WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«КОМПЛЕКСЫ АНТИТЕЛ С НАНОДИСПЕРСНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ: СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ ...»

На правах рукописи

Таранова Надежда Алексеевна

КОМПЛЕКСЫ АНТИТЕЛ С НАНОДИСПЕРСНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ:

СИНТЕЗ, СВОЙСТВА

И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ

Специальность 03.01.04 Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата химических наук

– 2014

..

,

:

:,,

–  –  –

,..

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.1 Интенсивное развитие нанотехнологий, разработка новых методов получения наночастиц различной химической природы обусловливают интерес к их применению в качестве реагентов для in vivo и in vitro биохимических исследований. Научная активность, связанная с различными аспектами применения наночастиц в биологии, непрерывно растет. По данным «Web of Science», количество статей по этой проблематике на протяжении последнего десятилетия выросло в 20 раз, что подтверждает востребованность проводимых исследований.

Большая удельная поверхность наночастиц позволяет получать на их основе конъюгаты с высоким содержанием биомолекул, проводить быстрые взаимодействия в растворе с последующим отделением образовавшихся комплексов от непрореагировавших соединений.



Особый интерес представляют наночастицы как реагенты для биохимических методов анализа, что обусловлено возможностью их высокочувствительного детектирования на основании оптических, электрических, магнитных или иных свойств, а также зависимостью свойств наночастиц от размеров, позволяющей проводить одновременное выявление нескольких соединений. Применение наночастиц в качестве носителей и маркеров обеспечивает простоту детекции, достижение низких пределов обнаружения и ускорение специфических взаимодействий, лимитирующих продолжительность анализа.

Несмотря на большое число получаемых и характеризуемых препаратов наночастиц, лишь немногие из них используются в биохимических методах анализа. При этом выбор наночастиц продолжает оставаться в значительной степени эмпирическим. Остается неясным, какие (по размерам и поверхностным свойствам) препараты наночастиц оптимальны для использования в анализе, какой состав конъюгатов наночастица – биорецепторная молекула обеспечивает минимальный предел обнаружения, при каких способах получения данных Используемые сокращения и обозначения: АТ – антитела; БСА – бычий сывороточный альбумин; ДРС – динамическое рассеяние света; ИФА – иммуноферментный анализ; ИХА – иммунохроматографический анализ; КвТ – квантовые точки; КвТNNN – квантовые точки с пиком эмиссии при длине волны NNN нм; КЗ – коллоидное золото;

ОВА – овальбумин; ОФЛ – офлоксацин; ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия; СИТ – соевый ингибитор трипсина; СТМ – стрептомицин; ХФ – хлорамфеникол; EDC – гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимид (N-(3dimethylamino-propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride); IgE – иммуноглобулин Е; IgG

– иммуноглобулин G; sulfo-NHS – сульфо-N-гидроксисукцинимид натрия (sulfo-Nhydroxysuccinimide); кв – квантовый выход флуоресценции.

конъюгатов функциональные свойства их компонентов сохраняются в максимальной степени, как влияет выбор наночастиц-маркеров на режим формирования детектируемых комплексов. Решение этих вопросов существенно повысит эффективность применения наночастиц в биохимических исследованиях.



Приведенные данные свидетельствуют о том, что нанодисперсные частицы являются перспективными реагентами для исследования биохимических взаимодействий и создания новых биоаналитических систем, а изучение свойств конъюгатов наночастиц с биомолекулами представляет собой крайне актуальную задачу.

Цель диссертационной работы заключалась в изучении свойств комплексов антител с нанодисперсными маркерами разной природы и применении полученных реагентов для разработки новых иммунохроматографических тестсистем.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования:

1) охарактеризовать размерные и оптические свойства конъюгатов антител с наномаркерами разной природы,

2) определить и сопоставить кинетические и равновесные константы взаимодействия с антигеном конъюгата антитело–флуоресцентный маркер (квантовая точка) и немодифицированных антител,

3) изучить закономерности взаимодействия иммунореагентов, меченных нанодисперсными маркерами, в иммунохроматографических тест-системах с фото- и флуориметрической детекцией и провести сравнительную оценку этих тест-систем,

4) разработать иммунохроматографические тест-системы с одним и несколькими флуоресцентными нанодисперсными маркерами и определить их аналитические параметры,

5) охарактеризовать возможности повышения информативности иммунохроматографии посредством проведения мультиплексного анализа с двумерно упорядоченным массивом зон связывания разной специфичности.

Научная новизна работы.

Изучена степень сохранения функциональных свойств компонентами конъюгатов квантовые точки – антитела. Показано сохранение конъюгатами от 70 до 97% интенсивности флуоресценции. Проведена сравнительная характеристика взаимодействия с антигеном свободных и конъюгированных с квантовыми точками моноклональных антител к антибиотику хлорамфениколу. Показан рост кинетических и равновесных констант связывания антител в составе конъюгатов.

Охарактеризована взаимосвязь между пределами детекции нанодисперсных маркеров – коллоидного золота и квантовых точек – в гомогенных и гетерогенных системах и минимальными концентрациями аналитов, определяемыми с помощью иммунохимических тест-систем на основе этих маркеров.

Практическая значимость работы.

Показано, что использование флуоресцентного маркера, квантовых точек, обеспечивает снижение предела детекции мембранного иммуноанализа в 24 раза по сравнению с колориметрическим маркером, коллоидным золотом.

Разработаны и апробированы иммунохроматографические тест-системы на основе квантовых точек для определения содержания антибиотика хлорамфеникола в молоке и иммуноглобулина Е в сыворотке крови человека. Показана возможность количественного определения аналитов при регистрации флуоресценции с помощью портативного детектора. Проведена метрологическая характеристика разработанных тест-систем.

Предложен формат мультиплексного иммунохроматографического анализа с использованием в качестве маркеров квантовых точек с разными спектрами эмиссии. На основании данного подхода реализована тест-система для одновременного контроля содержания трех антибиотиков разных классов по исчезновению красной, желтой или зеленой аналитической линии.

Предложен формат мультиплексного иммунохроматографического анализа, основанный на формировании на мембране упорядоченного двумерного массива зон связывания с реагентами разной специфичности. На основании данного подхода разработана тест-система для одновременного контроля содержания психоактивных веществ разных классов.

Положения, выносимые на защиту.

1) Установлена высокая степень сохранения интенсивности флуоресценции квантовыми точками (ядро CdSe / оболочка ZnS) разного размера в составе конъюгатов с антителами.

2) На модели взаимодействия с хлорамфениколом количественно установлено сохранение антигенсвязывающих свойств антителами, ковалентно иммобилизованными на поверхности квантовых точек.

3) Показаны преимущества квантовых точек по сравнению с наночастицами коллоидного золота при использовании в иммунохроматографии в качестве маркеров для антител.

4) Разработана иммунохроматографическая тест-система, основанная на применении квантовых точек, для определения уровня иммуноглобулина Е в сыворотке крови человека.

5) Предложено использование квантовых точек с разными спектрами эмиссии для иммунохроматографического определения трех соединений по исчезновению красной, желтой или зеленой аналитической линии (тест-система «светофор»).

6) Предложен способ проведения мультиплексного иммунохроматографического анализа, основанный на формировании аналитической зоны в виде двумерного массива точек с реагентами разной специфичности.

Связь работы с государственными программами.

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы».

Личный вклад диссертанта. Диссертантом проведена основная часть экспериментальных работ, представленных в диссертации, обработка полученных данных, подготовка материала к публикациям.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих мероприятиях: научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва–Пущино, 2011); V международный симпозиум «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2011); IV международный форум RUSNANOTECH (Москва, 2011); 2-ая международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах.

Безопасность и наномедицина» (Московская область, 2011); Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012); VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013); Второй съезд аналитиков России (Москва, 2013), I Международная научно-практическая конференция «Современная химико-токсикологическая экспертиза» (Москва, 2013), VII международный симпозиум «Hormone and veterinary drug residue analysis»

(Гент, Бельгия, 2014).

Диссертационная работа представлена 28 мая 2014 г. на межлабораторном семинаре Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 9 тезисов в материалах отечественных и международных конференций.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, перечня публикаций по теме диссертации, выводов и списка литературы (290 источников). Работа изложена на 206 страницах машинописного текста, содержит 79 рисунков и 25 таблиц.

В первой главе представлен анализ литературных данных о принципах современных иммунохимических тест-методов. Охарактеризованы многообразие и свойства используемых в иммуноанализе нанодисперсных маркеров.

Описаны возможности реализации мультиплексных иммунохимических тестсистем. Рассмотрены математические модели иммунохимических взаимодействий, протекающих в тест-системах.

Во второй главе приведены сведения о реагентах, материалах и оборудовании, используемых в работе. Изложены методики синтеза конъюгатов наночастица–антитело и гаптен–белок, изготовления иммунохроматографических тест-систем. Описаны методы, использованные для характеристики изучаемых объектов: просвечивающая электронная микроскопия, регистрация динамического рассеяния света, поверхностного плазмонного резонанса, твердофазный иммуноферментный анализ, фото- и флуориметрические методы.

В третьей главе представлены результаты и интерпретация экспериментов по получению и характеристике конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами и их применению в иммунохроматографии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами Для получения конъюгатов квантовых точек (КвТ) с антителами (АТ) использовали метод активированных эфиров (карбодиимидно–сукцинимидный), формируя амидные связи между аминогруппами лизина в составе антител и карбоксильными группами полимерного покрытия КвТ. С учетом того, что на поверхности одной частицы КвТ находится около 100 карбоксильных групп, мольное соотношение реагентов КвТ : IgG : EDC : sulfo-NHS при синтезах конъюгатов составляло 1 : 10 : 400 : 400 (для применения в «сэндвич»-формате анализа) или 1 : 2 : 200 : 200 (для конкурентного формата анализа). Избыток активаторов удаляли, концентрируя конъюгат с одновременным диализом с помощью микроцентрифужных пробирок Amicon Ultracel 100K. Для очистки конъюгата от непрореагировавших антител использовали гель-фильтрацию на колонке с Sephadex G-100.

Наночастицы коллоидного золота (КЗ) получали восстановлением золотохлористоводородной кислоты и конъюгировали с моноклональными антителами методом адсорбции. Выбор концентраций антител для конъюгирования с КЗ проводили на основании полученных флоккуляционных кривых. Установленная оптимальная концентрация АТ/ХФ составила 8 мкг/мл;

АТ/IgE – 20 мкг/мл.

Сравнительная характеристика маркеров и их конъюгатов Характеристика размерных свойств наночастиц и их конъюгатов. Размеры КвТ, КЗ и их конъюгатов с антителами определяли с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и динамического рассеяния света (ДРС). Анализ электронных микрофотографий показал, что конъюгированные с антителами КвТ не агрегируют, сохраняя дисперсное состояние (рис. 1). Средний диаметр неконъюгированных КвТ (препарат со спектральным максимумом эмиссии при 625 нм – КвТ625) составил 8,9±0,1 нм, частицы конъюгата КвТ характеризуются средним диаметром 10,5±0,1 нм. Средний диаметр немодифицированных частиц КЗ – 29,3±0,5 нм, КЗ с иммобилизованными антителами

– 30,4±0,5 нм. (При определении размеров наночастиц и их конъюгатов размеры выборок составляли от 139 до 178 частиц.) А Б Рис. 1. Электронные микрофотографии конъюгатов антител против IgE с КвТ625 (А) и с КЗ (Б) Препараты наночастиц и их конъюгатов охарактеризовали также методом регистрации ДРС. Средние значения гидродинамических радиусов неконъюгированной формы КвТ, конъюгатов КвТ с антителами против ХФ и с антителами против IgE человека (соотношения КвТ:АТ при синтезе – 1:2 и 1:10) составляют 14,3±0,6, 14,9±0,5 и 22,4±0,4 нм, соответственно. Средний гидродинамический радиус для неконъюгированной формы КЗ – 26,2±0,4 нм, конъюгата КЗ с антителами против ХФ – 28,3±0,6 нм.

Отличия размеров наночастиц, установленных методами ПЭМ и ДРС, обусловлены действием двух факторов. Во-первых, ПЭМ регистрирует только электронно плотные структуры, т.е. металлическую составляющую наночастиц.

Соответственно из рассмотрения исключаются полимерное покрытие КвТ и слой цитрата на поверхности КЗ. При переходе к ДРС эти покрытия включаются в учитываемые размеры частиц. Во-вторых, регистрируемый гидродинамический радиус может быть больше, чем радиус самой частицы, из-за структурированных и вращающихся вместе с частицей слоев, образованных компонентами раствора – слоев воды (гидродинамической оболочки) и/или – для заряженных частиц – адсорбированных ионов вместе с их гидратными оболочками.

Малые стандартные отклонения регистрируемых размеров наночастиц (не более 4%) свидетельствуют о гомогенности исследуемых препаратов, отсутствии агрегатов, а также примесей (за исключением минорной фракции, выявляемой методом регистрации ДРС в препаратах КЗ и его конъюгатов).

Характеристика спектральных свойств КвТ и их конъюгатов. Были зарегистрированы спектры поглощения и флуоресценции растворов свободных КвТ.

Совпадение положения пиков поглощения – 475 и 610 нм – для конъюгата КвТ–АТ/IgE и свободных КвТ отражает стабильность наночастиц в конъюгате.

Спектры флуоресценции свободных квантовых точек и их конъюгатов с антителами представлены на рис. 2.

–  –  –

Пики флуоресценции конъюгатов КвТ с антителами против антибиотиков стрептомицина (СТМ), хлорамфеникола (ХФ) и офлоксацина (ОФЛ) (КвТ525– АТ/СТМ, КвТ 585–АТ/ХФ, КвТ625–АТ/ОФЛ, отношение компонентов при синтезе – 1:2) наблюдаются при 623±2, 589±3 и 525±1 нм, соответственно, что достоверно не отличается от положения пиков флуоресценции свободных КвТ – 625, 585 и 525 нм.

Определены относительные квантовые выходы флуоресценции (кв) немодифицированных КвТ и их конъюгатов с антителами против антибиотиков.

Из полученных результатов (табл. 1) следует, что после ковалентной иммобилизации антител на поверхности КвТ квантовые выходы снижаются на 3–17% относительно немодифицированных КвТ.

–  –  –

Поскольку связывание антител привело к снижению флуоресценции маркера, дополнительным фактором риска для аналитического применения КвТ являлась степень сохранения ими способности к флуоресценции при увеличении числа молекул антител, иммобилизуемых на одной наночастице. Экспериментально установлено, что квантовый выход флуоресценции конъюгата КвТ625 с антителами, синтезированного при мольном соотношении 1:10, составляет 0,60, что ниже, чем при 1:2, но сопоставимо с кв органических флуорофоров. Таким образом, негативное влияние на интенсивность флуоресценции КвТ, оказываемое иммобилизованными молекулами антител, возрастает с увеличением их содержания в конъюгате. Однако это влияние не критично для использования конъюгатов в аналитических целях.

Пределы детекции нанодисперсных маркеров. Существенным фактором, влияющим на возможность использования наночастиц в качестве маркеров, является минимальное детектируемое количество наночастиц. В рамках характеристики изучаемых маркеров были экспериментально сопоставлены пределы детекции КЗ и КвТ, нанесенных на поверхность мембраны (Millipore

180) и находящихся в растворе. Установлено, что минимальная концентрация КвТ, детектируемая при нанесении на мембрану, равна 0,02 нМ. Для КЗ соответствующая величина составляет 0,15 нМ. В таблице 2 даны пределы детекции наночастиц, представленные в виде их количества на единицу площади мембраны или объема раствора.

–  –  –

Как следует из полученных характеристик, в мембранной системе предел детекции КвТ в 9 раз ниже предела детекции КЗ. Минимальное количество КвТ, детектируемое на поверхности мембраны площадью 1 мм2, в 24 раз больше минимального количества частиц, детектируемого в растворе объемом 1 мкл.

В случае КЗ (для тех же объемов) предел детекции частиц на мембране в 17 раз выше минимального количества частиц, выявляемого в растворе.

Значительные различия пределов детекции наночастиц в двух системах объясняются, во-первых, использованием более чувствительных оптических средств регистрации при работе с растворами. Во-вторых, при работе с мембранными носителями детекция сигнала (поглощения или флуоресценции) возможна только с приповерхностного слоя.

Характеристика состава конъюгатов антител с нанодисперсными маркерами. Для определения состава конъюгатов антитело–наночастица был реализован способ, включающий гель-фильтрационную очистку конъюгата и иммуноферментное определение количества иммунохимически активных антител в составе конъюгата. Исследование проводили на примере конъюгата КвТ625–АТ/ХФ, синтезированного с исходным мольным соотношением реагентов 1:2.

Эксперимент включал получение градуировочной зависимости оптической плотности от концентрации нативных антител и определение с ее помощью титра конъюгата. Далее вычисляли концентрации иммунохимически активных антител и рассчитывали их содержание в препарате конъюгата.

Установлено, что препарат конъюгата с концентрацией (по КвТ) 4,5 мкМ содержит 8,4±0,5 мкМ иммобилизованных антител. Мольное соотношение КвТ : АТ в конъюгате равняется 1:1,9 и практически не отличается от исходного соотношения 1:2 при синтезе конъюгата. Наблюдаемое совпадение является дополнительным свидетельством в пользу метода, примененного для характеристики состава конъюгатов, подтверждая отсутствие влияния на получаемые результаты ориентации иммобилизованных антител.

Определение антигенсвязывающей способности антител в конъюгате с КвТ. Возможность использования синтезированных конъюгатов зависит не только от их оптических свойств, но и от сохранения антителами, иммобилизованными на поверхности наночастиц, способности взаимодействовать с антигеном. Для характеристики этого параметра с помощью биосенсорной системы BIAcore X были измерены и сопоставлены константы связывания нативных и конъюгированных антител с конъюгатом гаптен–белок (хлорамфеникол – бычий сывороточный альбумин (ХФ–БСА)), иммобилизованным на поверхности сенсорного чипа. В качестве контроля использовали дорожку чипа с иммобилизованным белком-носителем (БСА).

В ячейку чипа вводили либо антитела против ХФ, либо конъюгат КвТ 625– АТ/ХФ, получая сенсограммы – зависимости от времени оптического сигнала сенсора, отражающего изменения поверхностного плазмонного резонанса плоскости чипа и пропорционального количеству связанного реагента. Для определения констант использовали растворы антител и конъюгата в диапазоне концентраций от 26 до 400 нМ. На рис. 2 представлены сенсограммы, полученные для конъюгата КвТ625–АТ/ХФ.

Рис. 2. Сенсограммы взаимодействия конъюгата КвТ 625–АТ/ХФ (состава 1:2) с иммобилизованным на поверхности чипа СМ5 антигеном (ХФ–БСА), полученные для разных концентраций антител (1 – введение конъюгата в канал чипа; 2 – выход непрореагировавшего конъюгата из канала чипа; 3 – введение регенерирующего раствора, pH 1,5). Молярные концентрации конъюгата КвТ 625–АТ/ХФ представлены в соответствии с содержанием антител По полученным сенсограммам вычисляли константы реакций образования и диссоциации комплексов антиген–антитело и антиген–(антитело–КвТ). Расчеты проводили с помощью программы BIAevaluation. Значения кинетических и равновесных констант усредняли внутри каждой группы повторных экспериментов (n=3) и между разными концентрациями антител (конъюгата) в выбранном диапазоне. В табл. 3 приведены вычисленные значения констант.

Таблица 3. Кинетические и равновесные константы связывания и диссоциации иммунных комплексов для свободных АТ/ХФ и конъюгата КвТ–АТ/ХФ ka (1/M c) kd (1/c) КA (1/M) КD (M) АТ/ХФ (7,5±0,1)·104 (3,9±0,2)·10-4 (2,2±0,1)·108 (4,7±0,3)·10-9 (5,4±0,5)·104 (7,2±0,6)·10-5 (7,4±0,2)·108 (1,3±0,5)·10-9 КвТ625–АТ/ХФ (1:2) Полученные значения кинетических и равновесных констант образования комплексов АТ – антиген и КвТ–АТ – антиген сопоставимы, что свидетельствует о сохранении функциональной активности антителами, ковалентно иммобилизованными на поверхности КвТ.

Трехкратное увеличение равновесной константы связывания конъюгата относительно свободных антител (7,4·108 и 2,2·108 1/М) может быть вызвано поливалентностью конъюгата.

Разработка монопараметрических иммунохроматографических тестсистем с использованием квантовых точек В качестве детектируемых антигенов было выбрано низкомолекулярное соединение – антибиотик хлорамфеникол и высокомолекулярный иммуноглобулин Е человека. Синтезированы конъюгаты КвТ (максимум эмиссии при 625 нм) с антителами против этих соединений, а также конъюгат колориметрического маркера, КЗ–АТ/ХФ, применяемый в референсной тест-системе.

Реализовано три варианта иммунохроматографических тест-систем:

– с использованием КвТ для определения ХФ в молоке;

– с использованием КвТ для определения IgE в сыворотке крови;

– с использованием КЗ для определения ХФ в молоке.

Разработка иммунохроматографической тест-системы с использованием КвТ для определения хлорамфеникола в молоке. Хлорамфеникол – антибиотик из группы амфениколов, в настоящее время запрещенный для использования в ветеринарии и медицине из-за выраженного негативного действия на ряд физиологических процессов. Однако риски несанкционированного применения ХФ обуславливают необходимость его мониторинга и включение в нормативы безопасности пищевой продукции.

В связи с тем, что ХФ иммунохимически моновалентен, его иммунодетекция возможна только в конкурентных форматах. Нами был разработан иммунохроматографический анализ, при котором за связывание с конъюгатом маркер– антитело конкурируют свободный антиген, содержащийся в тестируемой пробе, и иммобилизованный на мембране конъюгат производного антигена (гаптена) с белковым носителем.

Содержание ХФ в пробе определяли по флуоресценции в аналитической зоне тест-полоски, отражающей конкурентное связывание антигена с антителами, конъюгированными с КвТ. Результаты анализа оценивали визуально, облучая тест-полоску с помощью ультрафиолетовой лампы. Как видно из рис. 3, с ростом концентрации аналита в пробе интенсивность флуоресценции в аналитической зоне постепенно снижается до полного исчезновения, что соответствует принципу конкурентного анализа. Предел детекции ХФ при визуальной оценке результатов тестирования по наличию или отсутствию свечения составляет 1,0 нг/мл.

<

–  –  –

Количественную оценку результатов проводили с помощью портативного флуориметрического детектора «Рефлеком-УФ» («Синтэко-Комплекс», Россия) со встроенной программой обработки изображений. Установлено, что регистрируемая интенсивность флуоресценции в аналитической зоне достигает максимума через 10 минут после начала движения пробы вдоль мембран тестполоски. По результатам измерений, проведенных для проб с различным содержанием ХФ (n=10), построена градуировочная кривая (рис. 4).

–  –  –

Установлены аналитические характеристики тест-системы. Предел обнаружения ХФ составляет 0,2 нг/мл, рабочий диапазон количественного определения содержания ХФ – 0,3–20 нг/мл. Для этого диапазона стандартное отклонение измеренных значений концентрации ХФ не превышает 7,4%, что свидетельствует о высокой воспроизводимости результатов анализа. Длительность анализа – 10 минут.

Тест-система была апробирована для контроля ХФ в пробах молока (жирность 3,2%). Пробы контаминировали антибиотиком в разных концентрациях и характеризовали полноту его выявления с помощью тест-системы (метод добавок). Установлено, что полнота выявления ХФ с помощью разработанной тест-системы варьирует от 93,3 до 110%, а стандартные отклонения измеренных значений концентраций ХФ не превышают 10%. В соответствии с нормативами Таможенного Союза содержание ХФ в молоке и молочных продуктах не должно превосходить 10 нг/мл, что позволяет использовать данную тест-систему для экспрессного определения следовых количеств ХФ.

Сравнение тест-систем с колориметической и флуоресцентной детекцией.

Для оценки возможностей квантовых точек как маркера для иммунохроматографии принципиальное значение имеет сравнительная характеристика тест-систем, реализованных с использованием одних и тех же иммунореагентов, но разных маркеров – квантовых точек и традиционного маркера, коллоидного золота. Данное сопоставление было проведено на примере тест-систем для определения ХФ в молоке.

Иммунохроматографический анализ ХФ с использованием КЗ характеризуется пределом обнаружения 4,8 нг/мл и рабочим диапазоном 8,7–214 нг/мл.

Сравнение свидетельствует о том, что КвТ позволяют существенно (в 24 раза) снизить предел обнаружения ХФ, принципиально не изменяя методику проведения анализа. Наблюдаемое отличие тест-систем объясняется двумя факторами. Во-первых (см. стр. 8 автореферата), предел детекции КвТ в 9 раз ниже предела детекции КЗ. Во-вторых, в конкурентном формате иммуноанализа значительное влияние на минимальное определяемое количество аналита оказывает количество антител, иммобилизованных на поверхности маркера. При ковалентной иммобилизации антител на поверхности КвТ их количество не превышало двух, тогда как при адсорбции антител на КЗ происходит заполнение всей поверхности частицы, требующее, как следует из проведенных расчетов, для КЗ диаметром 30 нм около 190 молекул антител. Таким образом, в случае КЗ для блокирования всех антигенсвязывающих сайтов иммобилизованных антител, предотвращающего связывание конъюгатов антитело–маркер в аналитической зоне тест-полоски, необходимо существенно большее количество аналита в пробе.

Разработка иммунохроматографической тест-системы с использованием КвТ для определения иммуноглобулина E. Представляло интерес также применение флуоресцентных маркеров в иммунохроматографии высокомолекулярных соединений, детектируемых преимущественно в «сэндвич»-формате анализа. В качестве изучаемого аналита был выбран иммуноглобулин Е (IgE) человека, являющийся биомаркером аллергических реакций, что определяет диагностическую значимость контроля его уровня в сыворотке крови.

Для реализации иммуноанализа в «сэндвич»-формате нужна пара специфических антител, одно из которых иммобилизовано на поверхности маркера, а второе – в аналитической зоне тест-полоски. Взаимодействие этих антител с антигеном в ходе иммунохроматографии приводит к формированию в аналитической зоне детектируемых комплексов антитело–антиген–(антитело–маркер).

Проведен выбор оптимального сочетания антител против IgE для «сэндвич»-формата иммунохроматографии. Критерием выбора было достижение максимального аналитического сигнала при фиксированной концентрации антигена. Из четырех проанализированных клонов антител и 16 возможных вариантов их иммобилизации на поверхности КвТ и в аналитической зоне тестполоски максимальная интенсивность флуоресценции отмечалась для сочетания: клон МЕ-113 в составе конъюгата с КвТ + адсорбированный на мембране клон 4F4. По интенсивности флуоресценции в аналитической зоне (т.е. количеству образующихся и детектируемых иммунных комплексов) данное сочетание в 4 и более раз превосходило остальные варианты.

С использованием тест-систем, изготовленных в соответствии с выбранными оптимальными условиями, проведено тестирование стандартных препаратов IgE. На основании результатов измерений интенсивности флуоресценции в аналитической зоне получена градуировочная кривая, приведенная на рис. 5.

–  –  –

Определены аналитические характеристики тест-системы: предел обнаружения составил 2 МЕ/мл, рабочий диапазон – 5–1000 МЕ/мл, стандартное отклонение измеренных значений концентрации IgE в рабочем диапазоне не превышает 9,5% (n=10). Рабочий диапазон тест-системы охватывает вариацию уровня IgE как в норме, так и при патологиях, исключая тем самым необходимость подбора разведения биопробы перед проведением тестирования.

Длительность анализа – 10 минут.

Разработанная тест-система была апробирована на выборке, включающей 43 пробы сывороток крови, полученные от здоровых доноров, и 52 пробы от пациентов с аллергическими реакциями. Референсным методом оценки содержания аналита являлся иммуноферментный анализ с использованием набора реагентов фирмы «Dr. Fooke». Установлено, что результаты, полученные с помощью иммунохроматографической тест-системы с КвТ в качестве маркера, хорошо коррелируют с данными ИФА; экспериментально определенный коэффициент корреляции составляет 0,988 (рис. 6).

–  –  –

Разработка мультиплексных иммунохроматографических тест-систем Мультиплексная тест-система «светофор» с использованием нескольких флуоресцентных маркеров. Для увеличения производительности иммунохроматографического анализа реализован подход, основанный на использовании в одной тест-полоске нескольких маркеров разных цветов. Этот подход упрощает интерпретацию результатов мультиплексного анализа – зона связывания и контролируемое соединение идентифицируются по цвету маркера, а не по точно определяемой локализации окрашенного участка на тест-полоске.

Целесообразным для мультиплексного иммунохроматографического анализа представляется применение КвТ в качестве маркеров. КвТ любых размеров хорошо поглощают в широком диапазоне – 280–800 нм, поэтому их можно возбуждать светом одной длины волны. Чтобы не препятствовать регистрации эмиссии, для возбуждения эффективно использование света в диапазоне от 300 до 450 нм. Спектр эмиссии КвТ, гомогенных по размерам ядер, представляет собой узкий симметричный пик с шириной на полувысоте от 20 до 40 нм.

С изменением размеров КвТ, ядро которых сформировано CdSe, от 2 до 8 нм происходит сдвиг пика эмиссии от 450 до 650 нм, охватывающий большую часть видимого диапазона, что дает возможность одновременно детектировать КвТ нескольких цветов.

Для реализации мультицветной тест-системы «светофор» выбраны КвТ с пиками эмиссии при 525 (зеленый цвет), 585 (желтый цвет) и 625 нм (красный цвет). На поверхности КвТ525 иммобилизовали антитела против стрептомицина (СТМ); КвТ585 – антитела против хлорамфеникола (ХФ), КвТ625 – антитела против офлоксацина (ОФЛ). Отметим, что определяемые антибиотики относятся к разным фармакологическим группам антимикробных препаратов: к амфениколам – ХФ, каминогликозидам – СТМ и к фторхинолонам – ОФЛ. Соотношение КвТ : АТ составило 1:2, что соответствует требованиям к обеспечению низкого предела обнаружения конкурентного формата анализа.

Аналитическая зона предлагаемой тест-системы включает три аналитические линии, сформированные конъюгатами ОФЛ–БСА, ХФ–СИТ и СТМ–ОВА.

Детектирующий конъюгат представляет собой смесь трех конъюгатов КвТ со специфическими антителами.

Для количественной оценки результатов анализа тест-полоски облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны 340 нм с последующей программной обработкой полученных видеоцифровых изображений. Показано, что регистрация результатов анализа через 10 мин обеспечивает максимальное развитие флуоресценции аналитических линий.

Результаты апробации разработанной мультицветной иммунохроматографической тест-системы с использованием проб молока представлены на рис.

7. При отсутствии в пробе аналитов в аналитической зоне тест-полоски наблюдаются три линии – красная, желтая и зеленая. При наличии в пробе ОФЛ в концентрации 200 нг/мл красная линия исчезает, при концентрации ХФ, равной 10 нг/мл, исчезает желтая линия, а при концентрации СТМ, равной 500 нг/мл, исчезает зеленая линия.

–  –  –

Использование мультицветных тест-полосок в сочетании с видеоцифровой регистрацией обеспечивает количественную оценку результатов анализа.

Получены градуировочные кривые зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации каждого из антибиотиков, по которым определены аналитические характеристики тест-системы, представленные в таблице 4. Отметим, что разработанная тест-система характеризуется широкими диапазонами определяемых концентраций – 70-кратным для ХФ, 130-кратным для ОФЛ, 1600-кратным для СТМ.

<

–  –  –

Мультицветная иммунохроматографическая тест-система была апробирована для определения антибиотиков в пробах молока (жирность 3,2%). С целью минимизации влияния матрикса пробы перед анализом разбавляли в 2 раза фосфатно-солевым буферным раствором (50 мМ, рН 7,4) с 1% Твин-20. Тестсистема характеризуется высокой степенью полноты выявления – от 92 до 101%, что свидетельствует о возможности получения достоверных данных о контаминации антибиотиками при тестировании проб молока. Пределы обнаружения для ОФЛ, ХФ и СТМ составляют 0,3; 0,12 и 0,2 нг/мл соответственно, что существенно ниже контролируемых допустимых уровней антибиотиков в молоке и молочной продукции (согласно нормативным требованиям Таможенного Союза): в 100 раз для ОФЛ, в 80 раз – для ХФ и в 1000 раз – для СТМ.

Мультиплексная иммунохроматографическая тест-система с использованием двумерного массива зон связывания. Значительное увеличение числа параметров, одновременно контролируемых при иммунохроматографии, может быть достигнуто при переходе от одномерной к двумерной геометрии аналитических зон на тест-полоске.

Разработана иммунохроматографическая мультиплексная тест-система для одновременного экспрессного определения нескольких соединений. Аналитическая зона тест-полоски представляет собой несколько десятков регулярно расположенных точек с иммобилизованными иммунореагентами, обеспечивающими детекцию различных соединений (рис. 8). Выявление (визуализация) иммунных комплексов осуществляется с помощью конъюгатов антител с нанодисперсным маркером, в качестве которого в данной серии экспериментов использовали коллоидное золото.

–  –  –

Задача мультиплексного анализа решалась на примере детекции четырех психоактивных соединений: морфина, амфетамина, метамфетамина и бензоилэкгонина (основного продукта трансформации кокаина в организме). Каждому аналиту соответствовал определенный горизонтальный ряд точек, который сформирован одной или двумя концентрации конъюгата гаптен–белок. Для нанесения точек использовали программно-контролируемый манипулятор со стальным пином. Расход реагента на одну микрозону связывания – 20 нл, диаметр формирующейся на мембране точки – 250 мкм.

Проведенные исследования по разработке тест-системы включали выбор концентраций и режимов нанесения для конъюгатов гаптен–белок и конъюгатов коллоидного золота с антителами, а также состава среды для проведения анализа. Выбор оптимальных параметров основывался на применении следующих критериев: достижение минимальных пределов обнаружения аналитов, близкие интенсивности окрашивания зон связывания в отсутствие аналитов, достоверные отличия результатов анализа для положительных и отрицательных проб.

Установлено, что интенсивность окрашивания точек в аналитической зоне выходит на максимальный стационарный уровень через 10 мин после контакта тест-полоски с пробой. Это время определяет продолжительность тестирования.

Показано, что при введении каждого из аналитов интенсивность окрашивания зон, соответствующих другим соединениям, достоверно не изменяется.

Так, например, средние значения интенсивности окрашивания точек с конъюгатом амфетамин–БСА при отсутствии морфина и при его концентрации 50 нг/мл составляют 60±2 и 62±2 отн. ед., для конъюгата бензоилэкгонин–БСА соответствующие величины равны 65±2 и 68±3 отн. ед. (усреднение для данных, полученных с использованием 10 тест-полосок с 4 точками-повторами).

С использованием видеоцифровой обработки изображений для каждой концентрации иммобилизованного конъюгата гаптен–белок получены градуировочные зависимости интенсивности окрашивания зон связывания от концентрации аналитов в пробе (рис. 9).

–  –  –

Изучение влияния матрикса проб на связывание маркера показало, что для амфетамина, метамфетамина и бензоилэкгонина достоверные отличия интенсивности окрашивания зон связывания для стандартных растворов аналитов и проб мочи отсутствуют. Для ряда с иммобилизованным конъюгатом морфин–БСА интенсивность окрашивания снижается на 10% по сравнению с буферным раствором, что не вызывает изменений аналитических характеристик.

Результаты измерений характеризуются высокой степенью воспроизводимости. Для морфина в рабочем диапазоне градуировочной кривой среднеквадратичное отклонение составляет 0,3–1,7%, для амфетамина – 0,4–1,5%, бензоилэкгонина – 0,3–2%, метамфетамина – 0,4–1,7 (n тест-полосок = 10).

Нанесение растворов конъюгатов гаптен-белок в двух концентрациях позволяет получать две градуировочные зависимости для каждого из определяемых соединений, объединение которых расширяет рабочий диапазон анализа.

Исходя из полученных градуировочных зависимостей, определены аналитические характеристики тест-системы применительно к каждому из аналитов (табл. 5).

–  –  –

С использованием проб мочи, изначально не содержащих психоактивных соединений, в которые добавлялись их известные количества, проведена серия экспериментов, результаты которых свидетельствуют о высокой степени выявления аналитов с использованием разработанной тест-системы – от 95 до 114%.

Предложенная мультиточечная тест-система сочетает достоинства иммуночиповой и иммунохроматографической технологий и позволяет проводить экспрессное (10 мин) определение нескольких соединений одновременно.

Данные системы могут быть эффективны при диагностике инфекционных и аллергических заболеваний, выявлении онко- и кардиомаркеров, а также при решении других клинико-диагностических и биоаналитических задач.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы изменения оптических и размерных характеристик полупроводниковых квантовых точек (ядро CdSe / оболочка ZnS) при конъюгировании с антителами. Показано сохранение конъюгатами с квантовыми точками разного размера от 70 до 97% интенсивности флуоресценции. Установлено, что при двукратном мольном избытке антител при синтезе конъюгата с квантовыми точками размером 9 нм происходит количественная иммобилизация антител (состав конъюгата 1:2) с сохранением антигенсвязывающих свойств.

2. Определены кинетические и равновесные константы комплексообразования с антигеном хлорамфениколом свободных антител и антител в составе конъюгатов с квантовыми точками. Показано трехкратное увеличение эффективного значения равновесной константы связывания конъюгата (7,4·108 и 2,2·108 1/М).

3. Проведено сравнительное определение пределов детекции квантовых точек и коллоидного золота на мембране для иммунохроматографического анализа. Установлено, что в условиях эксперимента квантовые точки детектируются в 9 раз меньшем количестве, чем частицы коллоидного золота.

Показано, что применение в качестве маркера для иммунохроматографических систем квантовых точек позволяет снизить предел обнаружения хлорамфеникола в 24 раза по сравнению с тест-системами на основе коллоидного золота.

4. Разработана иммунохроматографическая тест-система с использованием квантовых точек для определения уровня иммуноглобулина Е в сыворотке крови человека. На 95 клинических образцах показана высокая степень соответствия полученных результатов с данными иммуноферментного анализа (коэффициент корреляции 0,988).

5. Предложено применение квантовых точек с разными флуоресцентными свойствами в качестве маркеров в мультиплексном иммунохроматографическом анализе. Показана эффективность данного подхода для одновременного контроля трех антибиотиков разных классов.

6. Предложен новый формат мультиплексного иммунохроматографического анализа, основанный на формировании упорядоченного двумерного массива зон связывания на мембране. Данный подход апробирован для одновременной детекции четырех психоактивных соединений с двумя пороговыми уровнями каждого из аналитов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Berlina A.N., Taranova N.A., Zherdev A.V., Vengerov Yu.Yu., Dzantiev B.B.

Quantum dot-based lateral flow immunoassay for detection of chloramphenicol in milk. – Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2013. v. 405, N 14, p. 4997– 5000.

2. Taranova N.A., Byzova N.A., Zaiko V.V., Starovoitova T.A., Vengerov Yu.Yu., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Integration of lateral flow and microarray technologies for multiplex immunoassay: application to the determination of drugs of abuse. – Microchimica Acta, 2013. v. 180, N 11–12, p. 1165–1172.

3. Berlina A.N., Taranova N.A., Zherdev A.V., Sankov M.N., Andreev I.V.,

Martynov A.I., Dzantiev B.B. Quantum-dot-based immunochromatographic assay for total IgE in human serum. – PLoS ONE. 2013, v. 8, N 10, e77485. doi:

10.1371/journal.pone.0077485.

4. Берлина А.Н., Венгеров Ю.Ю., Голубев С.С., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Киселева Ю.В., Короленко Ю.А., Кудеяров Ю.А., Малюченко В.М., Таранова Н.А. Метод калибровочных кривых для иммунохроматографических экспресс-тестов. Часть 2. Иммунохроматографические экспресс тесты с квантовыми точками. – Метрология. 2012, № 10, с. 31–41.

5. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Квантовые точки как маркер в иммунохроматографических диагностических тест-системах. – Нанотехнологии и охрана здоровья. 2012, т. 4, № 4, с. 44–47.

Материалы научных конференций, конгрессов и симпозиумов:

6. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Получение конъюгатов квантовые точки – антитела и их использование в иммунохроматографическом анализе. – Материалы 2-ой международной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина», пансионат «Заря», Московская область, 19-24 сентября 2011 г., с. 102.

7. Berlina N.A., Taranova N.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Preparation of the antibodies labeled by quantum dots and their use in immunochromatography assay. – IV международный форум RUSNANOTECH, Москва, 26–28 октября 2011 г. № 3.1.3.

8. Berlina N.A., Taranova N.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Development of quantum dots-based lateral flow immunoassay for detection of chloramphenicol in milk. – V International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA–2011), Prague, Czech Republic, November 1–4, 2011. Book of abstracts, p. 397.

9. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка иммунохроматографических тест-систем с флуоресцентной детекцией на основе квантовых точек. – Сборник тезисов конкурса молодых ученых в рамках научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «Десятые чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Том 2: Конкурс молодых ученых. Москва-Пущино, 14–17 ноября 2011 г., с. 68.

10. Таранова Н.А., Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка иммунохроматографических тест-систем для экспресс-диагностики в мультизонном формате с использованием квантовых точек в качестве маркеров. – Материалы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва, 20–22 марта 2012 г., с. 263–264.

11. Берлина А.Н., Таранова Н.А., Жердев А.В., Санков М.Н., Андреев И.В., Мартынов А.И. Дзантиев Б.Б. Разработка иммунохроматографических тест-систем на основе квантовых точек для определения общего IgE в сыворотке крови человека. – Материалы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития»

Москва, 19–22 марта 2013 г., с. 382–383.

12. Таранова Н.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Тест-полоска – светофор:

Разработка иммунохроматографических тест-систем с использованием квантовых точек для одновременного определения нескольких антибиотиков. – Материалы Второго съезда аналитиков России, Москва, 23–27 сентября 2013 г., с. 478.

13. Дзантиев Б.Б., Таранова Н.А., Бызова Н.А., Жердев А.В., Венгеров Ю.Ю.

Многоточечный формат иммунохроматографии: Тест-системы для экспрессного одновременного определения разных психоактивных соединений. – Сборник тезисов I Международной научно-практической конференции «Современная химико-токсикологическая экспертиза». 27–28 ноября 2013 г., Москва, с. 70–71.

14. Zvereva E., Byzova N., Taranova N., Berlina A,., Zherdev A., Dzantiev B.

Immunochromatographic tests for quantitative and multiparametric control of veterinary drugs in foodstuffs. – Seventh International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis. Ghent, Belgium, 2–5 June, 2014.

Book of abstracts, p. 31.






Похожие работы:

«БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СКРЕЩИВАНИЯ 1. Общие положения. Изменение наследственности у помесей 1–го поколения 2. Гетерозис помесей и нарушение у них нормы развития 3. Условия, определяющие результативность скрещивания Скрещиванием в зоотехнии называется спари...»

«ПРЕДПРИЯТИЕ ГОСКОРПОРАЦИИ «РОСАТОМ» АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО «НИИЭФА им. Д.В. ЕФРЕМОВА» ОТЧЕТ ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ за 2015 год Санкт-Петербург СОДЕРЖАНИЕ Общая характеристика и основная деятельность АО «НИИЭФА» 1. Экологическая по...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «РОССИЙСКИЙ ЭКОНОМИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Г.В. ПЛЕХАНОВА» КЕМЕРОВСКИЙ ИНСТИТУТ (ФИЛИАЛ) Кафедра иностранных языков УТВЕРЖДАЮ: Од...»

«Социологическая публицистика © 2002 г.М. БЕРТИЛЬССОН ВТОРОЕ РОЖДЕНИЕ ПРИРОДЫ: ПОСЛЕДСТВИЯ ДЛЯ КАТЕГОРИИ СОЦИАЛЬНОЕ БЕРТИЛЬССОН Маргарета профессор факультета социологии Копенгагенского университета (Дания). Что будет с категорией социальное, когда природа станет культурой, а культура природой? Не...»

«№ 8/10516 12.02.2004 ПОСТАНОВЛЕНИЕ МИНИСТЕРСТВА ФИНАНСОВ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ И МИНИСТЕРСТВА ЭКОНОМИКИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ 31 декабря 2003 г. № 191/263 8/10516 Об утверждении Инструкции о порядке бухгалтерского уче...»

«Всесибирская олимпиада школьников 2010/11 уч.год. ОТВЕТЫ по БИОЛОГИИ. Заочный тур. Всесибирская открытая олимпиада школьников 2010/11 уч. год Заочный тур. БИОЛОГИЯ. декабрь-январь 2010/11 Ответы на задачи Оглавление Выдержки из п...»

«WWW.MEDLINE.RU, ТОМ 12, БИОФИЗИКА, МАРТ 2011 ОБРАЗОВАНИЕ БИМОДАЛЬНЫХ ВРЕМЕННЫХ РАСПРЕДЕЛЕНИЙ УЛЬТРАКОРОТКИХ ЛАЗЕРНЫХ ИМПУЛЬСОВ ПРИ ПРОХОЖДЕНИИ ЧЕРЕЗ ОДНОРОДНЫЙ СЛОЙ СИЛЬНОР...»

«03.10.2013 1319-п Об утверждении государственной программы Пермского края «Развитие здравоохранения» В соответствии с Указом Президента Российской Федерации от 7 мая 2012 г. № 598 «О совершенствовании государственной политики в сфере здравоохранения», распоряжением Правительства Российской Федерации о...»

«И. В. Дроздова Удивительная биология Серия «О чем умолчали учебники» http://litres.ru http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=165317 И.В. Дроздова «Удивительная биология», серия «О чем умолчали учебн...»







 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.