭЖХхроматограммах, так и в ходе анализа методом ГХ-МС (табл. 3.6). Также в модельных средах без ингибитора, содержащих 4-гидроксибензойную кислоту, метиловый и этиловый эфиры 4-гидроксибензойной кислоты основным продуктом трансформации выступала протокатеховая кислота (табл. 3.7). В модельных средах без ингибирования ферментативных процессов, содержащих пирокатехин или 2гидроксибензойную кислоту, была также обнаружена муконовая кислота (табл. 3.6что подтверждалось идентификацией сигнала ее силильного производного бис(триметилсилила) 2,4-гександиендиовой кислоты по полученным масс-спектрам.

Обнаружение следовых количеств муконовой кислоты свидетельствовало о приоритете интрадиольного характера окислительного разрыва ароматического кольца (схема 3.7), что было также справедливо в отношении вышеуказанных соединений. Отсутствие сигналов муконовой кислоты на ГХ- и ВЭЖХхроматограммах при анализе модельных образцов, содержащих бензойную, 4гидроксибензойную, ацетилсалициловую, галловую кислоты, метиловый и этиловый эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, фенол, 2-гидроксинафталин, фениловый эфир 2-гидроксибензойной кислоты, по-видимому, вызвано следовым ее содержанием ниже предела чувствительности. Отсутствие в перечне продуктов трансформации гидроксилированных соединений сложных эфиров (ацетилсалициловой кислоты, левомицетин сукцината натрия, фенилового эфира 2гидроксибензойной кислоты, эфиров 4-гидроксибензойной кислоты) указывало на возможность протекания окислительной дециклизации только после гидролиза сложноэфирных связей.

Следовательно, основываясь на результатах идентифицированных продуктах трансформации ФКАС можно судить о том, что в случаях с модельными растворами содержащими бензойную, 4-гидроксибензойную, 2-гидроксибензойную, ацетилсалициловую, протокатеховую кислоты, а также метиловый и этиловый эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, фенол, 2-гидроксинафталин и пирокатехин, ключевую роль в преобразовании ФКАС играл процесс окислительной интрадиольной дециклизации ароматического кольца (схема 3.7), протекающий только после гидролиза сложноэфирных связей (при наличии таковых в молекуле).

Согласно данным динамики изменения концентрации (рис. 3.13-3.14) процесс интрадиольного разрыва ароматического цикла носил исключительно ферментативный характер.

Схема 3.7

Обнаружение следовых количеств 2,5-дигидроксибензойной (гентизиновой;

табл. 3.6-3.7) кислоты при анализе трансформации 2-гидроксибензойной и ацетилсалициловой кислот можно объяснить параллельным протеканием реакций, идущих по пути гентизиновой кислоты (схема 3.8), наряду с интрадиольной дециклизацией ароматической системы.

Схема 3.8 В случае модельных сред, содержащих галловую, протокатеховую кислоты и пирокатехин наиболее вероятным путем протекания неферментативной трансформации выступало радикально-цепное окисление, что было детерминировано способностью гидроксильных групп полифенолов акцептировать электроны образующихся свободных радикалов (схема 3.

9). Данное предположение было подтверждено данными ВЭЖХ-анализа (рис. 3.11), в ходе которого удалось обнаружить незначительное содержание ( 2 мг/дм3) 1,2-бензохинона. Учитывая радикально-цепной механизм реакций подобного рода, ниже приведен один из возможных способов формирования 1,2-бензохинона.

Схема 3.9

Обнаружение следовых количеств левомицетина в модельном растворе, содержащем левомицетина сукцинат натрия можно объяснить несовершенством синтеза и очистки субстанции левомицетина сукцината натрия производителем. Так анализ модельной среды, содержащей левомицетина сукцинат натрия, не показал явной тенденции к снижению концентрации данного соединения (рис. 3.19), на основании чего можно говорить о его стабильности в представленных модельных водно-органических системах.

Ниже приведены данные о продуктах трансформации ФКАС, обнаруженных при исследовании модельных растворов методами ВЭЖХ-УФ и ГХ-МС (рис. 3.7табл. 3.6-3.8).

Рис. 3.7. ВЭЖХ-хроматограмма продуктов трансформации бензойной кислоты: пирокатехин (tr = 8,61)

–  –  –

Рис. 3.10. ВЭЖХ-хроматограмма продуктов трансформации фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты: фенол (tr = 7,65), 2-гидроксибензойная кислота (tr = 9,46) Рис. 3.11. ВЭЖХ-хроматограмма продуктов трансформации 2гидроксинафталин: пирокатехин (tr = 19,83), 2-гидроксибензойная кислота (tr = 22,93)

Рис. 3.12. ВЭЖХ-хроматограмма продуктов трансформации пирокатехина:

пирокатехин (tr = 5,96), 1,2-бензохинон (tr = 7,64) Рис. 3.13. ВЭЖХ-хроматограмма продуктов гидролиза ацетилсалициловой кислоты. Изображены пики 2-гидроксибензойной (tr = 3,69) и ацетилсалициловой кислот (tr = 4,52) Важная информация о строении и свойствах продуктов трансформации ФКАС была получена из данных хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Был проведен анализ полученных масс-спектров продуктов трансформации исследуемых ФКАС, также было сопоставлено их поведение при электронном ударе (п. 3.5).

Результаты представлены в таблице 3.7.

–  –  –

16,4); 45 (29,3); 209 (4,9) (replib) Benzoic acid, 2-[(trimethylsilyl)oxy]-, trimethylsilyl ester 225 (39,0); 298 (22,0);

(8-ТМСП)* 315 (22,0); 75 (19,0); 224

–  –  –

3.5. Поведение силильных производных продуктов трансформации ФКАС при электронном ударе Данные поведения продуктов трансформации ФКАС при ионизации молекул электронным ударом представлены в таблице 3.8 и схеме 3.10.

Установлено, что силилированные производные продуктов трансформации ФКАС не имели возможности образовывать типичные ионы M+-17, характерные для M+-28 карбоновых кислот и для гидроксибензолов. Основные процессы фрагментирования проходили с участием силильных группировок.



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«Лобанов Михаил Викторович СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ТОНКОПЛЕНОЧНОГО ДИОКСИДА ТИТАНА МОДИФИЦИРОВАННОГО НИОБИЕМ, ИНДИЕМ И ОЛОВОМ 02.00.21 – химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Воронеж 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении выс...»







 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.