WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:   || 2 |

«Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp. ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова

Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Сильченко Артем Сергеевич

Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae

KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.

02.00.10 – Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Научный руководитель:

к.б.н. Кусайкин Михаил Игоревич ВЛАДИВОСТОК - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения

2.2 Классификация фукоиданов

2.2.1 Фукоиданы, построенные из -13-связанных остатков сульфатированной L-фукозы

Фукоиданы, построенные из и остатков

-13- -14-связанных 2.2.2 сульфатированной L-фукозы

2.2.3 Фукоиданы сложного состава. Галактофуканы

2.2.4 Фукансульфаты иглокожих

2.3 Фукоиданазы. Общая информация

2.3.1 Номенклатура и классификация фукоиданаз

2.3.2 Методы определения фукоиданазной активности

2.3.2.1 Колориметрические методы

2.3.2.2 Физико-химические методы

2.3.3 Распространение фукоиданаз

2.3.4 Выделение и очистка фукоиданаз

2.3.5 Физико-химические свойства фукоиданаз

2.3.6. Тип действия и специфичность фукоиданаз

2.3.7 Структура фукоиданаз

2.3.8 Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах

2.4 Альгиновые кислоты

2.4.1 Структура альгиновых кислот

2.6 Альгинат-лиазы

2.6.1 Номенклатура и классификация альгинат-лиаз

2.6.2 Методы регистрации альгинолитической активности

2.6.3 Распространение альгинат-лиаз

2.6.4 Альгинат-лиазы бактерий

2.6.5 Альгинат-лиазы грибов, бактериофагов и вирусов

2.6.6 Альгинат-лиазы беспозвоночных и морских водорослей

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз среди бактерий

3.2 Фукоиданазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T

3.2.1 Влияние различных углеводных компанентов питательной среды на биосинтез фукоиданаз в морской бактерии F. algae KMM 3553T

3.2.2 Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии F. algae KMM 3553T

3.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз)

3.2.4 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae KMM 3553T

3.3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp

3.4 Альгинат-лиазы морской бактерии F. algae и морского моллюска Lambis sp

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1 Материалы и реагенты

4.3 Методы исследования

5 ВЫВОДЫ

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А.о. – аминокислотный остаток БСА (BSA) – бычий сывороточный альбумин ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ДМСО (DMSO) – диметилсульфоксид ДСН (SDS) – додецилсульфат натрия ДТТ (DTT) – дитиотреитол ДЭАЭ–целлюлоза (DEAE-cellulose) – диэтиламиноэтил-целлюлоза ИПТГ (IPTG) – изопропил--D-1-тиогалактопиранозид МАЛДИ (MALDI) – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация ПААГ-электрофорез (PAGE) – электрофорез в полиакриламидном геле ПСА (APS) – персульфат аммония Р.И. – рефрактометрический индекс ТФУ (TFA) – трифторуксусная кислота УФ (UV) ультрафиолетовое излучение, =280-320нм ЯМР (NMR) – ядерный магнитный резонанс Fuc – фукоза Gal – галактоза Glc – глюкоза Man – манноза Rha - рамноза U – уроновая кислота Xyl – ксилоза

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение уникальных ферментов морских организмов, расщепляющих полисахариды бурых водорослей, характеристика их каталитических свойств и структуры – актуальная задача современной энзимологии. Объектами нашего исследования являются фукоиданазы и альгинат-лиазы морских беспозвоночных и бактерий, принимающие участие в катаболизме полианионных полисахаридов морских водорослей. Эти ферменты исследованы недостаточно, поэтому их изучение расширит наши теоретические знания о структурно-функциональных свойствах этих ферментов и позволит направленно использовать их для установления структуры природных полисахаридов.

Субстратами для исследуемых ферментов являются альгиновые кислоты (гомо- и гетерополисахариды, состоящие из остатков маннуроновых и/или гулуроновых кислот) и фукоиданы гомо- и гетерополисахариды).

Эти (высокосульфатированные полисахариды бурых водорослей относят к так называемым «поливалентным биомодуляторам», так как они обладают широким спектром биологической активности:

иммуномодулирующей, радиопротекторной, антиопухолевой, антивирусной, антимикробной, антикоагулянтной, гепатозащитной и другими. Все эти свойства делают возможным использование полисахаридов бурых водорослей в медицине. Однако лекарства на их основе еще не созданы. Это связано с недостатком информации о взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов водорослей и отсутствием простых и воспроизводимых методов стандартизации препаратов.

Существуют трудности в установлении структуры этих биополимеров, характеризующихся большим структурным разнообразием, гетерогенностью получаемых фракций, сложным построением молекул. Для стандартизации природных полисахаридов, установления их структуры, увеличения биологической активности и снижения побочных эффектов, наиболее перспективным является использование ферментов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является установление первичной структуры и характеристика каталитических свойств фукоиданаз и альгинат-лиаз морских организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработать методы поиска продуцентов фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских организмов; 2) Выбрать продуценты фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских бактерий и беспозвоночных; 3) Разработать схемы выделения индивидуальных фукоиданаз и альгинат-лиаз из выбранных объектов; 4) Изучить каталитические свойства, специфичность и тип действия выделенных ферментов; 5) Установить структуры продуктов ферментативной трансформации фукоиданов и альгиновых кислот; 6) Определить аминокислотные последовательности выделенных ферментов; 7) Получить рекомбинантные аналоги исследуемых ферментов и провести их сравнительное изучение.

Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан простой метод поиска продуцентов фукоиданаз среди микроорганизмов.

Впервые выделены:

внутриклеточная фукоиданаза из штамма морской бактерии Formosa algae KMM 3553T, фукоиданаза и альгинат-лиаза из печени морского моллюска Lambis sp. Определены их основные биохимические свойства, специфичность и тип действия. Установлены структуры основных низкомолекулярных продуктов трансформации фукоидана и полигулуроновой кислоты, полученных под действием выделенных ферментов.

Установлены первичные структуры двух фукоиданаз из штамма морской бактерии F. algae KMM 3553T. Получены две рекомбинантные фукоиданазы F. algae KMM 3553T и проведено сравнительное исследование их каталитических свойств.

Показаны особенности действия новых ферментов и возможности их дальнейшего применения для исследования структур фукоиданов и альгиновых кислот.

Рекомбинантные фукоиданазы могут найти свое применение в биотехнологии для получения сульфатированных фукоолигосахаридов, которые имеют перспективы использования их в качестве биологически активных добавок и лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработанный метод обнаружения фукоиданаз в бактериях, применим для 1.

масштабного поиска продуцентов этих ферментов.

Внутриклеточная фукоиданаза (FFA), выделенная из морской бактерии F. algae 2.

KMM 3553Т, является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление

-14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из Fucus evanescens.

Геном морской бактерии F. algae KMM 3553Т содержит два гена, кодирующих 3.

внеклеточную (FFA1) и внутриклеточную (FFA2) фукоиданазы.

Фукоиданазы FFA1 и FFA2 относятся к 107 структурному семейству 4.

О-гликозидгидролаз.

Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа 5.

действия и катализируют расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp. является ферментом эндо-типа 6.

действия и катализирует расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

Альгинат-лиаза из морского моллюска Lambis sp., является ферментом эндо-типа 7.

действия, и имеет редкую для альгинат-лиаз морских беспозвоночных специфичность:

катализирует расщепление -14-гликозидных связей между остатками L-гулуроновой кислоты. Фермент классифицирован как поли-14--L-гулуронат-лиаза (КФ 4.2.2.11).

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на:

Первом международном симпозиуме «Marine Enzymes and Polysaccharides», Вьетнам, 2012; конференции молодых ученых «ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ», Россия, 2013 и пятом Российско-Корейском форуме «The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application», Корея 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из списка ВАК РФ и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы:

Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы включает 213 источников.

Диссертация изложена на 141 страницах и содержит 41 рисунок, 24 таблицы и 4 приложения.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения Полианионные полисахариды являются обширной группой биополимеров, которые обнаружены во всех классах морских водорослей. Интерес к изучению этих полисахаридов вызван широким спектром их биологического действия. Они обладают противовирусным, противоопухолевым, иммуномодулирующим, противовоспалительным, антикоагулянтным, антиадгезивным, антиангиогенным действием [1-11].

Среди полианионных полисахаридов наибольшее внимание привлекают фукоиданы - сульфатированнные полисахариды бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Фукоиданы принадлежат к семейству сульфатированных гомо- или гетерополисахаридов, основным, а иногда единственным мономером которых являются сульфатированные и, в некоторых случаях, ацетилированные по различным положениям остатки -L-фукозы. Кроме остатков фукозы, в состав фукоиданов бурых водорослей часто входят и другие моносахариды, такие как галактоза (Gal), манноза (Man), ксилоза (Xyl), рамноза (Rha), уроновые кислоты (U). Остатки галактозы также могут содержать сульфаты подобно остаткам фукозы.

Содержание фукоиданов в бурых водорослях колеблется в довольно широких пределах: от 0,4 до 20,4 % от сухого веса и зависит от вида водоросли и сезона ее сбора.

Самое высокое содержание фукоидана (20,4 %) было обнаружено Усовым А.И. с соавторами в бурой водоросли Saundersella simplex, принадлежащей к порядку Dicyosiphonales [12]. Достаточно высокое содержание фукоиданов наблюдается в водорослях порядка Fucales: от 13,4 % до 16,5 % у F. vesiculosus и от 10,0 % до 11,5 % у Ascophyllum nodosum [13]. В дальневосточных представителях порядка Laminarinales содержание фукоиданов меньше - от 0,6 % до 6,5 %, а в дальневосточных водорослях порядка Fucales - от 1,5 % и до 7,9 % [14; 15].

Известно, что содержание и структура сульфатированных полисахаридов бурых водорослей варьируют в зависимости от эндо- и экзогенных факторов [14-16].

Структуры фукоиданов, синтезируемых одним видом водоросли, могут иметь значительные различия. В качестве примера можно привести фукоидан из F. vesiculosus, который удалось разделить на 16 фракций, имеющих различный моносахаридный состав [17]. Из бурой водоросли Kjellmaniella crassifolia были выделены две фракции фукоиданов, первая фракция представляла собой фукансульфат, построенный из остатков сульфатированной а вторая являлась

-13-связанных L-фукозы, фукоглюкурономаннаном [18; 19].

Вероятно, эти отличия в структурах связаны с ферментными системами, участвующими в биосинтезе полисахаридов. Состав этих ферментов может быть различен у каждого вида водоросли, а уровень экспрессии генов, кодирующих эти ферменты, может изменяться, так как зависит от факторов внешней среды.

В настоящее время сульфатированные фукозосодержащие полисахариды, несмотря на сложности установления их химической структуры, вызывают интерес в качестве основы для создания биологически активных добавок и лекарственных препаратов нового поколения.

–  –  –

сульфатированных фукозосодержащих полисахаридов описаны практически для каждого порядка бурых водорослей.

2.2.1 Фукоиданы, построенные из -13-связанных остатков сульфатированной L-фукозы Бурые водоросли порядка Laminariales и Ectocarpales синтезируют фукоиданы, основным структурным мотивом которых являются остатки

-13-связанные сульфатированной фукозы (рис. 2.1).

Фукоиданы, выделенные из водорослей порядка построены из Laminariales,

-13-связанных остатков фукозы, сульфатированных по С2 и/или С4 положениям.

Фукоиданы такого строения были выделены из бурых водорослей Saccharina cichorioides (Laminaria cichorioides) [20; 21], S. latissima (L. saccharina) [22; 23] и Lessonia vadosa [24].

Из бурой водоросли Chorda filum [25] был выделен фукоидан, главная цепь которого состояла из гексасахаридного повторяющегося звена, в котором на пять

-13-связанных остатков L-фукозы приходился один остаток фукозы в качестве бокового ответвления при С2. Гидроксильные группы в положениях С4 и реже С2 были этерифицированы серной кислотой.

Помимо остатков фукозы в состав молекул фукоиданов могут входить и другие моносахариды. Так, некоторые фракции фукоиданов, выделенные из бурых водорослей S. gurjanovae, S. japonica и S. longicruris, кроме фукозы содержали значительное количество галактозы [26-28].

Из бурой водоросли Undaria pinnatifida была выделена фракция галактофукана, главная цепь которого построена из 13-связанных остатков -L-фукопиранозы и

-D-галактопиранозы в соотношении 1:0,9. Минорные количества ксилозы и маннозы также были обнаружены в составе этого полисахарида [29]. Из этого же вида водоросли был выделен сульфатированный галактофукан, с таким же соотношением остатков

-L-фукопиранозы и -D-галактопиранозы (1:0,9). Было установлено, что этот полисахарид состоял из блоков, включающих остатки фукозы и галактозы (n=2-5).

Остатки -L-фукопиранозы были сульфатированы при С2 и реже при С4, положение сульфатных групп также отмечалось при С3 и/или С6 остатков -D-галактопиранозы [15].

Из бурой водоросли S. latissima были выделены четыре фракции фукоиданов.

Первая - имела типичное для порядка Laminariales строение: основная цепь, построенная из -13-связанных остатков фукозы, сульфатированных в основном по С4, реже по С2 положениям [22]. После разделения общей фракции фукоиданов из этой же водоросли на колонке с анионообменным носителем, были получены: фукогалактан, построенный из 16-связанных остатков -D-галактопиранозы с ответвлениями от основной цепи в виде единичных остатков и

-L-фукозы -D-галактозы;

14-связанных фукоглюкурономаннан, состоящий из 14-связанных остатков -D-глюкуроновой кислоты и -12-связанных остатков D-маннопиранозы с боковыми ответвлениями в виде остатков L-фукопиранозы по С3 -D-маннозы и фукоглюкуронан, построенный из 13-связанных остатков -D-глюкуроновой кислоты и содержащий разветвления в виде остатков в положении С4 Аналогичная фракция

-L-фукопиранозы [23].

фукоглюкурономаннана была выделена из водоросли K. crassifolia семейства Laminariaceae [19]. Исследование продуктов деградации фукоидана из S. gurjanovae, полученных в результате сольволитического десульфатирования, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии позволило обнаружить смешанные фукогалактоолигосахариды.

Было высказано предположение, что данный фукоидан представлял либо сульфатированный и частично ацетилированный галактофукан блочного строения, либо смесь частично ацетилированных и высокосульфатированных фукана, галактофукана и, возможно, галактана [26].

Бурые водоросли, принадлежащие к порядку Ectocarpales, в отличие от водорослей порядка Laminariales синтезируют фукоиданы с большим количеством боковых ответвлений. Так, из бурой водоросли Cladosiphon okamuranus [30] был получен фукоидан, главная цепь которого была построена из остатков L-фукозы, соединенных -13-О-гликозидными связями и имеющих боковые ответвления, в основном, в виде -D-глюкуроновой кислоты в положении при С2. Сульфатные группы расположены в основном при С4 остатка фукопиранозы. Более сложную структуру имел фукоидан из Chordaria flagelliformis. Его основная цепь частично гликозилирована по положениям С2 -D-глюкуроновой кислотой. Часть молекул гликозилирована по С4 единичными остатками сульфатированной фукофуранозы и/или дисахаридными звеньями -L-Fucf-(12)--L-Fucf-(1 [31].

Фукоидан, основная цепь которого построена из 13-связанных остатков -Lфукопиранозы, содержался в бурой водоросли Analipus japonicus, которая является представителем порядка Ralfsiales. Этот фукоидан имел преимущественно -14- и реже -12-связанные остатки L-фукопиранозы в виде боковых ответвлений.

Сульфатные группы расположены в основном, в положении С2, а ацетильные группы в положении С4 остатка фукопиранозы [32].

–  –  –

2.2.3 Фукоиданы сложного состава. Галактофуканы Как уже упоминалось, фукоиданы являются сложными гетерополисахаридами и часто кроме фукозы содержат значительные количества других моносахаридов.

Известны полисахариды, состоящие примерно из равных количеств сульфатированных остатков фукозы и галактозы. Фукоиданы, содержащие фукозу и галактозу в эквивалентных количествах, принято называть галактофуканами.

Галактофуканы были выделены из спорофиллов A. fistulosa [42], U. pinnatifida [3] и из целых талломов S. japonica [43], S. gurjanovae [44], S. patens [45].

В бурых водорослях семейства Sargassaceae обнаружены разветвленные сульфатированные галактофуканы и фукозосодержащие полисахариды сложного состава. Практически все фукоиданы, выделенные из бурых водорослей семейства Sargassaceae таких как Sargassum trichophyllum, S. plagiophyllum, S. vulgare, имели в своем составе достаточно большое количество ксилозы и галактозы [46-48].

Из S. stenophyllum получены 2 типа галактофуканов, основная цепь которых была построена из галактозы и/или маннозы, а остатки фукозы находились в разветвлениях [49]. Подобные фракции, содержащие фукозу в боковых ответвлениях, были выделены из S. fusiforme (ранее Hizikia fusiforme) [50], и Spatoglossum schroederi [51; 52].

Из S. polycystum [53] была выделена еще одна фракция полисахарида с другой структурой. Его основная цепь была построена из -13-связанных остатков фукозы, а также имела в своей структуре короткие участки, содержащие остатки фукозы, связанные -12-О-гликозидными связями с остатками галактозы, остатки галактозы в свою очередь присоединены к остаткам фукозы 13-О-гликозидными связями.

Отмечалось небольшое количество -14-связанных остатков фукозы в виде боковых ответвлений. Также присутствовали ответвления в виде коротких фрагментов цепей галактозы, связанных между собой -14-О-гликозидными связями. Сульфатные группы были присоединены по С4 остатков фукозы и галактозы основной цепи молекулы галактофукана. Галактофукан подобной структуры был выделен из Turbinaria conoides [54].

Галактофукан из S. mcclurei также имел основную цепь, построенную из остатков [3)--L-Fucp(2,4OSO3)-(13)--L-Fucp(2,4OSO3)-(1] фукозы: с участками, содержащими -14-связанные остатки фукопиранозы и 6-связанные остатки галактозы на восстанавливающем конце основной цепи макромолекулы. Боковые ответвления представляли собой остатки галактозы и/или короткие чередующиеся цепи, состоящие из -13-связанных остатков фукозы и -14-связанных остатков галактозы [55]. Сульфаты в данном полисахариде занимали главным образом положения С2 и/или С4 остатков фукозы и галактозы, а также положение С3 при 14-связанных остатках -L-фукозы и -D-галактозы в боковых ответвлениях. Аналогичный по структуре основной цепи галактофукан был найден в S. myriocystum [56].

2.2.4 Фукансульфаты иглокожих В представителях иглокожих обнаружены родственные фукоиданам полисахариды. В отличие от фукоиданов фукансульфаты иглокожих имеют линейную регулярную структуру и не содержат в своем составе других моносахаридов, а также ацетильных групп (рис. 2.3). Фукансульфаты выделены из клеточной стенки тела голотурий и икры морских ежей [57-61]. Функция фукансульфатов, содержащихся в клеточной стенке голотурий, по-видимому, сходна с функцией, выполняемой сульфатированными глюкозаминоглюканами соединительной ткани позвоночных.

Фукансульфаты клеточной стенки яйцеклеток морских ежей играют важную роль в процессе оплодотворения, обеспечивая узнавание ими спермотозоидов и индуцирование акросомной реакции [62-63].

Фукансульфаты, построенные из -13-связанных остатков фукозы, выделены из голотурий Isostichopus badionotus [64], Ludwigothurea grisea [65], Acaudina molpadioides [66]. Полисахариды подобного строения были обнаружены в клеточной стенке яйцеклеток морских ежей Strongylocentrotus franciscanus [67], S. pallidus [68], S. purpuratus [69], Lytechinus variegates [70]. Структуры полисахаридов, выделенных из этих источников, различались только количеством и положением сульфатных групп в их молекулах. В основном это были линейные полимеры, состоящие из сульфатированных остатков L-фукозы, связанных -13-О-гликозидными связями, в которых сульфатные группы расположены регулярно и образуют систему из повторяющихся звеньев три- или тетрасахарида. В некоторых случаях - это гомополимеры, в которых остатки фукозы сульфатированы только по одному положению. Исключение составляют фракции фукансульфатов, выделенные из Apostichopus japonicus (Stichopus japonicus) [58].

Структура этих фукансульфатов имела невысокую степень регулярности, подобно фукоиданам бурых водорослей. Фукансульфаты имели разветвленную структуру: их основная цепь была построена из -13-связанных остатков сульфатированной фукопиранозы, а боковые ответвления присутствовали в виде сульфатированных по С2 и/или С4 остатков фукозы.

Из клеточной стенки икры морского ежа S. droebachiensis были выделены два фукансульфата, которые имели различия в расположении сульфатных групп [68].

Первый фукан был построен в основном из повторяющихся тетрасахаридных единиц [4)--L-Fucp-(2OSО3-)-(14)--L-Fucp-(2OSО3-)-(14)--L-Fucp-(14)--L-Fucpn, в то время как второй состоял из [4)--L-Fucp-(2OSО3-)-(1]n. Подобный фукансульфат, состоящий из повторяющихся тетрасахаридных единиц [4-a-L-Fucp-(2OSO3-)-14-a-L-Fucp-(2OSO3-)-14-a-L-Fucp-14-a-L-Fucp]n, выделен из яйцеклеток морского ежа Arbacia lixula [71].

Особенности строения фукансульфатов, в первую очередь регулярность построения молекул, делают их удобными модельными соединениями для исследования биологической активности фукозосодержащих полисахаридов, а также субстратами для исследования специфичности фукоиданаз.

–  –  –

2.3 Фукоиданазы. Общая информация Информация о бактериях, способных гидролизовать молекулы фукоиданов, впервые была опубликована еще в 1959 году [72]. Термин «фукоиданазы» появился в 1967 году и был применен к препарату фермента, выделенному из гепатопанкреаса морского моллюска Haliotus sp. [73].

Исходя из данных о структуре фукоиданов, в их утилизации могут принимать участие разные ферменты, специфичные к определенным участкам молекулы фукоидана: сульфатазы, фуканазы, галактаназы, маннаназы и различные гликозидазы [73]. Интерес к изучению ферментов, катализирующих те или иные превращения фукоиданов, постоянно возрастает. Это связано с возможностью их использования в качестве инструментов для установления более детальной структуры фукоиданов.

Кроме того, эти ферменты также могут найти применение в биотехнологии для получения биологически активных фрагментов нативного фукоидана сульфатированных фукоолигосахаридов, которые более предпочтительны, чем фукоидан, для создания БАДов или лекарственных препаратов.

2.3.1 Номенклатура и классификация фукоиданаз Ферменты, катализирующие расщепление гликозидных связей между остатками сульфатированной фукозы в молекулах фукоиданов, называют фукоиданазами или фуканазами. Эти ферменты относят к классу гликозидаз (КФ 3.2.1.-). Из-за сложности и многообразия структур нативных фукоиданов классификация фукоиданаз представляется достаточно сложной задачей. Отсутствие фукоиданов с установленной структурой, столь необходимых для определения субстратной специфичности фукоиданаз, нередко приводит к путанице. Так, неточно установленная структура фукоидана из F. gardneri, которая, как полагали авторы, включала повторяющийся фрагмент, состоящий из сульфатированной фукозы, связанной -12-гликозидными связями, стала причиной неверной классификации фукоиданаз (КФ 3.2.1.44). Позднее в структуре фукоидана были обнаружены -13 и -14 связи, но отнесение фукоиданаз к ферментам, катализирующим только гидролиз -12 связей, не исправлено до сих пор.

Альтернативой классификации по типу катализируемой реакции является классификация, основанная на гомологии аминокислотных последовательностей ферментов. Такая классификация была названа CAZy – Carbohydrate Active Enzyme (www.cazy.org). Для сравнения последовательностей аминокислот, в основном, используется алгоритмический метод оценки информации. В случае гликозидгидролаз (GH) этот подход позволил разделить их на 132 семейства (GH family). Каждое семейство (GH family) содержит белки, которые имеют сходство первичной и вторичной структур. Уже сейчас классификация, основанная на гомологии первичной структуры, позволяет классифицировать белки, для которых нет данных о биохимических свойствах и функциях. CAZy в ряде случаев позволяет предсказать каталитические и молекулярные свойства гликозидаз [74], а также геометрию расщепляемых ими гликозидных связей [75]. Согласно CAZy в настоящее время насчитывается 132 семейства гликозидгидролаз, разделенных на 14 кланов, которые составлены из близкородственных семейств. Некоторые гликозидгидролазы являются мультифункциональными ферментами и могут принадлежать сразу к нескольким семействам.

На основании этой классификации фукоиданазы относятся к 107 (GH 107) структурному семейству гликозидгидролаз. Первым членом этого семейства являлась фукоиданаза FcnA из морской бактерии Mariniflexile fucanivorans SW5, первичная структура которой была опубликована в работе [76]. Авторы провели сравнительный анализ элементов вторичных структур фукоиданазы FcnA и других фукоиданаз, для которых уже была установлена аминокислотная последовательность. В результате анализа это структурное семейство было расширено, в него вошли помимо FcnA две фукоиданазы, выделенные из Alteromonas sp. SN-1009 [77].

2.3.2 Методы определения фукоиданазной активности Одной из главных трудностей при изучении фукоиданаз является отсутствие простого и чувствительного метода для обнаружения их каталитической активности.

Все существующие на данный момент методы установления гидролитической активности ферментов являются малопригодными для фукоиданаз.

2.3.2.1 Колориметрические методы Активность О-гликозидгидролаз чаще всего определяют по увеличению восстанавливающей способности реакционной смеси, обусловленной появлением продуктов ферментативной реакции. Количество восстанавливающих сахаров может быть установлено спектрофотометрически реакцией с динитросалициловой кислотой [78], бицинхонинатным методом [79], феррицианидным методом [80] или широко распространенным методом Нельсона-Сомоджи [81].

Однако колориметрические методы оказываются бесполезными при расщеплении ферментами небольшого количества внутренних О-гликозидных связей. Кроме того, в случае гидролиза фукоидана возможно негативное влияние положения сульфатных групп на восстанавливающую способность продуктов реакции – сульфатированных фукоолигосахаридов [36].

2.3.2.2 Физико-химические методы Вискозиметрия Одним из методов, применяемых для установления активности ферментов эндотипа действия, расщепляющих внутренние связи в молекуле полисахарида, является вискозиметрия. Этот метод обладает достаточной чувствительностью. Уменьшение вязкости раствора субстрата происходит уже после разрывов нескольких связей в макромолекуле, когда образование концевых группировок еще невозможно зафиксировать другими методами. Одним из достоинств вискозиметрии является возможность количественной оценки полученных данных [82]. К недостаткам метода, в случае фукоиданов, можно отнести высокую концентрацию субстрата, необходимую для приготовления вязких растворов, и большой объем проб.

Электрофорез поли- и олигосахаридов Электрофорез является эффективным способом анализа углеводсодержащих соединений [83].

Методы аналитического электрофоретического разделения включают:

электрофорез в агарозном геле, электрофорез в полиакриламидном геле, капиллярный электрофорез, электрофорез на целлюлозоацетатной и нитроцеллюлозной мембране, а также электрофорез флюоресцентно-меченных углеводов. Эти методики активно применяются при изучении структуры гликозаминогликанов (ГАГ), а также при исследовании гликозидгидролаз и лиаз, трансформирующих полианионные полисахариды [84]. Однако большинство данных методик не применялось для исследования ферментов, способных расщеплять фукоиданы. Ниже будут рассмотрены наиболее часто используемые методы электрофореза.

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). Метод основан на разделении в полиакриламидном геле полианионных поли- и олигосахаридов продуктов ферментативного действия, в соответствии с их электрофоретической подвижностью [84]. Для регистрации фукоиданазной активности этот метод был применен сравнительно недавно [76]. Авторы предложили использовать электрофорез в 27 % полиакриламидном геле, с последующей фиксацией и окрашиванием продуктов ферментативного действия алциановым синим и нитратом серебра. Этот метод является достаточно чувствительным и позволяет оценить распределение образовавшихся сульфатированных фукоолигосахаридов в полиакриламидном геле в зависимости от их молекулярных масс и зарядов.

Метод является FACE (Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis) модификацией электрофореза в ПААГ. Электрофоретическому разделению в этом случае подвергаются моносахариды и низкомолекулярные олигосахариды, к которым химическими методами ковалентно присоединяют соединение, обладающее собственной флюоресценцией, в результате чего образуются флюоресцентно-меченные производные. Метками могут служить как заряженные, так и незаряженные флюорофоры, такие как 8-аминонафталин-1,3,6-трисульфонат натрия (ANTS) или 2аминоакридон Происходит электрофоретическое разделение как (2-AMAC).

отрицательно заряженных олигосахаридов, так и олигосахаридов, не имеющих собственных зарядов, но получивших заряд за счет флюоресцентных меток [85].

Преимуществами метода являются чрезвычайно высокая чувствительность и хорошая разрешающая способность, позволяющие проводить количественную оценку содержания низкомолекулярных продуктов химической или ферментативной деполимеризации полисахаридов.

Электрофорез в агарозном геле используется в основном для разделения комплексов полианионных полисахаридов, имеющих различия в молекулярных массах и зарядах [86]. При наличии необходимых стандартов метод позволяет оценить молекулярную массу и/или электронную плотность полианионных полисахаридов.

Электрофорез в 0,6 % агарозном геле был использован Билан с соавторами для подтверждения действия препарата фукоиданазы из морского моллюска Littorina sitkana (Littorina kurila) на фукоидан из F. distichus [78; 87]. Методом гель-фильтрации в реакционной смеси не было обнаружено более низкомолекулярных, чем фукоидан, продуктов, однако при электрофоретическом разделении этой смеси были отмечены различия в электрофоретической подвижности исходного фукоидана и продуктов реакции.

Турбидиметрические методы Kitamikado и соавторы применили простой и быстрый турбидиметрический метод для поиска продуцентов альгинат-лиаз среди микроорганизмов [88]. Этот метод был адаптирован для анализа фукоиданолитической способности штаммов бактерий [76].

Для определения фукоиданолитической активности микроорганизмы выращивали в жидкой питательной среде с добавлением фукоидана. Аликвоты питательной среды отбирали спустя 1-7 дней роста микроорганизмов, и добавляли в них подкисленный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), который образует нерастворимые комплексы с высокомолекулярным фукоиданом (но не с фукоолигосахаридами).

Фукоиданолитическую способность оценивали по уменьшению мутности смеси питательной среды и БСА.

Таким образом, существует необходимость дальнейшей разработки и совершенствования методов оценки активности ферментов, модифицирующих углеводы.

2.3.3 Распространение фукоиданаз Имеются немногочисленные публикации о распространении фукоиданолитических ферментов в морских бактериях – эпифитах бурых водорослей и ассоциантов голотурий [89; 90], в морских беспозвоночных Японского моря [91; 92], а так же грибах семейства Trichocomaceae и Mucoraceae [93].

Фукоиданазная активность была обнаружена в штаммах морских бактерий Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234 [94], Flavobacterium sp. F-31 [95], Flavobacteriaceae CZ1127 [96], Sphingomonas paucimobilis PF-1 [97].

К настоящему времени фукоиданазы выделены из морских бактерий Alteramonas sp. SN-1009 [77], Fucobacteriaceae bacterium SA-0082 [98], Vibrio sp. N-5 [99], Pseudoalteromonas citrea KMM 3296, КММ 3297, КММ 3298 [90], из морских моллюсков Haliotus sp. [73], Mizuhopecten yessoensis (Patinopecten yessoensis) [100] и L. sitkana [101], морского ежа S. nudus [102], морских грибов Dendryphiella arenaria TM94 [103] и Fusarium sp. LD8 [104].

Необходимо отметить, что в наземных организмах фукоиданаз, как и фукоиданов, не обнаружено. Единственный факт: фукоиданазы могут продуцироваться факультативными морскими грибами – штаммами, которые обитают в пресной воде или на суше, но могут расти и в морской среде.

2.3.4 Выделение и очистка фукоиданаз

Выделение и очистка фукоиданаз до гомогенного состояния является чрезвычайно трудной задачей из-за крайне низкого содержания фермента в организмах-продуцентах.

Для выделения фукоиданаз в большинстве случаев применяют классические методы:

осаждение солями и все виды хроматографии. Схемы очистки состоят из большого количества стадий, однако только несколько фукоиданаз выделены в гомогенном состоянии (таблица 2.1). Это фукоиданазы из бактерий Vibrio sp. N-5 [99], M. fucanivorans SW5 [76], Alteramonas SN-1009 [77], морских грибов D. arenaria TM94 [103], Fusarium LD8 [104] и морского моллюска M. yessoensis [100]. Следует заметить, что большинство вышеупомянутых ферментов являются внеклеточными. Известно, что очистка фермента до гомогенного состояния упрощается, если содержание сопутствующих белков меньше, что характерно для внеклеточных ферментов. Таким образом, успешную стратегию выделения ферментов определяет не только выбор источника с высоким содержанием фермента, но и локализация этого фермента.

–  –  –

2.3.6. Тип действия и специфичность фукоиданаз Фукоиданазы являются наименее изученными среди ферментов, действующих на полианионные полисахариды. Механизм действия фукоиданаз практически не исследован. По типу действия фукоиданазы, как и другие гликозидазы, можно разделить на экзо-фукоиданазы, которые способны отщеплять сульфатированную или несульфатированную фукозу от невосстанавливающего конца молекул фукоиданов, и эндо-фукоиданазы, атакующие внутренние связи субстрата, с образованием на начальных стадиях реакции продуктов с широким диапазоном молекулярных масс.

Большинство известных фукоиданаз являются ферментами эндо-типа действия [18; 36;

73; 90; 97; 98; 101; 103; 104; 106]. Для определения субстратной специфичности ферментов традиционно используют различные субстраты с известной структурой.

Информацию о типе действия этих ферментов можно получить, установив структуру продуктов ферментативного гидролиза фукоиданов.

Фукоиданаза FcnA, выделенная из морской бактерии M. fucanivorans SW5, является наиболее изученной. [36; 76]. Для установления специфичности этого фермента авторы использовали в качестве субстрата фукоидан из бурой водоросли P. canaliculata, структура которого представляла собой повторяющиеся дисахаридные звенья, построенные из сульфатированной фукозы, связанной чередующимися -13- и

-14-гликозидными связями: [3)--L-Fucp-(2OSO3-)-14--L-Fucp-(2,3OSO3-)-(1]. В результате ферментативной реакции были получены тетра- и гексасахариды следующей [3)--L-Fucp-(2OSO3-)-14--L-Fucp-(2,3OSO3-)-(1]n.

структуры: Дополнительная информация о субстратной специфичности фукоиданазы FcnA была получена с использованием рекомбинантного аналога природной фукоиданазы [76].

Для установления специфичности фермента сравнивали ЯМР спектры исходного фукоидана из P. canaliculata и суммарной фракции низкомолекулярных продуктов, полученных ферментативным гидролизом этого фукоидана. В спектрах 1HЯМР продуктов наблюдалось уменьшение интенсивности сигналов протонов при С1 (5,45 мд.), соответствующих 14--L-Fucp-(2,3OSO3-), в то же время сигналы протонов при С1 (5,3 мд.), соответствующие 13--L-Fucp-(2OSO3-), оставались без изменения.

На двумерных спектрах DQF-COZY продуктов отсутствовал кросспик в области 5,45 и мд., соответствующий внутренним связям при 4,69 14-О-гликозидным

-L-Fucp-(2,3OSO3-), который присутствовал в фукоидане до его обработки фукоиданазой. Исходя из полученных данных, авторы сделали вывод о том, что фукоиданаза из M. fucanivorans SW5 специфична к -14 гликозидным связям, расположенным внутри повторяющегося фрагмента [4)--L-Fucp-(2,3OSO3-)-13--LFucp-(2OSO3-)-(1] основной цепи фукоидана. Фукоиданаза являлась гидролазой, так как при ферментативном гидролизе фукоидана не было обнаружено увеличения поглощения в УФ области спектра при длине волны 232 нм характерной для 4,5-ненасыщенных пираноз – продуктов, которые накапливаются при расщеплении субстратов по лиазному механизму.

Установлена структура низкомолекулярных продуктов, полученных при действии внеклеточного фермента из Alterоmonas sp. SN-1009 на фукоидан из K.

crassifolia [77]. Сравнение структуры продуктов со структурой исходного субстрата позволило сделать вывод о том, что исследуемая фукоиданаза, по-видимому, является ферментом эндо-типа действия и специфична к -13-гликозидным связям.

Ферменты, специфичные к -14-гликозидным связям между остатками глюкуроновой кислоты и маннозы, были выделены из морских бактерий Flavobacterium sp. SA-0082 и F. marinus SI-0098 [98; 107]. Эти ферменты расщепляли фукоидан SFGM (фукоглюкурономаннан сульфат) из K. crassifolia. В результате были получены сульфатированные фукоглюкурономаннан олигосахариды.

4,5-ненасыщенные Практически все продукты имели на невосстанавливающем конце 4-дезокси-L-эритро-гекс-4-енопиранозилуроновую кислоту, а на восстанавливающем конце – маннозу или ее сульфатированные производные. Структура продуктов свидетельствовала о том, что данные ферменты являются лиазами и расщепляют субстрат по механизму -элиминирования. Интересно, что ферментный препарат из морской бактерии F. marinus SI-0098 катализировал расщепление и других фукоиданов, выделенных из бурых водорослей сем. и Laminarinaceae: U. pinnatifida Lessonia nigrescens [108].

Морская бактерия является продуцентом Flavobacteriaceae CZ1127 внутриклеточной и внеклеточной фукоиданаз, которые деполимеризовали фукансульфаты, выделенные из различных видов иглокожих, а также фукоиданы бурых водорослей. Для сравнительной характеристики ферментов в качестве субстрата использовали фукансульфат из голотурии A. molpadioides. Показано, что препарат внутриклеточного фермента расщеплял субстрат на более короткие (3,7 кДа) фрагменты по сравнению с внеклеточным (57,7 кДа). Авторы предположили, что такие отличия связаны или с разной величиной фукоиданазной активности препаратов, или ли с различным типом действия ферментов. Препарат внутриклеточного фермента, по их мнению, содержал фукоиданазу, действующую по эндо-типу[96].

Препарат фукоиданазы из штамма CZ1127 был использован для установления структуры фукансульфата из В результате обработки A. molpadioides [66].

фукансульфата фукоиданазой были получены низкомолекулярные продукты и определена их структура. Было показано, что основным структурным фрагментом фукансульфата является [3)- -L-Fucp-13--L-Fucp-(2,4SO3-)-(1]. Анализ данных о структуре субстрата и продуктов его ферментативного гидролиза позволил заключить, что используемый фермент специфичен к гидролизу -13-гликозидных связей в молекуле фукансульфата.

Подобной специфичностью и типом действия обладала внутриклеточная фукоиданаза, обнаруженная в морской бактерии F. fucoidanolyticus SI-1234 [30]. При действии фермента на фукоидан из C. okamuranus была получена серия олигосахаридов с повторяющимся фрагментом следующей структуры: [(3)--L-Fucp-13--L-FucpOSO3-)-13--L-Fucp-(4OSO3-)-13(GlcUA--D-12)--L-Fucp)m-3)--L-Fucp-13-L-Fucp-(4OSO3-)-13--L-Fucp-(4OSO3-)-13--L-Fucp-(1] (m = 0, 1, 2 и 3). В итоге была предложена структура полисахарида: [3)--L-Fucp-13--L-Fucp-(4OSO3-)-13-L-Fucp-(4OSO3-)-13-(GlcUA--D-12)--L-Fucp].

В морской бактерии обнаружена фукоиданаза, S. paucimobilis PF-1 ассоциированная с клеточной поверхностью. Суспензия клеток деполимеризовала фукоидан из U. pinnatifida с образованием низкомолекулярных продуктов, в которых не содержалась фукоза. Фермент также не действовал на п-нитрофенил--Lфукопиранозид, поэтому было сделано предположение, что бактерия продуцирует фукоиданазу эндо-типа действия [97].

Фукоиданаза из Flavobacterium sp. F-31, вероятно, тоже была связана с клеточной стенкой. Клеточный экстракт этой бактерии с высокой скоростью катализировал деполимеризацию фукоидана из C. okamuranis [95].

Три формы фукоиданазы (Е-1, Е-2 и Е-3), способные деполимеризовать фукоидан из K. сrassifolia, были выделены в гомогенном состоянии и охарактеризованы Furukawa с соавторами [99]. Показано, что фукоиданазы с высокой скоростью расщепляли фукоидан из K. crassifolia, фукоидан из C. decipiens расщеплялся несколько медленнее, а Futomuzuku-фукоидан вообще не подвергался действию ферментов.

Согласно данным гель-фильтрации и тонкослойной хроматографии, основными продуктами действия фукоиданаз на фукоидан из K. crassifolia были сульфатированные фукоза или фукобиоза. Эти данные позволили авторам сделать вывод, что все три фукоиданазы являются экзо-ферментами.

Для изучения специфичности действия фукоиданаз из морской протеобактерии P. citrea (штаммы КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298) в качестве субстратов были выбраны фукоиданы из S. cichorioides (13--L-фукан) (рис. 2.1) и F. evanescens (13;14--L-фукан) (рис. 2.2). В штаммах КММ 3297 и КММ 3298 содержались фукоиданазы, которые катализировали эффективное расщепление фукоидана из S.

cichorioides, тогда как для фермента из штамма 3296 в качестве субстрата предпочтительней был фукоидан из F. evanescens. Авторы полагают, что исследуемые штаммы продуцируют фукоиданазы эндо-типа действия, поскольку при их действии образовывались высокосульфатированные продукты с молекулярной массой от 1 до 3,5 кДа, заметные количества фукозы и дисахаридов отсутствовали. Поскольку в продуктах действия фермента из штамма 3296 на фукоидан из F. evanescens преобладали олигосахариды с -14-гликозидной связью, авторы сделали вывод о том, что он специфичен к -13- связям [90].

Фукоиданаза из морского моллюска Haliotus sp. катализирует образование сульфатированных олигосахаридов различной молекулярной массы на ранних стадиях действия фермента. По нашему мнению, она является ферментом эндо-типа действия, несмотря на присутствие фукозы в продуктах исчерпывающего ферментативного гидролиза фукоидана. Появление фукозы при длительном инкубировании можно объяснить присутствием в препарате фукоиданазы таких ферментов как сульфатаза и фукозидаза, для которых субстратами могут быть низкомолекулярные сульфатированные олигосахариды. В работе отсутствуют сведения о структуре субстрата и продуктов его ферментативного гидролиза, поэтому автор не делает выводов о специфичности действия фермента [73].

Фукоиданаза, расщепляющая фукоидан из бурой водоросли Nemacystus decipiens с образованием низкомолекулярных олигосахаридов, была выделена из морского моллюска М. yessoensis [100]. Стоит отметить, что в этом случае при ферментативном гидролизе фукоидана гомогенной фукоиданазой помимо сульфатированных олигосахаридов образовывались и сульфатированные моносахариды.

Подобным механизмом гидролиза обладают эндо-ламинариназы, выделенные из морских беспозвоночных. В продуктах их действия на ламинаран, помимо ламинариолигосахаридов, в значительных количествах присутствует глюкоза [109].

Фукоиданазная активность была обнаружена в пищеварительном тракте морского двустворчатого моллюска Неочищенный препарат фермента Pecten maximus.

катализировал деполимеризацию фукоидана из уменьшая его A. nodosum, молекулярную массу от 25 до 3 кДа [110]. Полученные олигосахариды содержали как

-13-, так и -14-связанные остатки L-фукозы. Сульфатные группы в этих олигосахаридах были присоединены по С2 и, возможно, по С4 положениям остатков фукозы. В данной фракции также содержались несульфатированные -13- и

-14-связанные остатки L-фукозы. Впоследствие фермент из P. maximus был выделен в гомогенном состоянии. Исследования его специфичности показали, что фермент способен отщеплять несульфатированную фукозу от природных фукоолигосахаридов, не проявляя специфичности к типу гликозидной связи. Авторы классифицировали данный фермент как -L-фукозидазу (КФ 3.2.1.51) [106].

Экзо-фукоиданаза, выделеная из морского ежа S. nudus, катализировала отщепление сульфатированной по С2 фукозы от синтетического субстрата 2-сульфо-L-фукопиранозил-(12)-пиридиламинид-фукозы [102].

При действии щелочной фукоиданазы из L. sitkana (оптимум рН 8,5) на фукоидан из F. evanescens [92] выход низкомолекулярных сульфатированных продуктов (12n2) оказался в три раза выше, чем при действии на него кислой формы фукоиданазы (оптимум рН 5,4). Под действием кислой фукоиданазы на фукоидан из S. cichorioides образуется в 3 раза меньше низкомолекулярных сульфатированных продуктов (12n2), чем при гидролизе фукоидана из F. evanescens [111]. Это может быть связано с различной степенью сульфатирования фукоиданов, а следовательно с большей доступностью для фермента О-гликозидных связей в низкосульфатированном фукоидане из F. evanescens по сравнению с высокосульфатированным фукоиданом из S. cichorioides.

Для установления специфичности щелочной фукоиданазы из L. sitkana авторы [38] получили продукты расщепления фукоидана из F. evanescens. Использованная в этой работе в качестве субстрата фракция фукоидана из F. evanescens отличалась от ранее описанной Билан и сотр. [37]. По данным метилирования в этом фукоидане 13-связей было больше, чем 14- в 3,5 раза. В продуктах, напротив, преобладали 14-связи.

Высокосульфатированный (13)--L-фукан из S. cichorioides подвергался гидролизу в меньшей степени [111], возможно из-за большего содержания сульфатных групп. Из этого следует, что фермент катализирует гидролиз доступных 13-связей в молекуле фукоидана и, соответственно, является 13--L-фуканазой.

При действии кислой фукоиданазы из морского моллюска L. sitkana на фукоидан из бурой водоросли F. distichus происходило расщепление незначительного количества гликозидных связей субстрата, фукоза и низшие олигосахариды не образовывались [101]. Главным продуктом был полисахарид, построенный из повторяющихся 3)--L-Fucp-(2,4OSO3-)-(14)--L-Fucp-(2OSO3-)-(1, дисахаридных звеньев практически не отличающийся по структуре от исходного субстрата. В качестве минорного компонента выделена полимерная фракция с углеводной цепью такого же строения, но содержащая сульфатные группы только в положениях 2 и ацетилированная по положениям 3 и 4 остатков фукозы. Вероятно, в этом случае ферментативный гидролиз фукоидана происходил только по гликозидным связям несульфатированных и неацетилированных остатков фукозы, содержание которых в исходном полимере было невелико. Возможно, что в исходном полисахариде участки молекул, отклоняющиеся от его усредненной структуры, собраны в блоки, в которых сконцентрированы неполностью сульфатированные и ацетилированные повторяющиеся звенья.

Из морского гриба D. arenaria TM94 была выделена в гомогенном состоянии фукоиданаза, катализирующая гидролиз фукоидана по эндо-типу [103]. Фукоиданаза с высокой скоростью осуществляла гидролиз фукоидана из F. vesiculosus, а фукоидан из Laminaria sp. подвергался ферментативному гидролизу в меньшей степени. Продуктами ферментативного гидролиза фукоидана из F. vesiculosus были низкомолекулярные фукоолигосахариды с молекулярной массой 5,6 кДа. Аналогичную специфичность проявляла фукоиданаза, выделенная из морского гриба Fusarium LD8 [104].

Таким образом, информация о ферментах, участвующих в деградации фукоиданов, крайне ограничена. К настоящему времени исследованы некоторые фукоиданазы из бактерий, морских моллюсков, морского ежа и морских грибов, определены их физикохимические характеристики и только для части из них установлен тип действия и специфичность (таблица 2.3).

Таблица 2.3 - Специфичность действия фукоиданаз из различных источников

–  –  –

2.3.7 Структура фукоиданаз О структуре генов, кодирующих фукоиданазы, известно немного. В 2006 году был клонирован ген фукоиданазы FcnA из морской бактерии M. fucanivorans SW5, проведена экспрессия соответствующего белка и описаны биохимические свойства рекомбинантного фермента [76]. Было показано, что фермент является эндо--L-14фуканазой. Он явился первым представителем нового структурного семейства GH107.

Биоинформационный анализ продукта гена FcnA выявил наличие в нем пяти доменов.

По данным сервера BLASTp и PSI-BLAST [112] 60 % аминокислотной последовательности фуканазы не имели высокой степени сходства с белками, представленными в базе данных GENBANK. Высокий процент идентичности аминокислотных последовательностей с различными белками показали только центральная область полипептида и С-концевая аминокислотная последовательность.

Фукоиданазы Fda1 и Fda2 из морской бактерии Alterоmonas sp. SN-1009, у которых также была расшифрована последовательность гена, показали 24 % (Fda1) и 23 % (Fda2) идентичности с N-концевой аминокислотной последовательностью FcnA. Невысокий процент идентичности фукоиданаз можно объяснить их различной субстратной специфичностью: FcnA расщепляет -14-гликозидные связи, а Fda1 и Fda2 расщепляют -13-гликозидные связи. Анализ гидрофобных кластеров (АГК) участков аминокислотных последовательностей [113] FcnA и Fda2 выявил высокую степень сходства их N-концевых фрагментов, что указывает на общие элементы вторичной структуры этих участков полипептидов Анализ аминокислотной (рис. 2.4).

последовательности FcnA посредством RADAR сервера [114] обнаружил три повторяющихся домена, протяженностью около 105 аминокислотных остатков. По данным базы Pfam [115] эти домены относятся к семейству кадгерино-подобных доменов. Кадгерины - представители большого семейства кальций-зависимых белков, которые участвуют в клеточной адгезии в высших организмах и влияют на морфогенез тканей [116]. Функция кадгеринов и кадгерино-подобных доменов в белках, синтезируемых бактериями, остается малоизученной. Предположительно, кадгериновые домены участвуют в адгезии клеток посредством белок-белкового взаимодействия [117] и /или осуществляют связывание с полисахаридами [118; 119]. Имеются публикации о наличии кадгеринов и кадгерино-подобных доменов в лектинах бактерии Saccharophagus degradans 2-40, выполняющих кальций-зависимое связывание с различными полисахаридами [120]. Авторами работы [120] был сделан вывод о том, что повторяющийся дублет кадгеринов или кадгерино-подобных доменов в ферментах штамма морской бактерии S. degradans 2-40 выполняет функцию связывания с полисахаридами. Подобные домены встречаются у некоторых представителей гликозидгидролаз семейств GH5 и GH18, где они ассоциированы с каталитическими центрами ферментов. Функция, выполняемая данными доменами в фукоиданазе FcnA, остается неясной, однако, по мнению авторов, они не участвуют в каталитическом акте.

С-Концевая аминокислотная последовательность длиной в остатков FcnA 75 аминокислот, имеет высокий процент идентичности с С-концевыми участками некоторых белков, в основном карбогидраз и протеаз из бактерий, принадлежащих типу Baceroidetes. Данный домен не выполняет каталитическую функцию.

Рисунок 2.4 - N-концевой каталитический домен фуканазы FcnA из M.

fucanivorans SW5. (А) АКГ N-концевого каталитического домена FcnA из M. fucanivorans SW5 и Fda2 из Alterоmonas sp. SN-1009; (В) Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей фуканаз FcnA и Fda2 [76] Методом ИК-спектроскопии была изучена вторичная структура фукоиданазы, выделенной из морского гриба Fusarium LD8 [104]. Было показано, что вторичная структура фермента имеет три области, содержащих -лист (21,1 %; 19,8 %; 17,7 %), одну область, соответствующую -спирали (11,5 %), две области, соответствующие

-повороту (9,06 %; 6,33 %), а также неупорядоченную область. Изучая влияние температуры, авторы установили, что при температуре 60 С, которая является оптимальной для проявления фукоиданазной активности, наблюдается уменьшение содержания -поворотов и увеличение числа -спиралей, в то время как содержание

-листов и неупорядоченной структуры оставалось без изменения. Таким образом, конформационный переход -поворотов в -спирали при температуре 60 С приводит к оптимальному соотношению элементов вторичной структуры, необходимой для проявления фукоиданазной активности. Информация, полученная авторами, могла бы быть более полной, если б имелись данные о первичной структуре этой фукоиданазы.

2.3.8 Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах Микроорганизмы играют ключевую роль в метаболических процессах различных экосистем. Наличие эффективного и многофункционального ферментного аппарата в микроорганизмах обеспечивает их эволюционные преимущества при ответе на экологические изменения в экосистемах. Штаммы морских микроорганизмов, способные деполимеризовать молекулу фукоидана, в основном, являются изолятами донных отложений [36; 97; 121], морских водорослей и беспозвоночных [30; 89; 90].

Содержание фукоиданаз в различных организмах крайне низкое. Существует возможность повышения содержания ферментов в микроорганизмах путем индуцирования их биосинтеза различными веществами. Это позволит использовать микроорганизмы-продуценты в биотехнологии для получения низкомолекулярных сульфатированных фукоолигосахаридов. В настоящее время опубликовано большое количество работ, в которых приводятся результаты культивирования микроорганизмов на различных питательных средах, которые способствовали увеличению содержания целевого фермента [107].

Одним из основных подходов для индукции биосинтеза целевого фермента в бактериях является добавление в культуральную питательную среду веществ, являющихся субстратом для этого фермента. Большинство описанных штаммов бактерий-продуцентов ферментов, катализирующих трансформацию фукоиданов, наращивали на среде, содержащей фукоидан. Кроме того, фукоиданазная активность в некоторых штаммах проявлялась только после добавления фукоидана в качестве единственного источника углерода. Было показано, что биосинтез фукоиданаз морской бактерией Flavobacterium sp. F-31 происходил в жидкой питательной среде с добавлением фукоидана. При использовании жидких питательных сред без добавления фукоидана ферменты не обнаруживались. Авторы работы провели оптимизацию клеточного роста бактерии с использованием в качестве первичного источника углерода фукоидана, а в качестве вторичного - различных моно-, дисахаридов, полиолов и органических кислот. Однако информацию о корреляции клеточного роста с уровнем фукоиданазной активности авторы не привели. Наибольший клеточный рост наблюдался в присутствии в качестве вторичного источника углерода сахарозы, маннита, галактозы и глюкозы (1 группа веществ). Заметное уменьшение клеточного роста наблюдалось в присутствии фруктозы, фукозы, ксилозы, маннозы и лактозы (2 группа веществ). Интересно отметить, что уменьшение клеточного роста бактерий наблюдалось, если вещества второй группы были использованы и в качестве основного источника углерода. Вещества первой группы в этом же случае поддерживали клеточный рост. Таким образом, фруктоза, манноза, фукоза, ксилоза и лактоза проявили себя как ингибиторы клеточного роста бактерии [95].

Штаммы бактерий Flavobacteriaceae CZ1127, M. fucanivorans SW 5, Alteromonas sp. SN-1009 и S. paucimobilis PF-1 также культивировали на питательной среде с добавлением фукоидана [36; 77; 96; 97]. Однако наличие фукоиданазной активности при культивировании данных штаммов без добавления фукоидана не определяли. Можно только предположить, что фукоиданаза не является для данных штаммов конститутивным ферментом, который постоянно синтезируется клеткой независимо от присутствия субстрата в питательной среде.

В работе [93] изучено влияние различных источников углерода на синтез фукоиданаз в грибах, собранных в мексиканской пустыне. Штаммы грибов Mucor sp. 3P, Pinicillium purpurogenum GH2 и Aspergillus niger PSH синтезировали ферменты, деполимеризующие фукоидан. Авторами показано, что эти ферменты не являются конститутивными, и фукоиданазная активность появлялась только при культивировании штаммов в присутствии 0,5% фукоидана. Наибольшей активностью обладал штамм A. niger PSH, для которого было более подробно изучено влияние на биосинтез фукоиданазы различных источников углерода в комплексе с фукоиданом. Способность облигатных морских грибов к биосинтезу фукоиданаз была показана на примере штаммов D. arenaria TM94, Fusarium LD8. Данные виды грибов также были способны синтезировать фукоиданазы только в присутствии фукоидана [103-104] (таблица 2.4).

Sakai и соавторы продемонстрировали, что увеличение содержания фукоиданаз в бактериях зависит от условий их культивирования. В качестве источника углерода авторы использовали один из препаратов: фукоидан, порошок морских водорослей, альгиновую кислоту, фукозу, глюкозу, маннитол, глицерин, сахарозу, мальтозу, лактозу, крахмал. Источником азота служили: дрожжевой экстракт, пептон, мясной экстракт, обезжиренная соя, также пробовали добавлять соли натрия, фосфорной кислоты, калия, цинка [108] [107] (таблица 2.4).

–  –  –

* ед. - количество фермента, которое катализировало образование 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу, гулуроновую кислоту или фукозу) за 1 мин, в условиях определения.

Влияние рН среды и температуры культивирования на биосинтез фукоиданаз описано японскими исследователями на примере штаммов бактерий Flavobacterium sp. SA-0082 и F. marinus SI-0098, которые синтезируют как внутриклеточную, так и внеклеточную фукоиданазы. Максимальный биосинтез фукоиданаз достигается при температуре о культивирования 15 – 30 С, рН 5 – 9, при циркуляционном встряхивании продолжительностью 5 – 72 ч [107]. При соблюдении этих условий бактерии синтезируют обе формы фукоиданазы.

Для других описанных в литературе бактерий-продуцентов фукоиданаз влияние данных факторов изучено не было. Основная область рН и температур при культивировании большинства описанных штаммов лежала в области 7,0 – 8,0 и 20 - 30 оС соответственно [36; 77; 95-97].

На основе имеющихся данных можно сделать заключение, что бактерии, синтезирующие фукоиданазы, принадлежат к различным таксонам. Все исследованные виды увеличивают синтез фукоиданаз при добавлении в среду фукоидана.

В базе данных BRENDA (www.brenda-enzymes.org) по состоянию на 2013 год содержится информация о 19 фукоиданазах. Однако сведения о специфичности действия – основном свойстве ферментов – ограничены, либо вообще отсутствуют, что затрудняет классификацию ферментов. Более того, имеющаяся классификация О-гликозидгидролаз не учитывает более детальной специфичности фукоиданаз, например, влияния окружения расщепляемой связи.

Таким образом, процесс ферментативной деполимеризации фукоиданов является малоизученным. Все обнаруженные фукоиданазы обладают низким уровнем активности, что затрудняет их выделение и характеристику. Тем не менее, интерес к фукоиданазам возрастает, поскольку они могут быть использованы как инструменты в изучении сложных молекул фукоиданов, обладающих широким спектром биологических активностей.

2.4 Альгиновые кислоты Альгиновые кислоты (и их соли - альгинаты) являются гелеобразующими полисахаридами. Они входят в состав матрикса клеточной стенки всех морских водорослей отдела Phaeophyta. Помимо этого, альгиновые кислоты обнаружены в красных водорослях семейства Corallinaceae [122], а также в клеточных стенках бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter [123]. Содержание альгиновых кислот в слоевищах водорослей может достигать 30-40 % сухой массы [124]. На протяжении уже многих лет производные альгиновых кислот находят свое применение в медицине и фармацевтической промышленности [125-129]. В пищевой отрасли альгинаты широко используются в качестве загустителей, стабилизаторов и желирующих агентов [130].

–  –  –

В отличие от водорослей, бактерии синтезируют альгинаты с высоким содержанием ацетатных групп. Ацетилироваными являются гидроксильные группы при С2 и/или С3 остатков маннуроновой кислоты [123].

Молекулы альгинатов, построенные из остатков маннуроновой и гулуроновой кислот (гетерополимеры), имеют блочное строение, т.е. имеют участки, состоящие только из маннуроной (М-блоки), либо гулуроновой кислот (Г-блоки). Эти блоки разделены участками, состоящими из чередующихся остатков маннуроновой и гулуроновой кислот (МГ-блоки). Такое строение объясняется их ступенчатым биосинтезом. Биосинтез альгиновых кислот был рассмотрен на примере бактерии Pseudomonas aeruginosa [132] и бурой водоросли Ectocarpus siliculosus [133]. Показано, что биосинтез альгиновых кислот начинается с образования цепи, построенной из остатков полиманнуроновой кислоты, а при действии фермента полиманнуронан-С5эпимеразы некоторые остатки маннуроновой кислоты превращаются в гулуроновую. В результате в составе полимера наряду с остатками маннуроновой появляются остатки гулуроновой кислоты.

Поли-Г блоки имеют конформацию «гибкой» цепи и, связываясь с ионами кальция, образуют крепкие, но хрупкие гели. Поли-М блоки имеют конформацию ленты, тогда как полимеры, построенные из беспорядочно расположенных М- и Г-блоков, могут образовывать цепи с петлями. Полисахариды, построенные из регулярных поли-(МГ)n блоков, имеют конформацию синусоиды [134].

2.6 Альгинат-лиазы Альгинат-лиазы - ферменты, катализирующие расщепление гликозидных связей в молекулах альгинатов по механизму -элиминирования с образованием остатка 4-деокси-L-эритро-енопиранозилуроновой кислоты на невосстанавливающем конце молекулы олигосахарида. Формирование двойной связи происходит между С4 и С5 атомами в шестичленном цикле гексуроновой кислоты [134].

2.6.1 Номенклатура и классификация альгинат-лиаз Альгинат-лиазы относятся к классу лиаз. В современной классификации ферментов (КФ) по типу катализируемой реакции альгинат-лиазы подразделяются на поли-14--L-гулуронат-лиазы (КФ 4.2.2.11), которые катализируют расщепление

-14-О-гликозидных связей между остатками L-гулуроновой кислоты в альгиновых кислотах и поли-14--D-маннуронат-лиазы ферменты,

- (КФ 4.2.2.3) катализирующие расщепление О-гликозидных связей между остатками -Dманнуроновой кислоты. Имеются альгинат-лиазы, специфичные к расщеплению Огликозидных связей только между остатками маннуроновой и гулуроновой кислот в молекулах гетерополимеров. Обнаружены альгинат-лиазы, обладающие широкой специфичностью, катализирующие расщепление О-гликозидных связей как между остатками -L-гулуроновой кислоты, так и остатками -D-маннуроновых кислот (КФ 4.2.2.-). По типу действия альгинат-лиазы подразделяются на эндо- и экзо- ферменты.

По данным структурной классификации CAZy альгинат-лиазы разделены на 7 структурных семейств (PL 5, PL 6, PL 7, PL 14, PL 15, PL 17 и PL 18) согласно гомологии их аминокислотных последовательностей. В настоящее время известны 602 аминокислотных последовательности альгинат-лиаз (467 из бактерий, 106 из вирусов, 1 из водоросли, 15 из грибов, 13 из моллюсков) (http://www.cazy.org). Для 58 альгинатлиаз установлены характеристики их свойств и специфичности действия на субстрат. В эту группу входят: 9 альгинат-лиаз, выделенных из моллюсков, 1 - из вируса, 48 - из бактерий. У 9 ферментов методом рентгеноструктурного анализа установлена трехмерная структура (8 альгинат-лиаз из бактерий, 1 из вируса). Альгинат-лиазы, имеющие специфичность к расщеплению гликозидных связей между остатками маннуроновых кислот (ММ), представлены в структурных семействах PL5, PL6, PL14, PL15, PL17. Альгинат-лиазы, специфичные к расщеплению гликозидных связей между остаткам гулуроновых кислот, находятся в семействе PL 7, бифункциональные альгинат-лиазы, специфичные к расщеплению связей как между двумя остатками маннуроновой либо гулуроновой кислот, а также расщеплению связей между маннуроновой и гулуроновой кислотами в молекулах альгинатов, представлены в семействе PL 18.

2.6.2 Методы регистрации альгинолитической активности

Для регистрации активности альгинат-лиаз применяются различные методы:

- визкозиметрия - метод, основанный на измерении вязкости субстрата [82; 135;

136];

– определение количества восстанавливающих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции [78-81];

– электрофорез анионных олигосахаридов [83; 84];

– спектрофотометрический метод регистрации образующейся двойной связи [137; 138].

Наиболее популярным методом определения альгинат-лиазной активности является спектрофотометрическое детектирование ненасыщенных связей при длине волны 234 нм. Метод является чувствительным и не требует использования дополнительных реагентов [138]. Иногда наличие примесей, поглощающих при длине волны 234 нм, в препаратах фермента или субстрата может искажать показатели определения активности ферментов. Образование ненасыщенных связей в процессе расщепления субстрата также может быть установлено путем взаимодействия олигосахаридов, имеющих на невосстанавливающем конце двойные связи, с тиобарбитуровой кислотой, которое приводит к образованию окрашенного комплекса. Поглощение окрашенных растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 548 нм. Метод является достаточно чувствительным и специфичным, позволяет регистрировать альгинатлиазную активность в сложной смеси веществ [137].

2.6.3 Распространение альгинат-лиаз Альгинат-лиазы являются достаточно распространенными в природе ферментами, они выделены из бурых водорослей (L. digitata [139], P. canaliculata [136], U. pinnatifida [140]), морских моллюсков (Littorina spp. [141], Perna perna [142], Turbo cornutus [143] и Choromytilus meridionalis [142]), а также бактериофагов, специфичных к бактериям вида P. aeruginosa [144] и Azotobacter vinelandii [145], известных своей способностью к синтезу биопленок, состоящих из альгиновых кислот.

2.6.4 Альгинат-лиазы бактерий Большинство штаммов морских бактерий - продуцентов альгинат-лиаз, являются ассоциатами морских водорослей или морских моллюсков [146; 147].

Морские бактерии продуцируют альгинат-лиазы, которые могут существенно различаться по каталитическим свойствам и субстратной специфичности. Как правило, бактерии способны синтезировать одну или две молекулярные формы внеклеточных или периплазматических альгинат-лиаз [148-151]. Имеются и исключения, например, штамм Alteromonas sp. H-4 продуцировал, по меньшей мере, 5 молекулярных форм альгинат-лиаз различной специфичности, способных деполимеризовать гетерогенный субстрат [152-154]. Большинство описанных в литературе альгинат-лиаз, выделенных из морских бактерий, являются действующими по 14--D-маннуронат-лиазами, эндо-типу Имеются примеры, когда штаммы бактерий продуцировали [134].

экзо-14--D-маннуронат-лиазы [155; 156] или эндо-14- -L-гулуронат-лиазы [134; 146].

Альгинат-лиазы, продуцируемые почвенными и морскими бактериями, имели различия в каталитических свойствах. Для проявления активности альгинат-лиаз почвенных бактерий были оптимальными значения рН от 5,8 до 8,5 [157-159] и температуры от 28 °С до 70 °С [158-161]. Альгинат-лиазы морских бактерий проявляли максимальную активность в области рН 7,5-8,0 [153; 162] и при температуре от 25 до 50°С [152; 153; 163; 164].

Активаторами альгинат-лиаз почвенных бактерий явлются ионы одновалентных (K+, Na+) и двухвалентных металлов (в основном, ионы Ca2+) [157; 160; 165-167].

Закономерности влияния ионов металлов на активность альгинат-лиаз морских бактерий выявлено не было. Максимальная активность одних альгинат-лиаз возрастала в присутствии высоких концентраций NaCl, тогда как другим было необходимо присутствие ионов двухвалентных металлов (Ca2+, Mg2+) [134].

Широко варьировалась и молекулярная масса альгинат-лиаз, выделенных из различных штаммов бактерий: от 23 до 100 кДа [155-159; 168; 169].

2.6.5 Альгинат-лиазы грибов, бактериофагов и вирусов Альгинат-лиазы были выделены из некоторых видов морских грибов, таких как Corollospora intermedia [170], Asteromyces cruciatus [170], A. oryzae [171], D. arenaria и В результате секвенирования нуклеотидных [172] D. salina [173; 174].

последовательностей геномов грибов видов Termitomyces albuminosus (GenBank AEK06448.1), Tremella fuciformis (GenBank ADE10038.1), Piriformospora indica DSM 11827 (GenBank CCA70067.1, CCA74333.1), Mycosphaerella pini ATCC MYA-605 (GenBank ABS82817.1) [175], Thielavia terrestris NRRL 8126 (GenBank AEO68682.1) [176], A. oryzae RIB40 (GenBank BAE63841.1) [177], Sporisorium reilianum SRZ2 (GenBank CBQ67679.1) [178], Botryotinia fuckeliana (GenBank CCD53238.1) были установлены гены, кодирующие альгинат-лиазы. Работы, посвященные получению рекомбинантных аналогов природных альгинат-лиаз грибов, на сегодняшний день отсутствуют.

Большая часть грибов, являющихся продуцентами альгинат-лиаз, были морскими обитателями поверхности талломов морских водорослей [170; 172-174]. Имеется только одно сообщение об альгинат-лиазах, обнаруженных в грибах отдела Ascomycetes, обитающих на суше [179].

Практически все изученные альгинат-лиазы грибов являлись внеклеточными ферментами [134]. Только в грибах рода Asteromyces spp. альгинат-лиазы были связаны с поверхностью клеток и практически не секретировались в культуральную среду [170].

Имеются немногочисленные сведения о специфичности альгинат-лиаз грибов.

Альгинат-лиаза из D. salina была специфична к расщеплению связей между остатками маннуроновой кислоты [173]. Альгинат-лиаза широкой специфичности была выделена из A. oryzae [171].

Известные альгинат-лиазы грибов проявляли максимальную активность в области рН 5 - 7 и при температуре 37 – 45 °С [170-174]. Хлорид натрия в концентрации от 1 до 3 % активировал альгинат-лиазу из D. salina, в то время как активность альгинат-лиазы из D. arenaria падала в присутствии 1 % NaCl [172; 174]. Ионы двухвалентных металлов: Ca2+, Mg2+, Zn2+ увеличивали активность альгинат-лиаз из D. salina и D.

arenaria NaCl [172; 174]. Ионы Zn2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+ и Co2+ активировали альгинатлиазу из A. oryzae, а ионы Ca2+, Cd2+ и Hg2+ ингибировали активность того же фермента [171; 172; 174].

Альгинат-лиазы бактериофагов являются внеклеточными ферментами и проявляют эндолитическую активность. Молекулярные массы альгинат-лиаз бактериофагов лежат в области 30 - 42 кДа, рН-оптимум 7,5-8,5 [144; 145; 180; 181; 182]. Из вируса, поражающего зеленую водоросль рода Chlorella, была выделена единственная альгинатлиаза вирусного просхождения [183]. Ген, кодирующий её, был клонирован и экспрессирован в штамме Escherichia coli. Этот фермент был гомологичен маннуронатлиазе морского моллюска T. cornutus. Молекулярная масса альгинат-лиазы вируса составляла 39 кДа, оптимум рН 10,5. Активность альгинат-лиаза проявляла только в присутствии ионов Ca2+ [183].

2.6.6 Альгинат-лиазы беспозвоночных и морских водорослей Несмотря на то, что альгинат-лиазная активность была обнаружена в большом количестве морских моллюсков, немногие из этих ферментов были выделены и охарактеризованы. Альгинат-лиазы были выделены из пищеварительных органов Littorina sp. [184; 185], T. cornutus [143; 186-188], Haliotis discus hannai [189], H. rufescens и H. corrugate [190]. Путем клонирования гена были установлены первичные аминокислотные последовательности альгинат-лиаз из Aplysia kurodai [191], H. discus hannai [192] и L. brevicula [193]. Продукты их генов были экспрессированы, и изучены свойства рекомбинантных альгинат-лиаз.

Показано, что в некоторых моллюсках биосинтезируются несколько альгинат-лиаз.

Два изофермента, специфичные к расщеплению связей между остатками маннуроновых кислот, были выделены из T. cornutus [188]. Две альгинат-лиазы, различающиеся по типу действия, обнаружены в моллюсках A. kurodai, H. discus hannai, L. brevicula и H. rufescens [189; 190; 193; 194]. Большинство изученных альгинат-лиаз моллюсков представлено эндо-14--D-маннуронат-лиазами, экзо-14--D-маннуронат-лиазами или альгинат-лиазами, специфичными к ММ и МГ участкам цепи альгиновых кислот [134]. Исключение составляет одна из двух альгинат-лиаз, выделенных из H. rufescens, которая была классифицирована как экзо-14--L-гулуронат-лиаза [190].

Полиманнуранат-лиазы морских моллюсков проявляли максимум активности в слабокислых и щелочных диапазонах рН от до в то время как 5,6 9, экзо--14-L-гулуронат-лиаза из H. rufescens проявляла активность в кислой области рН 4,0 [190]. Активность альгинат-лиазы из Haliotis spp. увеличивалась в 0,05-0,75 М NaCl [190]. Более высокая концентрация NaCl (0,2-1 M) была необходима для проявления максимальной активности альгинат-лиаз, выделенных из H. tuberculata, Spisula solidissima, T. cornitus [188; 195; 196]. Nakada и соавторы предположили, что при увеличении ионной силы происходит уменьшение вязкости раствора альгината, что облегчает действие фермента [190].

Ионы металлов Mg2+, Mn2+, Co2+ и Ni2+ оказывали активирующее действие на активность большинства альгинат-лиаз моллюсков [134]. Ионы Ca2+ являлись активаторами одного из изоферментов однако ингибировали T. cornutus, ферментативную активность альгинат-лиазы из H. rufescens [188-190]. Ионы Zn2+ и Cu2+ оказывали ингибирующее действие на альгинат-лиазу из Littorina sp. [185].

Ограничены сведения об альгинат-лиазах из морских водорослей. Было установлено, что уровень активности альгинат-лиаз зависит от сезона сбора водорослей, а также от места локализации ферментов в талломе [197]. Максимальную активность альгиназы водорослей U. pinnatifida и P. canaliculata проявляли при рН 7,5 – 7,7 [136;

140; 197] и увеличивали свою активность в присутствии ионов Ca2+[136;140].

Большинство альгинат-лиаз водорослей проявляли способность расщеплять гликозидные связи как между остатками маннуроновой, так и между остатками гулуроновой кислот в молекулах альгинатов [134]. Однако, вывод о столь широкой специфичности одного фермента вызывает сомнения, так как при изучении свойств альгинат-лиаз водорослей использовались неочищенные ферментные препараты, которые могли содержать несколько альгинат-лиаз с различной специфичностью.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз среди бактерий Фукоиданазы до сих пор являются малоизученными ферментами, исследование которых отчасти затруднено небольшим количеством источников этих ферментов и сложностью методов, применяемых для обнаружения фукоиданаз.

Для обнаружения фукоиданаз в микроорганизмах нами был разработан простой метод определения утилизации фукоидана бактериями, растущими на агаризованной питательной среде.

Штаммы бактерий выращивали на стандартной агаризованной питательной среде с добавлением фукоидана, затем удаляли клетки бактерий с поверхности агара и проводили его обработку раствором цетавлона. При взаимодействии цетавлона с фукоиданом образуется нерастворимый в воде комплекс [199], который, выпадая в осадок, окрашивает агар в молочно-белый цвет. Фукоиданазная активность была обнаружена по формированию прозрачных зон (обедненных фукоиданом) в месте посева штаммов-продуцентов фукоиданаз (рис. 3.1 А).

На основании проведенного ранее скрининга в качестве продуцентов фукоиданаз нами были выбраны штаммы бактерий F. algae KMM 3553Т (рис. 3.1, номер 4) и штамм МФ-2-3 (рис. 3.1, номер 2), в качестве контролей были использованы штаммы Coheasibacter sp. SF 2-8, Cytophaga sp. ZBS 33F и МФ 4-5 (рис. 3.1, номера 1, 3 и 5), не продуцирующие фукоиданазы (рис. 3.1 А). Оптимальная концентрация фукоидана в питательной среде составляла 0,5 %. При более низких концентрациях: 0,1 – 0,4 % фукоидан плохо образовывал нерастворимый комплекс с цетавлоном, что затрудняло определение активности.

Подобный метод был ранее использован для скрининга бактерий, расщепляющих карбоксилсодержащие полисахариды [200]. Использование красителей, специфичных к анионным группировкам полимеров, оказалось неудачным: нативный фукоидан и продукты его ферментативного гидролиза окрашивались с одинаковой интенсивностью.

Преимуществом разработанного нами экспресс-метода перед другими, используемыми для поиска продуцентов фукоиданаз, является отсутствие необходимости приготовления клеточного экстракта.

Для скрининга и изучения свойств фукоиданаз мы использовали также электрофоретический метод Результаты определения фукоиданазной активности, метод.

полученные в агаре, были подтверждены присутствием продуктов гидролиза фукоидана, обнаруженных с помощью электрофореза в ПААГ. Этим метод методом было показано, что штаммы 2 и 4, выращенные на жидкой питательной среде с добавлением фукоидана, утилизировали его в процессе роста клеток (рис. 3.1 Б). Фукоиданазная активность также была обнаружена в клеточных экстрактах штаммов 2 и 4, что подтверждается образованием хорошо видимых на электрофореграмме полос низкомолекулярных фукоолигосахаридов (рис 3.1 В). Метод Нельсона [81], который регистрирует рис., восстанавливающие сахара и используется для определения активности О гликозидгидролаз, не выявил присутствия фукоиданазной активности в штаммах 2 и

4. По-видимому, эти фукоиданазы расщепляют фукоидан на большие фрагменты, незначительно повышая содержание восстанавливающих сахаров в реакционной смеси.

Может существовать и другая причина, связанная с особенностями структуры образующихся в результате ферментативной реакции продуктов, которые затрудняют продуктов образование окрашенного комплекса в методе Нельсона.

А Б В

–  –  –

Разработанный нами экспресс-метод поиска продуцентов фукоиданаз менее трудоемкий, чем метод Нельсона и электрофоретический метод. Кроме того, од возможности метода могут быть расширены. Например, использование фукоиданов различной структуры может дать информацию о субстратной специфичности фукоиданаз, продуцируемых исследуемыми штаммами (микроорганизмами).

3.2 Фукоиданазы морской бактерии F. algae KMM 3553T По результатам скрининга среди морских бактерий в качестве продуцента фукоиданазы нами был выбран штамм 3553Т из коллекции морских микроорганизмов КММ, принадлежащей ТИБОХ ДВО РАН [198]. Штамм морской бактерии был идентифицирован как F. algae [201].

В качестве субстрата применяли высокоочищеный фукоидан из бурой водоросли F. evanescens. Для обнаружения сульфатированных олигосахаридов, образующихся в результате ферментативного гидролиза фукоидана, нами был использован ПААГ электрофорез. Определение восстанавливающей способности продуктов реакции, полученных с помощью этого фермента, оказалось безрезультатным. Другие исследователи фукоиданаз также сталкивались с подобной проблемой [36].

3.2.1 Влияние различных углеводных компанентов питательной среды на биосинтез фукоиданаз в морской бактерии F. algae KMM 3553T Для выяснения факторов, влияющих на биосинтез фукоиданаз морской бактерии F. algae KMM 3553T, была изучена динамика роста бактерии и утилизация углеводных компонентов питательной среды различного состава. Были использованы: глюкоза, ксилоза, трегалоза, фукоидан, альгиновая кислота и ламинаран. Состав питательной среды заметно влиял на рост бактерий. Максимальный клеточный рост наблюдался при добавлении в качестве основного источника углерода глюкозы, ксилозы и ламинарана, трегалоза ингибировала рост бактерий (рис. 3.2). Фаза экспоненциального роста звершалась спустя 20 ч для бактерий, выращенных на питательных средах, содержащих в качестве источников углерода один из компонентов: глюкозу, ксилозу, ламинаран, фукоидан (рис. 3.2). На среде, содержащей альгиновую кислоту, стационарная фаза роста достигалась уже через 8 ч, когда альгиновая кислота почти полностью расходовалась (рис. 3.3 Д1). Фукоидан и альгиновая кислота, добавленные в питательную среду, не расщеплялись бактериальными ферментами до образования заметного количества низкомолекулярных олигосахаридов, о чем свидетельствало отсутствие увеличения количества восстанавливающих сахаров (рис. 3.3 Е1 и Д1).

Начало биосинтеза внутриклеточных ферментов, расщепляющих фукоидан, наблюдалось в середине фазы экспоненциального роста F. algae KMM 3553 на питательных средах, содержащих глюкозу (рис. 3.3 А2), ксилозу (рис. 3.3 Б2), ламинаран (рис. 3.3 С2) и трегалозу (рис. 3.3 Г2). Эффективными индукторами биосинтеза фукоиданаз являлись полисахариды фукоидан и альгиновая кислота, действие которых проявлялось на самых ранних этапах роста бактерий (4 ч) (рис. 3.3 Е2 и Д2).

–  –  –

Д2 Е2 Е3 Рисунок 3.3 – Кинетика биосинтеза фукоиданазы из F. algae и расхода компонентов питательной среды в процессе роста бактерии. А1, Б1, В1, Г1, Д1, Е1 - динамика роста ), расход общего сахара ( ) и уровень восстанавливающих F. algae KMM 3553Т ( сахаров ( ); А2, Б2, В2, Г2, Д2, Е2 - электрофореграммы продуктов гидролиза фукоидана под действием клеточных экстрактов F. algae KMM 3553Т в процессе роста клеток; Е3 - электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана под действием культуральной среды F. algae KMM 3553Т в процессе роста клеток Для дальнейшей работы бактерии выращивали на жидкой питательной среде с добавлением фукоидана в течении 24 ч.

3.2.2 Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии F. algae KMM 3553T Был проанализирован уровень активности различных О-гликозидгидролаз в клеточном экстракте F. algae. Показано, что кроме фукоиданазы в нем содержатся высокоактивные -D-глюкозидаза, -D-N-ацетилглюкозаминидаза, альгинат-лиаза и ламинариназа (таблица 3.1). Клеточный экстракт F. algae служил источником для выделения фукоиданазы.

–  –  –

Для очистки фукоиданазы (FFA) была выбрана комбинация методов ионообменной хроматографии и гель-фильтрации (см. раздел 4, «Экспериментальная часть»). Фермент был выделен в гомогенном состоянии. По результатам ДСН-ПААГ электрофореза его молекулярная масса составила 96±1 кДа (рис. 3.4). Выход фермента (по белку) составил 0,0003 % от исходного содержания растворимых белков в клетке F. algae.

–  –  –

Рисунок 3.4 – ДСН ПААГ-электрофорез фракций белков из клеточного экстракта F.

algae. (1) – Клеточный экстракт F. algae, (2) – фракция белков после очистки экстракта на DEAE-MacroPrep; (3) - маркеры молекулярной массы белков «Bio-Rad»; (4)очищенная фукоиданаза из F. algae Изучение свойств фукоиданазы проводилось на частично очищенном препарате фермента, не содержащем других О-гликозидгидролаз. FFA была активна в широком диапазоне рН 6,5-9 (рис. 3.5 А). Ионы Мg+2, Ca+2 и Ba+2 значительно активируют фермент, а присутствие ионов Cu+2 и Zn+2 оказывает выраженное ингибирующее действие на ферментативную активность (рис. 3.5 Б).

Была изучена кинетика гидролиза фукоидана из F. evanescens частично очищенной фукоиданазой. Образование сульфатированных олигосахаридов было заметным на электрофореграмме спустя 12 ч инкубирования реакционной смеси, максимальный выход продуктов ферментативного гидролиза фукоидана наблюдался через 48 ч (рис. 3.5 В).

А Б В Рисунок 3.5 – Электрофореграммы продуктов гидролиза фукоидана из F. evanescens фукоиданазой из клеточного экстракта F. algae: (А) – оптимум рН фукоиданазы из F. algae; (Б) – Влияние ионов металлов на активность фукоиданазы, Р- реакционная смесь без добавления солей металлов, Кс- фукоидан; (В) – кинетика гидролиза фукоидана фукоиданазой из F. algae Показано, что длительное (более 60 мин) выдерживание раствора фермента при температуре 45 °С заметно снижало ферментативную активность FFA, полностью инактивировался фермент за 40 мин при температуре 55 °С и выше (рис. 3.6).

Рисунок 3.6 – Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана фукоиданазой из F.

algae, которая предварительно выдерживалась в течении различного времени (мин) при 45, 55 или 65 С Фукоиданаза из морской бактерии F.algae (FFA) катализировала гидролиз фукоиданов из F. evanescens и F. vesiculosus состоящих из чередующихся -13- и

-14-связанных остатков сульфатированной L-фукозы, но не фукоидана S. cichorioides построенного из -13-связанных остатков сульфатированной L-фукозы (таблица 3.2).

Таблица 3.2 – Специфичность фукоиданазы из клеточного экстракта F.

algae

–  –  –

*F. dAc - дезацетилированное производное фукоидана из F. evanescens;

**F. dAcS - дезацетилированное и десульфатированное производное фукоидана из F. evanescens (Fuc:OSO3- = 1:0,2 моль) *** - Отношение содержания сахаров в низкомолекулярных продуктах ферментативного гидролиза к содержанию сахаров в реакционной смеси. Содержание сахаров определяли фенол-сернокислотным методом При исследовании специфичности фукоиданазы в качестве субстрата был использован фукоидан из F. evanescens, который имеет преимущественно линейную структуру, построенную из повторяющихся 13- и 14-связанных остатков -Lфукопиранозы, сульфатированных по второму положению. Добавочный сульфат занимает в нем 4 положение в 13-связанных остатках -L-фукозы [37]. Фукоидан состоял преимущественно из остатков сульфатированной фукозы, молярное Fuc:Gal:Xyl:OSO3соотношение составило соответственно. Для 1:0,03:0,01:1,2, определения специфичности фукоиданазы к типу расщепляемой им связи необходимо установить изменение соотношения -13- и -14-гликозидных связей в исходном фукоидане и продуктах его ферментативного гидролиза. Определение соотношения этих типов связи проводили методом ЯМР-спектроскопии. Такой же метод был применен ранее французскими исследователями [110]. Высокомолекулярные (ВМФ) продукты ферментативного гидролиза отделяли от низкомолекулярных (НМФ) осаждением 75 % водным этанолом. Выход НМФ составил 49 %. Моносахаридные составы НМФ, ВМФ и исходного фукоидана были практически идентичны и включали преимущественно остатки фукозы. 1H и 13C ЯМР спектры ВМФ фракции также были аналогичны спектрам исходного фукоидана. Спектры 1H ЯМР фракции НМФ имели хорошее разрешение, что позволило провести сравнение интегральных интенсивностей сигналов, соответствующих Н6 остатков фукозы (рис. 3.7 А и Б). 1H ЯМР спектр фракции НМФ заметно отличался от спектров исходного фукоидана (рис. 3.7). Сравнительный анализ интегральных интенсивностей сигналов в области 1.24-1.32 и 1.38-1.41 м.д., соответствующих Н6 13- и 14-связанных остатков фукозы соответственно, показал, что соотношение 13- и 14-связей в НМФ составило 3:1 (рис 3.7 Б). Соотношение этих типов связей в исходном фукоидане было практически равным. Уменьшение содержания 14-О-гликозидных связей в продуктах гидролиза говорит об их расщеплении. Кроме того, в 1Н спектре низкомолекулярной фракции отсутствовал сигнал Н4 (4,9 м.д.), соответствующий остатку 2,4 дисульфатированной фукозы (рис. 3.7 А и В), что может свидетельствовать в пользу расщепления 14-связей внутри фрагмента следующей структуры: [3--L-Fucp(2OSO3-)-14--L-Fucp(2OSO3-)-1].

Б А В Рисунок 3.7 - 1H ЯМР спектры фукоидана и продуктов его ферментативного гидролиза фукоиданазой FFA. (А) – Спектр НМФ ферментативнго гидролиза фукоидана;

(Б) - увеличенная область спектра НМФ ферментативного гидролиза фукоидана;

(В) - спектр фкоидана ;( ) - сигнал соответствующий протонам фрагмента структуры 3--L-Fucp(2,4OSO3-)-1; ( ) - область сигналов соответствующая протонам фрагмента структуры 4--L-Fucp(2OSO3-)-1; ( ) - область сигналов соответствующая протонам фрагмента структуры 3--L-Fucp(2OSO3-)-1

–  –  –

A -L-Fucp(2OSO3-)-(1 5.32/95.3 4.45/76.4 4.08/69.9 3.88/73.3 4.22/67.1 1.23/16.0 Б 3)--L-Fucp(2OSO3-) 5.48/91.7 4.50/74.6 4.02/73.9 4.06/68.6 4.47/67.9 1.22/16.1 В -L-Fucp(2,3ОSO3-)(1 5.34/96.4 4.56/73.6 4.70/76.2 4.21/71.7 4.53/67.8 1.24/16.3 Г 3)--L-Fucp(2SO3-)- 5.50/91.7 4.51/74.6 4.03/75.2 4.08/70.5 4.48/67.8 1.23/16.2 3.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз) Данные об аминокислотных последовательностях фукоиданаз были получены в результате секвенирования нуклеотидной последовательности генома морской бактерии F. algae, выполненного в Норвежском центре структурной биологии города Тромсё. В базах данных NCBI, UniProt, TIGRFam, Pfam, PRIAM, KEGG, COG, и InterPro был проведен поиск гомологов продуктов генов, содержащихся в геноме F. algae.

Результаты поиска позволили сделать вывод о наличии в геноме F. algae двух генов, кодирующих фукоиданазы (FFA1 и FFA2). Расчетные массы продуктов генов FFA1 и FFA2 составили 111 кДа (1008 а.о.) и 97,9 кДа (890 а.о.) соответственно. Сравнение аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 посредством множественного выравнивания при помощи сервиса Clustal Omega EMBL-EBI показало 57 % их идентичности. Поиск в базе данных BLASTp (NCBI) выявил высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 с уже известной фукоиданазой FcnA из морской бактерии M. fucanivorans (GenBank номер CAI47003.1).

Идентичность аминокислотных последовательностей FcnA с FFA1 и FFA2 составила 67 % и 57 % соответственно.

Меньшая идентичность наблюдалась при сравнении аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 с аминокислотными последовательностями других известных фукоиданаз: из Alteromonas sp. SN-1009 (Fda1 (GenBank AAO00508.1) и Fda2 (GenBank AAO00509.1)) и из Shewanella violacea DSS12 (SVI_0379 (GenBank BAJ00350.1)). Гипотетическая последовательность последней была установлена при прогнозировании функции генов по гомологии нуклеотидных последовательностей (таблица 3.4).

–  –  –

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей FFA1, FFA2 и других известных фукоиданаз показало наличие общих для этих ферментов консервативных участков, что позволило отнести FFA1 и FFA2 к новому 107 семейству гликозидгидролаз (CAZy), в которое входят четыре фукоиданазы. В некоторых консервативных участках фукоиданаз обнаружены точечные замены аминокислотных остатков. Характер этих замен в молекулах фукоиданаз условно делит их на две группы, которые соответствуют специфичности ферментов. Например, в одном из консервативных участков фукоиданаз были выявлены точечные замены аминокислот Ala308 и Cys310, содержащихся в молекулах FFA1, FFA2 и FcnA, на аминокислотные остатки Gly308 и Trp310 в последовательностях Fda1, Fda2 и SVI_03739 (рис. 3.9).

Известно что, фукоиданазы FFA1, FFA2 и FcnA катализируют гидролиз -14-Oгликозидных связей, в то время как Fda1, Fda2 и, вероятно, SVI_03739 расщепляют O-гликозидные связи в молекулах фукоиданов. К сожалению, накопленные на сегодняшний день немногочисленные данные о структуре и каталитических свойствах фукоиданаз не дают возможность предположить функции, выполняемые этими консервативными участками: каталитические, субстрат-связывающие или др.

* * * * * * ** * * ** ** * * ** * ** ** * ** * * Рисунок 3.9 – Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей фукоиданаз из F. algae KMM3553 (FFA1, FFA2), M. fucanivorans SW5 (FcnA), Alteraminas sp. SN-1009 (Fda1 и Fda2), Shewanella violacea DSS12 (SVI_03739); ); ( * ) - точечные замены а.о. в консервативных участках При помощи сервиса обнаружено наличие сигнальной InterProScan последовательности у FFA1 (Met1-Gln26), которая характерна для внеклеточных белков, в то время как у FFA2 такая последовательность отсутствовала (рис. 3.10).

Аминокислотные последовательности FFA1 и FFA2 имели в своем составе повторяющиеся кадгериноподобные домены.

Для фукоиданазы (К) FFA1 кадгериноподобный домен K1 включал последовательность: Pro428-Gly519, домен K2:

Asn533-Phe626, домен K3: Trp636-Glu730, для фукоиданазы FFA2 домен K1: Pro408Gly509, домен К2: Gly522-Val616 (SUPERFAMILY номер SSF49313). Похожие повторяющиеся кадгериноподобные домены были обнаружены у FcnA.

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей кадгериноподобных доменов фукоиданаз FcnA, FFA1 и FFA2 выявило наличие нескольких высококонсервативных участков (рис. 3.11). В таблице 3.5 указана степень идентичности доменов. Кадгериноподобные домены встречаются у ферментов бактерий, катализирующих гидролиз соединений различных классов (белков, углеводов, нуклеиновых кислот), а также у лектинов, связывающихся с анионными полисахаридами [117-118; 202]. Функции кадгериноподобных белков разнообразны.

Отмечено участие кадгериноподобных белков, ассоциированных с клеточной стенкой бактерий, в адгезии клеток [116]. Стоит отметить, что общими для всех описанных в литературе функций этих доменов является связывание с тем или иным биополимером при помощи ионов кальция (кальций-зависимое связывание) [120]. Известно, что фукоиданы и другие анионные полисахариды в водорослях содержатся именно в виде кальциевых солей. Возможно, что по этому механизму происходит связывание фукоиданазы непосредственно с субстратом или связь самих бактерий, продуцирующих фукоиданазу, с поверхностью клеток водорослей, являющихся объектом их питания.

А К1 К2 К3 С СИ Б К1 К2 С В К1 К2 К3 С Рисунок 3.10 – Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз FFA1 (А), FFA2 (Б) из F. algae KMM 3553T и FcnA (В) из M. fucanivorans при помощи сервера InterProScan. K1-, K2-, K3- кадгериноподобные домены фукоиданаз, С - С-концевые домены фукоиданаз, СИ- сигнальная последовательность фукоиданазы FFA1 Рисунок 3.11 - Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей кадгериноподобных доменов (К1, К2, К3) фукоиданаз FcnA, FFA1 и FFA2

–  –  –

С-Концевые участки FFA1 (Leu940-Arg1007) и FFA2 (Leu822-Arg889) составляли высококонсервативный домен, включающий 68 аминокислотных остатков. Эти участки демонстрировали высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей (от 26 % до 41 %) с С-концевыми доменами различных белков, в основном, гликозидгидролаз и протеиназ, синтезируемых бактериями типа Bacterioidetes, в частности представителями родов Porphyromonas, Cytophaga, Zobellia, Flavobacterium, Microscilla и Rhodothermus.

Таким образом, в аминокислотной последовательности исследуемых нами фукоиданаз (FFA1 и FFA2) присутствуют все домены, ранее найденные в структуре FcnA, что может быть объяснено таксономической близостью организмов продуцентов (рис. 3.12).

Рисунок 3.12 – Филогенетическое расположение штаммов морских бактерий F.

algae и M. fucanivorans [121] 3.2.4 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae KMM 3553T Для подтверждения прогнозируемой функции генов FFA1 и FFA2 морской бактерии F. algae были получены рекомбинантные продукты этих генов. С целью определения функции того или иного домена были получены 6 генетических конструкций по три для каждой из фукоиданаз FFA1 и FFA2. В качестве вектора использовалась плазмида pCold-Tev II (разработанная и любезно предоставленная Норвежским центром структурной биологии). Генетические конструкции содержали нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные фукоиданазы FFA1 (Ile27 – Asn1008) и FFA2 (Val9 – Asn890), а также их усеченные производные FFA1-SD (Ile27 – Asn735) и FFA2-SD (Val9 – Ala620) без С-концевого домена и FFA2и без повторяющихся KD (Ile27 – Pro415) FFA1-KD (Val9 – Phe404) последовательностей кадгериноподобных доменов. Все конструкции содержали нуклеотидную последовательность, кодирующую полигистидиновый участок (6His) и участок для расщепления Tev-протеазой.

В качестве систем экспрессии генов FFA1 и FFA2 были использованы различные коммерческие штаммы E. coli: BL21 star (DE3)pLysS, Rosetta-gami (DE3)pLysS, BL21 (DE3)GroEL.

Практически все рекомбинантные белки: полноразмерные фукоиданазы (FFA1, FFA2) и их усеченные производные (FFA1-SD, FFA2-SD) экспрессировались только в растворимой форме. Исключение составляли усеченные производные FFA1-KD и FFA2-KD, которые экспрессировались как в виде телец включений, так и в растворимой форме. Наилучшим штаммом-продуцентом рекомбинантных фукоиданаз был штамм E.

coli BL21 star (DE3)pLys. Наибольшее содержание целевых рекомбинантных белков для всех исследованных штаммов наблюдалось при температуре культивирования +20 С (рис. 3.13).

FFA2 FFA1 ** **** * *****

–  –  –

** * *** ** *** * Рисунок 3.13 – ДСН ПААГ- электрофорез растворимых (1-6) и нерастворимых фракций (8-13) экстрактов штаммов BL21 star (DE3)pLysS (1, 4, 8, 11), Rosetta-gami (DE3)pLysS (2, 5, 9, 12), BL21 (DE3)GroEL (3, 6, 10, 13) при различных температурах культивирования (1-3, 8-10 – +37 С; 4-6, 11-13 – +20 С), содержащих вектора pColdTev II с вставками нуклеотидных последовательностей, кодирующих FFA1, FFA2, FFA1-SD, FFA2-SD, FFA1-KD, FFA2-KD. (7) – маркеры молекулярных масс белков (кДа) Обе полноразмерные рекомбинантные фукоиданазы и все их усеченные производные катализировали расщепление фукоидана (рис. 3.14). Фукоиданазная активность рекомбинантных ферментов, также как и нативного, проявлялась только в присутствии некоторых ионов двухвалентных металлов. Это дает основание предположить, что фукоиданазы, синтезируемые морской бактерией F. algae, являются металлозависимыми.

Наличие фукоиданазной активности у усеченных производных рекомбинантных фукоиданаз FFA1-SD и FFA2-SD указывает на то, что С-концевой домен, вероятно, не участвует в каталитическом акте.

Фукоиданазы FFA1-KD и FFA2-KD также обладали способностью гидролизовать фукоидан, однако в значительно меньшей степени (рис. 3.14). Возможно, подобная модификация белков приводила к уменьшению способности связываться с молекулами субстрата. Аналогичный результат мог быть получен за счет уменьшения устойчивости молекулы, если кадгериноподобные домены играли стабилизирующую роль [203].

Функция, выполняемая кадгериноподобными доменами, входящими в состав структуры фукоиданаз, остается неизвестной.

Рисунок 3.14 – Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана из F.

evanescens (P) рекомбинантными фукоиданазами FFA1 (1), FFA2 (2), FFA1-SD (3), FFA2-SD (4), FFA1-KD (5) FFA2-KD (6); (Кс) – смесь фукоидана и денатурированных рекомбинантных фукоиданаз (1-6) Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 были очищены до гомогенного состояния по схеме, описанной в разделе 4 («Экспериментальная часть»).

Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на ферментативную активность фукоиданаз FFA1 и FFA2 показало, что наиболее эффективными активаторами для обоих ферментов служили ионы Ca2+ и Ba2+, ионы Mg2+ активировали фукоиданазы в меньшей степени (рис. 3.15). Ионы Co2+ и Mn2+, которые являлись активаторами фукоиданазы FFA2 (рис 3.15 Б), но не активировали FFA1 (рис 3.15 А). Ионы Zn2+ и Cu2+, в отличие от ионов Ca2+ и Ba2+, не активировали фукоиданазы.

Рисунок 3.15 - Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана из F.

evanescens рекомбинантными фукоиданазами FFA1 и FFA2 в присутствии ионов двухвалентных металлов Оптимальными для проявления ферментативной активности фукоиданаз были рН 6,5 – 8 для FFA1, 6,5 – 9 для FFA2.

Специфичность рекомбинантных фукоиданаз была изучена на серии фукоиданов различной структуры (рис. 3.16). Оба фермента с высокой скоростью гидролизовали фукоидан из F. evanescens, цепь которого построена из чередующихся -13- и

-14-связанных остатков сульфатированной фукозы. Фукоиданы из S. cichorioides и содержащие в своем составе только -13-связанные остатки U. pinnatifida, сульфатированной фукозы, ферментативному гидролизу не подвергались.

Рисунок 3.16 – Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоиданов из F.

evanescens (F.e), S. cichorioides (S.c), U. pinnatifida (U.p) рекомбинантными фукоиданазами FFA1 и FFA2. Kс – фукоиданы С помощью рекомбинантной фукоиданазы FFA2 был гидролизован фукоидан из F. evanescens и получены сульфатированные фукоолигосахариды. После завершения ферментолиза и удаления белка высокомолекулярные продукты реакции (ВМФ) отделяли от низкомолекулярных (НМФ) осаждением 75% этанолом. Выход НМФ составил 55%. НМФ разделяли ионообменной хроматографией (рис. 3.17), полученные фракции анализировали при помощи ЯМР-спектроскопии. Выход фракции 1 составил 12,9 % относительно общего содержания сахаров в реакционной смеси. 2D ЯМР спектры фракции содержали четыре кросспика в аномерной области, соответствующие четырем типам остатков -фукопиранозы A, Б, В и Г. Три кросспика на спектрах HMBC фракции 1 позволили определить тип гликозидных (13- или 14-) связей между этими остатками -фукопиранозы: H-1(A)/C-3(Б) при 5,35/73,5 м.д., HБ)/C-4(В) при 5,29/83,8 м.д. и H-1(В)/C-3(Г) при 5,34/73,9 м.д. Анализ спектров HSQC показал наличие сульфатных групп в положении 2 всех остатков фукозы: H-2/C-2 при 4,47/76,6 (А), 4,60/74,7 (Б), 4,49/76,7 (В) и 4,52/74,7 (Г) м.д. Таким образом, основным компонентом фракции 1 является сульфатированный линейный тетрасахарид (рис. 3.18, таблица 3.6).

–  –  –

Б 3)--L-Fucp(2OSO3-)-(1 5,29/100,6 4,60/74,7 4,18/73,5 4,12/70,0 4,41/68,6 1,26/16,5 В 4)--L-Fucp(2OSO3-)-(1 5,34/95,3 4,49/76,7 4,19/69,0 4,00/83,8 4,52/68,9 1,39/16,6 Г 3)--L-Fucp(2OSO3-) 5,49/91,8 4,52/74,7 4,05/73,9 4,08/69,9 4,23/67,1 1,24/16,7

–  –  –

Исследование кинетики накопления продуктов ферментативного гидролиза полисахарида позволяет установить тип и особенности механизма действия ферментов.

При гидролизе ферментами эндо-типа действия происходит резкое падение молекулярной массы полисахарида на начальных стадиях реакции, а конечными продуктами реакции являются олигосахариды с различной степенью полимеризации.

При действии ферментов экзо-типа действия степень полимеризации субстрата меняется незначительно, а основной продукт представлен либо моно- либо олигосахаридом небольшой степени полимеризации.

В свою очередь эндо-ферменты можно условно разделить на две группы:

ферменты, которые гидролизуют полимерный субстрат с образованием высокомолекулярных олигосахаридов; и ферменты, у которых в продуктах гидролиза имеются моносахарид и олигосахариды с небольшой степенью полимеризации.

Следует заметить, что чем сложнее структура полимерного субстрата, тем труднее классифицировать гидролизующий его фермент. Имеются сообщения о полисахарид-гидролазах, которые трудно отнести к определенному типу действия.

Гидролиз фукоидана фукоиданазами (при одинаковой концентрации белков) останавливался спустя 24 ч инкубирования. Дальнейший гидролиз субстрата проходил только при добавлении новых порций ферментов, что свидетельствует о возможном ингибировании фукоиданаз конечными продуктами ферментативной реакции или, что более вероятно, потере активности ферментов при длительном инкубировании.

Анализ кинетики расщепления фукоидана из F. evanescens рекомбинантными фукоиданазами FFA1 и FFA2 с помощью гель-проникающей хроматографии (рис. 3.19), показал значительное уменьшение молекулярной массы фукоидана в течение реакции. В действии двух исследуемых ферментов имеются отличия.

Внутриклеточная фукоиданаза FFA2 катализировала гидролиз фукоидана с большей скоростью:

низкомолекулярные продукты хорошо заметны через 1 ч после начала реакции, в то время как при действии внеклеточной фукоиданазы FFA1 низкомолекулярные продукты надежно детектировались только спустя 3 ч.

При действии ферментов на фукоидан образуется набор сульфатированных фукоолигосахаридов, имеющих различные молекулярные массы. Обе фукоиданазы FFA1 и FFA2 проявили свойства эндо-ферментов. Однако основные продукты гидролиза фукоидана фукоиданазами FFA1 и FFA2 имели различия в молекулярных массах. Так, время удерживания на колонке основного пика продуктов реакции FFA1 составило 36,02 мин (молекулярная масса около 5 кДа), а для FFA2 37,25 мин (молекулярная масса меньше 4 кДа). Сульфатированная фукоза в продуктах в обоих случаях обнаружена не была. Полученные данные свидетельствуют о том, что гидролиз фукоидана фукоиданазой FFA2 проходит с образованием более низкомолекулярных олигосахаридов, по сравнению с FFA1, что вполне согласуется с известными фактами.

Считается, что некоторые внеклеточные ферменты проводят «предварительное»

расщепление крупных молекул субстрата для проникновения их в клетки, а затем полученные фрагменты расщепляются на более мелкие продукты внутриклеточными ферментами.

–  –  –

Рисунок 3.19 – ВЭЖХ продуктов гидролиза, полученных при различном времени инкубирования фукоидана из F.

evanescens и рекомбинантных фукоиданаз FFA1 и FFA2 На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и специфичны к гидролизу О-гликозидных связей в молекуле фукоидана из F. evanescens. Нужно отметить, что свойства и специфичность фукоиданазы FFA2 близки свойствам нативной фукоиданазы (FFA), выделенной из клеточного экстракта F. algae.

3.3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp.

Фукоиданаза была выделена из печени морского брюхоногого моллюска Lambis sp.

Экстракт печени моллюска содержал большое количество ферментов, катализирующих гидролиз поли- и олигосахаридов (таблица 3.7).

Схема выделения фукоиданазы из Lambis sp. включала 7 стадий очистки с применением классических методов хроматографии белков (таблица 3.8). Гомогенная фукоиданаза была выделена с выходом 0,75 %. По результатам ДСН-ПААГ электрофореза молекулярная масса фукоиданазы составила 50±1 кДа (рис. 3.20).

–  –  –

В качестве субстрата применяли высокоочищеный фукоидан из бурой водоросли F. evanescens. Для регистрации ферментативной активности использовали методы Нельсона [81] и электрофореза.

Были изучены основные каталитические свойства фермента. Оптимальными условиями для проявления ферментативной активности фукоиданазы были рН 5,0 (рис. 3.21) и температура 45 С (рис. 3.22), что характерно для ферментов из беспозвоночных [73].

Активность, %

–  –  –

Известно, что активность некоторых ферментов зависит от наличия в инкубационной смеси катионов двухвалентных металлов [139; 204; 205]. Фукоиданаза из Lambis sp. увеличивала свою активность в присутствии ионов Ca2+ и Ba2+, ионы Мg2+ не влияли на активность фермента, а ионы Cu2+, Zn2+ и Hg2+ оказывали ингибирующее действие (таблица 3.9). Вероятно, ионы металлов не входят в активный центр фукоиданазы, поскольку добавление в раствор фермента натриевой соли ЭДТА не влияло на уровень её активности.

–  –  –

Кинетика накопления низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза фукоидана из F. evanescens была изучена при помощи электрофореза в ПААГ.

Образование сульфатированных олигосахаридов наблюдалось на электрофореграмме спустя 30 мин инкубирования реакционной смеси, максимальный выход продуктов ферментативного гидролиза фукоидана наблюдался через 48 ч (рис. 3.24).

Рисунок 3.24 - Кинетика гидролиза фукоидана из F.

evanescens фукоиданазой из печени Lambis sp. Кс – фукоидан Специфичность действия фукоиданазы была изучена с использованием фукоиданов различной структуры, а также их химических производных. Было показано, что фукоиданаза расщепляла фукоиданы из F. evanescens и F. vesiculosus, содержащие и -14-связанные остатки сульфатированной -L-фукопиранозы. Фукоидан из S. cichorioides, который состоял из -13-связанных остатков сульфатированной Lфукопиранозы, не подвергался ферментативному гидролизу. По всей видимости, фукоиданаза специфична к расщеплению -14-О-гликозидных связей в молекулах фукоиданов (рис. 3.25). Дезацетилированные и десульфатированные производные фукоидана из F. evanescens подвергались ферментативному гидролизу с большей скоростью по сравнению с исходным фукоиданом (таблица 3.10). По-видимому, наличие объемных заместителей при остатках фукозы в молекуле фукоидана уменьшает количество доступных для расщепления участков и вероятность образования продуктивного фермент-субстратного комплекса. С более низкой скоростью фермент гидролизовал фукоидан из F. vesiculosus по сравнению с фукоиданом из F. evanescens, что может быть связано с различиями в их структурах, например, с расположением сульфатных групп или других заместителей. [34; 35]. Другая причина - наличие в составе коммерческого препарата фукоидана из F. vesiculosus фирмы «Sigma» примесей анионных полисахаридов различной структуры [8], часть из которых, по-видимому, не подвергается ферментативному гидролизу.

Рисунок 3.25 – Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоиданов (Р) из F.

evanescens (F.e, FdAc – дезацетилированное производное), S. cichorioides (S.c), F.

vesiculosus (F.v) фукоиданазой из печени Lambis sp. Кс – фукоиданы

–  –  –

Для подтверждения специфичности выделенного фермента к

-14-О-гликозидным связям и для установления типа действия фукоиданазы были получены и выделены продукты ферментативного гидролиза фукоидана. Схема получения низкомолекулярных продуктов гидролиза фукоидана показана на рисунке 3.26.

–  –  –

Анализ суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза (НМФ), полученной после осаждения высокомолекулярных продуктов ферментолиза (ВМФ) 75 % раствором спирта в воде, проводили при помощи ЯМР-спектроскопии. Выход НМФ составил 73 %. Был проведен анализ Н-ЯМР спектров исходного фукоидана и суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза (НМФ) (рис. 3.27). Сравнение интегральной интенсивности сигналов при 1,24-1,32 и 1,38-1,41 м. д., соответствующих протонам при Н-6 -13- и

-14-связанных остатков фукозы, показало, что соотношение -13- и -14-связей в суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза составило 2:1 (рис. 3.27 А и Б). Соотношение этих типов связей в исходном фукоидане было практически равным. Таким образом, уменьшение количества -14-связей говорит об их расщеплении, а отсутствие сульфатов в 4 положении при -13связанных остатках фукозы в НМФ позволяет заключить, что расщепление идет внутри повторяющегося структурного фрагмента [3--L-Fucp(2OSO3-)-14--L-Fucp(2OSO3молекулы фукоидана.

–  –  –

В Рисунок 3.27 - 1H ЯМР спектры фукоидана и продуктов его ферментативного гидролиза фукоиданазой из Lambis sp. (А) – Спектр НМФ ферментативнго гидролиза фукоидана;

(Б) - увеличенная область спектра НМФ ферментативного гидролиза фукоидана;

(В) - спектр фкоидана;( ) - сигнал соответствующий протонам фрагмента структуры 3--L-Fucp(2,4OSO3-)-1; ( ) - область сигналов соответствующая протонам фрагмента структуры 4--L-Fucp(2OSO3-)-1; ( ) - область сигналов соответствующая протонам фрагмента структуры 3--L-Fucp(2OSO3-)-1

–  –  –

Рисунок 3.28 - Анионообменная хроматография НМФ на колонке с носителем DEAE-MacroPrep Ни С ЯМР спектры фракций 3, 4 и 5 имели достаточное разрешение для детального изучения структуры олигосахаридов, входящих в их состав.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Федеральное агентство по образованию Ивановский государственный университет Ивановский государственный химико-технологический университет Северо-западная академия государственной службы: Ивановский филиал Актуальные проблемы современной когнитивной науки Ма...»

«Совык Дмитрий Николаевич Плазмохимический синтез трёхмерных структур из алмаза методом реплики 01.04.07 – “Физика конденсированного состояния” Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Мос...»

«1 Московский государственный университет геодезии и картографии МИИГАиК Кафедра высшей геодезии Шануров Геннадий Анатольевич Атмосфера и ее влияние на результаты измерения расстояний Учебное пособие по курсам «Высшая геодезия», «Геотроника» и «Физика Земли и атмосферы» для студе...»

«Рис.3. Распределения изолиний,, и объёмных долей фаз при наличии разрыва в 3.5м. Список информационных источников 1. Гришин A.M. Математические модели лесных пожаров и новые способы борьбы с ними. -Новосибирск: Наука, 1992. –408 с.2. Перминов В.А. Математическое моделирование возникновения...»

«ХИМИЯ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, — 1993 — № 7 — С. 937 —961 Е. В. Бабаев МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДИЗАЙН ГЕТЕРОЦИКЛОВ* 2**. МАГИЧЕСКИЕ ПРАВИЛА «СТРУКТУРА—СИНТЕЗ» В СИНТЕЗЕ ШЕСТИЧЛЕННЫХ ГЕТЕРОАРОМАТИЧЕСКИХ ЯДЕР (ОБЗОР) Проведен обзор частоты встречаемости разных типов реа...»

«© 2005 г. Г.И. КОЗЫРЕВ СОЦИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ, ПОВЕДЕНИЕ И СОЦИАЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ КОЗЫРЕВ Геннадий Иванович кандидат социологических наук, доцент кафедры социологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева. Понятия, вынесенные в заголовок статьи, фундаментальные для современной...»

«Габбасов Рауль Рамилевич Исследование магнитной динамики ансамблей наночастиц в среде методом мессбауэровской спектроскопии Специальность 01.04.07 – Физика конденсированного состояния Автореферат на соискание ученой степени кандидата физ...»

«Математические шахматы. 4 класс Клетка 1 Из пункта А в пункт N ведут несколько дорог. Стоимость проезда между соседними пунктами отмечена на схеме. Посчитайте, какой может быть наименьшая стоимость проезда из пунк...»

«WWW.MEDLINE.RU ТОМ10, БИОХИМИЯ, ЯНВАРЬ 2009 ОРИГИНАЛЬНЫЙ ЦИТО-БИО-ХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ РАЗЛИЧИЙ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА ПО КОМПЛЕКСНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКЕ (ПАТТЕРНУ) АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ* М.Н. Кондрашова, Н.В. Хундерякова, М.В. Захарченко mkondrashova23@inbox.ru Институт теоретической и эк...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Уральский государственный университет им. А.М. Горького» Физический факультет Кафедра общей и молекулярной физики УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Основы анатомии и физиологии человека ЭКЗАМЕН...»

«Бейрахова Ксения Андреевна Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом специальность 02.00.10 биоорганическая химия Автор...»

«Сергиенко П.Я. ТОПОЛОГИЯ ТОРСИОННОГО ПРОСТРАНСТВА И ЕЕ МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ В начале нашего века проявился огромный интерес к теореме А.Пуанкаре в связи с отказом Г.Я.Перельмана от...»

«Компенсация сахарного диабета с точки зрения физика. Ицхак Чайковский, Кафедра математики, Университет “Бен-Гурион”, Беер-Шева, Негев, Израиль. chaik@cs.bgu.ac.il Вся человеческая жизнь связана с затратой энергии, основным источником которой в человеческом организме являютс...»

«Геология и геофизика, 2014, т. 55, № 5—6, с. 1001—1010 УДК 550.832+552.08:53 Моделирование и инверсия данных электроМагнитного каротажа с использованиеМ петрофизических Моделей электропроводности в.н. глинских1,2, г.в. нестерова1, М.и. эпов1,2 Институт нефтегазовой геологии и геофизики им. А.А. Трофимука...»

«Майдыковский Антон Игоревич ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСТРУКТУР И ГРАНИЦ РАЗДЕЛА МЕТОДОМ ГЕНЕРАЦИИ ВТОРОЙ ОПТИЧЕСКОЙ ГАРМОНИКИ Специальность 01.04.05 оптика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физи...»

«Задорина Екатерина Алексеевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ГЕОСТАТИСТИЧЕСКОЙ ИНВЕРСИИ ДЛЯ ПРОГНОЗА КОЛЛЕКТОРСКИХ СВОЙСТВ ПО ДАННЫМ СЕЙСМОРАЗВЕДКИ 25.00.10 – Геофизика, геофизические методы поисков полезных ископаемых Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный р...»

«УДК 681.3:378.146 Н.О. РИЗУН, канд. техн. наук, доц., Днепропетровский университет имени А. Нобеля, Днепропетровск ТЕСТИРУЕМЫЙ КАК ПОДСИСТЕМА ЗАМКНУТОГО КОНТУРА РЕГУЛИРОВАНИЯ Обоснованы вид и содержание параметров математической модели тестируемого как подсистемы замкнутого...»

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова ГЕОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра кристаллографии и кристаллохимии Протасов Николай Михайлович Курсовая работа Структурное моделирование сложных окси...»

«Ключи к олимпиадным заданиям заключительного этапа Межрегиональной химической олимпиады школьников имени академика П.Д. Саркисова 9 класс Вариант № 9-1 Максимальная оценка за каждое задание – 10 баллов. При п...»

«http://www.izdatgeo.ru Геология и геофизика, 2009, т. 50, № 3, с. 258—265 УДК 550.93+552.3+553.411 ЗОЛОТО-ПОЛИМЕТАЛЛИЧЕСКОЕ МЕСТОРОЖДЕНИЕ БЕРЕЗИТОВОЕ (Восточная Сибирь): ОСНОВНЫЕ МИНЕРАЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ВОЗРАСТ И СВЯЗЬ С МАГМАТИЗМОМ А.В. Мельников, А.А. Сорокин, В.А. Пономарчук*, А.В. Травин*, А.П. Сор...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Отделение наук о Земле Институт геохимии и аналитической химии им. В. И. Вернадского Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, химический факультет 6-я Всероссийская конференция Молекулярное моделирование 8-10 апреля 2009 г. Москва, 2009 г. ОРГКОМИТЕТ 6-й Всероссийской конференци...»

«Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова Химический факультет Т.В. Богдан КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ СТРУКТУРЫ ПРОСТЫХ ВЕЩЕСТВ–НЕМЕТАЛЛОВ Учебно-методическое пособие к общему курсу «Кристаллохимия» Баку 2015 В пособии рассмотрено строение кристаллических модификаций простых вещес...»

«Приложение 1 Утверждена приказом ректора ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России от 30 сентября 2016 года №2163 Программа по химии Содержание программы соответствует стандарту основного общего образования по химии, обяз...»

«Школа трёх мудрецов Михаил Баландин michael.balandin@live.ru Многие подборки интересных математических задач составлены так, что их содержимое объединено общим сюжетом. Вот и я решил попробовать себя в этом жанре. Всё началось с четырёх за...»







 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.