WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ РОДА MYCOBACTERIUM: ПОЛУЧЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РЕАКТИВАЦИИ. ...»

На правах рукописи

Шлеева Маргарита Олеговна

ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ РОДА MYCOBACTERIUM:

ПОЛУЧЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РЕАКТИВАЦИИ.

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории «биохимии стрессов микроорганизмов» Института

биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Озерецковская Ольга Леонидовна доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Ведущая организация: Московский гГосударственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится «21» декабря 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им.

А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » 2004г.



Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В научной среде давно существует предположение о том, что латентная форма туберкулеза связана с особым состоянием клеток возбудителя M. tuberculosis в организме, при котором они могут сохраняться много лет в хозяине с возможным последующим переходом в активное состояние, и, как следствие, активизацией болезни. Однако существование покоящегося состояния для микобактерий in vitro или in vivo не было экспериментально установлено. Эта проблема является общей для микробиологии, т.к.

ранее покоящееся состояние микроорганизмов связывали только со специализированными формами (спорами и цистами), образуемыми ограниченным числом бактерий. Однако сейчас становится ясно, что многие неспорулирующие бактерии, в том числе и патогенные микроорганизмы, в определенных условиях могут переходить в покоящееся состояние, оставаясь при этом жизнеспособными.

Ранее было показано, что культура М. luteus способна образовывать покоящиеся формы в длительной постстационарной фазе. Характерной особенностью таких форм является их «некультивирумость», т.е. неспособность образовывать колонии на твердых средах или размножаться в жидкой среде. Было также обнаружено, что реактивирующей покоящиеся клетки способностью обладает секретируемый в культуральную среду белок M. luteus, названный Rpf (от английского resuscitation protein factor). Согласно базам данных гомологичные гены rpf имеются в микроорганизмах рода Mycobacterium. Об этом также свидетельствуют результаты гибридизации и ПЦР со специфическими для rpf праймерами. Логично предположить, что продукты rpf-подобных генов в этих бактериях выполняют аналогичные ему функции у микрококка. В частности у M. tuberculosis имеется 5 генов и, возможно, они контролируют вход\выход клеток из покоящегося состояния.





Несмотря на значимость изучения латентности туберкулеза, экспериментальная модель получения покоящихся клеток M. tuberculosis не описана, тем более не установлена роль белков Rpf в этом процессе.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось создание экспериментальной модели образования покоящихся клеток микобактерий, в том числе Mycobacterium tuberculosis и их реактивация.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода получения покоящихся форм микроорганизмов рода Mycobacterium, в том числе Mycobacterium tuberculosis.

2. Исследование механизмов образования «некультивируемых» клеток бактерий.

3. Разработка метода реактивации покоящихся форм.

4. Исследование роли белков Rpf в процессе реактивации покоящихся клеток бактерий.

Научная новизна.

1. Впервые найдены условия, при которых культуры Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus rhodochrous и Mycobacterium smegmatis переходят в длительной постстационарной фазе в «некультивируемое» состояние, которое по своим параметрам соответствует покоящемуся.

2. Впервые установлено, что появление покоящихся форм сопровождается накоплением в культуральной жидкости смеси жирных кислот, основной частью которых является олеиновая кислота, в концентрациях, подавляющих размножение активных клеток.

3. Впервые установлена зависимость перехода в активное состояние покоящихся клеток M. tuberculosis от функционирования белков семейства Rpf.

Научно-практическое значение.

Созданные экспериментальные модели получения покоящихся форм микобактерий, в частности M. tuberculosis, могут быть использованы для изучения механизмов латентности туберкулеза и перехода этих бактерий к активному состоянию in vivo. Белки семейства Rpf могут быть в дальнейшем использованы в качестве новых мишеней для создания противотуберкулезных средств и разработки новых методов профилактики заболевания.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы докладывались на итоговых научных конференциях: International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology" (Пущино, 2000), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), Society for General Microbiology-149th Ordinary Meeting. (University of East Anglia, Norwich, 2001), 10 International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology ‘The World of Microbes’( Paris, 2002), 153rd meeting Society for General Microbiology (Anglia, 2003) Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в числе которых 5 статей в российских и международных научных журналах.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включает наименований. Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный характеристикам различных физиологических состояний бактерий, поведению микробных популяций в стационарной фазе. Отдельное внимание уделено стрессу бактерий и реакции на него, факторам, определяющим поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ, биохимическим изменениям бактериальной клетки в условиях голодания, выходу бактерий из покоящегося состояния, социальному поведению бактерий. Кратко описано экспериментальное изучение туберкулеза и латентности инфекции. Изложены современные представления о генетической регуляции переживания бактериальными клетками неблагоприятных условий.

Во второй главе представлены методы и материалы исследования.

Выращивание бактериальных культур Mycobacterium tuberculosis штамм «Академия» выращивали при 37оС в стеклянных пробирках, содержащих 2 мл среды Сатона, к которой был добавлен БСА (бычий сывороточный альбумин, 5 фракция), глюкоза и NaCl. Культуры выдерживали в постстационарной фазе при 37оС в течение 8-ми месяцев.

Rhodococcus rhodochrous, штамм NCIMB 13805, выращивали аэробно при 37 °C в колбах при перемешивании (125 мл среды в колбах объемом 750 мл, скорость перемешивания 200 rpm) в богатой питательной среде broth E (Lab M) или модифицированной среде Сатона.

Mycobacterium smegmatis (штамм mc2155) выращивали первоначально в течение 30 ч при 37 °C на орбитальной качалке (250 rpm) в 150 мл богатой среды Broth E (LabM), к которой был добавлен 0.05% (v/v) твин-80. Затем бактерии были пересеяны в модифицированную среду Hartman’s-de Bont (mHdeB).

Оценка жизнеспособности клеток. Суспензию бактериальных клеток последовательно разводили в свежей среде и затем 100 мкл из каждого разведения высевали на агаризованную среду Сатона. Предел обнаружения колониеобразующих единиц (КОЕ) составлял 5.100 мл-1.

Общее число клеток в миллилитре культуры оценивали при помощи камеры Helber по формуле n/5. 108, где n - среднее количество клеток в одном малом квадрате.

Сканирующая электронная микроскопия.

Клетки были зафиксированы в 3% глутаровом альдегиде с последующей обработкой 0.1 М Na-какодилатном буфере (pH 7.2). Пробы были высушены на воздухе, после чего производили напыление Au частицами размером 20 нм. Микроскопия осуществлялась при использовании сканирующего электронного микроскопа GSM-840A (Япония).

Иммуноферментный анализ.

Бактериальный супернатант (0.2 мл) был помещен в пластиковые планшеты (Costar).

Затем лунки промывали PBS-T (фосфатный буфер, содержащий 0.05% твина-80).

Первичные анти-Rpf антитела кролика были добавлены в разведении 1:10.000. После промывки PBS-T были добавлены вторичные антитела (анти-кроличий алкалинфосфатазный коньюгат (Sigma, 1:5.000). Затем, после очередного цикла промывки PBS-T был добавлен субстрат щелочной фосфатазы ( таблетка п-нитрофенилфосфата - Sigma).

Интенсивность окраски определяли сканированием планшетов при 405 нм (Labsystem optical reader). Для калибровки метода использовали различные концентрации рекомбинантного белка Rpf в соответствующей культуральной среде.

Гель – фильтрация супернатанта с ингибирующей активностью.

Гель-фильтрацию проводили при низком давлении на носителе Bio-Gel P-2 (Bio-Rad) с областью фракционирования 0.1 – 1.8 кДа. Общий объем колонки составил 175 мл, нулевой объем – 65 мл. Скорость эллюции = 25 мл\ч. Объем пробы (лиофильно сконцентрированный в 8 раз СН с ингибирующей активностью) = 3.5 мл. Объем каждой фракции составил 5 мл. Для калибровки колонки использовали миоглобин, НАДФ, ФМН, триптофан.

Гидрофобная хроматография.

Распределительную хроматографию ингибирующих СН-в проводили на модифицированной агарозе «Octyl-Sepharose CL-4B» (Pharmacia). Перед использованием колонку (объемом 5 мл) промывали последовательно водой (один объем колонки), таким же объемом этанола, двумя объемами бутанола, затем в обратном порядке этанолом и водой. После этого колонку уравновешивали 0.025 М Na-фосфат-цитратным буфером.

Скорость промывки составила 25 мл\см2.ч. Ступенчатую элюцию вели с помощью воды, этанола и ацетонитрила. Колонку предварительно уравновешивали водой. Затем начали подавать этанол (один объем колонки), затем колонку снова уравновешивали водой, после чего элюцию вели ацетонитрилом (один объем).

Тонкослойная хроматография (ТСХ).

ТСХ фракции с ингибирующей активностью, полученной после гидрофобной хроматографии, проводили на силикагеле 60 F254 (Merk, Германия) в системе: хлороформметанол-конц.аммиак (65:35:5) в течение часа при температуре 20-25°C..

Двумерная хроматография ингибирующей фракции после очистки на октил-сефарозе супернатанта M. smegmatis в системах - хлороформ:метанол:аммиак = 65:35:5 и хлороформ:метанол:ацетон:уксусная кислота:вода = 5:1:2:1:0,5.

Хроматограммы проявляли опрыскиванием водой. В результате получали индивидуальное пятно, которое экстрагировали из силикагеля ацетонитрилом.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

Спектры ЯМР в препаратах ИВ, предварительно очищенного при ТСХ и затем растворенного в дейтерированном метаноле, регистрировали на спектрометре Varian HAD (рабочая частота спектрометра 100 мгГц). Для повышения отношения сигнал\шум использовали накопитель спектров С-1024. Все спектры ЯМР снимали при температуре образцов 34°C. Стабилизация резонансных условий осуществляли по сигналу Н2О, присутствующей в небольшом количестве в дейтерированном метаноле. Для калибровки амплитудных интенсивностей пиков в спектрах ЯМР различных образцов использовали один и тот же внешний эталонный образец раствора гексаметилдисилоксана (ГМДС) в четыреххлористом углероде в отношении 1:50. Химические сдвиги в спектрах ЯМР измеряли от линии Н2О и пересчитывали на ГМДС.

В третьей главе представлены собственные результаты.

Получение «некультивируемых» форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae.

Был проведен скрининг сред и условий культивирования для получения покоящихся форм микобактерий. В результате нами были подобраны условия, при которых культуры Mycobacterium tuberculosis (рис.1), Rhodococcus rhodochrous (рис.2) и Mycobacterium smegmatis (рис.3) могли переходить в покоящееся состояние.

В качестве критерия образования покоящихся клеток была выбрана способность культивирования бактерий на твердых средах. Ранее на M. luteus было обнаружено, что появление покоящихся форм коррелирует с резким снижением способности образовывать колонии на твердых средах при снижении уровня метаболизма, сохранении общего числа клеток (ОЧК) и целостности мембраны.

В результате срининга различных условий было найдено, что образование «некультивируемых» форм исследуемых бактерий наблюдается в стационарной фазе, если до этого клетки росли длительное время при неблагоприятных условиях выращивания в логарифмической фазе. К таким условиям относятся: неоптимальный состав среды роста, сниженный кислородный режим.

Переход клеток в «некультивируемое» состояние зависит от совокупности факторов, таких как возраст инокулята, постоянства рН, различные типы голодания, состав среды

–  –  –

Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis.

Из выше приведенных данных можно предположить, что при субоптимальных условиях роста клетки переходят в некое определенное состояние, в котором они как бы синхронизируются с кажущейся потерей культивируемости. Если это предположение верно, то и другие комбинации неблагоприятных для развития популяции условий могут привести к образованию покоящихся форм. Мы исследовали некоторые мутантные штаммы Mycobacterium smegmatis, в которых методом транспозонного мутагенеза были заблокированы гены пуринового метаболизма (purF) или двухкомпонентной регуляторной системы (devR), что приводило к уменьшению выхода биомассы. Эти мутанты показали значительное временное снижение КОЕ в процессе роста на немодифицированной HdeB среде в анаэробных условиях. Общее количество клеток не менялось в культурах мутантов, что позволяет отнести эти бактерии со сниженным количеством КОЕ к «некультивируемым». Через некоторое время КОЕ восстанавливалось до исходного уровня. В присутствии кислорода подобного поведения мутантных клеток не наблюдали (рис.7 А, Б). При этом дикий тип, растущий в анаэробных и аэробных условиях? не проявил подобного фенотипа, т.е. уменьшения КОЕ не наблюдалось (рис.7 В). В данном случае для получения «некультивируемых» форм необходимо сочетание анаэробиоза и повреждение функционирования некоторых генов.

Таким образом, для образования «некультивируемых», покоящихся форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae в стационарной фазе общим является необходимость культивирования клеток при сочетании неоптимальных условий роста, например, разных типов голодания, определенного кислородного режима. При этом, переход в «некультивируемое» состояние чувствителен ко многим факторам, таким как возраст инокулята, постоянство рН, различные типы голодания, состав среды роста, кислородный режим, некоторые мутации.

Рис.7. Поведение мутантов M. smegmatis (DevR и purF) в стационарной фазе

–  –  –

Рис.8. Гель фильтрация (BioGel P-2) концентрированного супернатанта Rhodococcus rhodochrous с ингибирующей активностью Хранение супернатантов, содержащих ингибирующее вещество, при +4С показало, что активность сохраняется долгое время (примерно 1 месяц).

Данное вещество обладает гидрофобными свойствами. При тестировании его активности необходимо рассчитывать его концентрацию не на единицу объема, а на единицу клеток.

Первый этап очистки – пропускание супернатанта через октил-сефарозу (снимаем этанолом), затем используем метод тонкослойной хроматографии в системе хлороформметанол-конц.аммиак (65:35:5). Хроматограммы проявлялись опрыскиванием водой. В результате мы получаем индивидуальное пятно (рис.9), которое экстрагируем из силикагеля ацетонитрилом.

Рис.9.Тонкослойная хроматография фракции с ингибирующей активностью насиликагеле

Небольшая масса исследуемого вещества и наличие гидрофобных свойств позволило предположить, что оно может относиться к классу липидов. Для проверки этого предположения была проделана серия анализов по выявлению структуры этого вещества.

Анализ ЯМР и ИК спектров показало, что алифатические соединения неизопреноидной природы, обладающие карбониловой группой и 1-2 ненасыщенными связями, являются основными веществами препарата.

Анализ двумерных Н-Н (рис.10А) и Н-С (рис.10Б) спектров ЯМР показал наличие в препарате определенных последовательностей, характерных для мононенасыщенных жирных кислот:

–  –  –

Рис.10. Двумерные спектры ЯМР ингибитора, выделенного из супернатанта M.

smegmatis

А) протон-протонный Б) протон-углеродный По результатам масс-спектрометрии было получено, что изучаемый препарат является смесью жирных кислот, при этом доминирующей ЖК у M. smegmatis является олеиновая (рис.11).

Рис.11. Масс-спектроскопия ингибитора, выделенного из супернатанта M.

smegmatis При сравнительном анализе спектров ЯМР ИВ из M. smegmatis и олеиновой кислоты (оба вещества были предварительно пропущены через колонку с октил-сефарозой, а затем очищены при помощи ТСХ на силикагеле-60) было обнаружено, что оба соединения имеют похожие спектры (рис.12).

Рис.12.Спектры ЯМР олеиновой кислоты и ингибитора из M. smegmatis

–  –  –

По результатам биологического тестирования ингибирующей активности этих веществ было получено, что оба соединения замедляют рост клеток при одних и тех же концентрациях (действующая концентрация на 105 клеток = 5 мкг\мл).

При добавлении в супернатант БСА, который как известно, эффективно связывает ЖК, ингибирующая активность исчезала. Таким образом, ИВ, появляющееся в супернатантах культур при переходе клеток в «некультивируемое» состояние, относится к жирным кислотам.

Восстановление покоящихся форм.

Для доказательства способности клеток образовывать покоящиеся формы абсолютно необходимым является демонстрация способности таких клеток к восстановлению метаболизма и способности к делению. Ранее нами было установлено, что реактивация покоящихся клеток M.luteus было успешной, если ее проводить в жидкой среде. Для этого мы использовали метод конечных разведений (МКР), который позволяет одновременно проводить реактивацию в жидкой среде и оценивать количество жизнеспособных бактерий в исходной культуре. Это помогало при определении численного значения реактивированных клеток и в решении проблемы остаточной выживаемости при проведении реактивации. Было выяснено, что, как и в случае с M.luteus, восстановление жизнеспособности исследуемых в данной работе клеток происходит, если в качестве жидкой среды для реактивации использовали супернатанты, полученные при фильтровании культур Rhodococcus rhodochrous, М.tuberculosis и M.smegmatis в логарифмической фазе. Супернатанты применяли в качестве среды для определения жизнеспособности методом конечных разведений. В этом случае число жизнеспособных бактерий увеличивалось на 4-7 порядков, приближаясь к общему числу клеток, подсчитанному микроскопически (рис.13).

Рис.13. Количественная оценка оживления некультивируемых форм методом МКР

.

Анализируя супернатант активно растущих клеток было обнаружено, что пропускание его через аффинную колонку, содержащую антитела, выработанные против Rpf, его оживляющая активность заметно снижалась, что указывает на природу активного вещества, имеющую сходство с Rpf. Другие свойства активного начала в супернатанте также свидетельствовали в пользу белковой природы стимулятора (табл1).

–  –  –

Для доказательства того, что определяющим в восстановлении клеток у микобактерий являются Rpf-подобные факторы, были исследованы специфические трансформанты M.

smegmatis. Эти трансформанты (pAGR и pAGMo) содержали плазмиду с включенным геном Rpf M. luteus под контролем собственного промотора (pAGR) или ацетамидного промотора (pAGMo). В обычных аэробных условиях при росте на полной среде Сатона поведение трансформированных культур не отличалось от дикого типа.

В аэробных условиях на модифицированной среде эти трансформанты, так же как и дикий тип, показали значительное снижение КОЕ. Однако при оживлении наблюдались отличия от дикого типа. Для pAGR и pAGMo было характерно самооживление на 4-6 день (увеличение ОD), в то время как pAGH (трансформант с контрольной плазмидой) и дикий тип никакого увеличения OD не показали.

–  –  –

1,4 0,18

–  –  –

Иммуноферментный анализ, определяющий наличие Rpf-подобных белков в супернатантах культур различных штаммов, показал, что имеется максимум накопления этих белков в логарифмической фазе (рис.15). В то время как концентрации Rpf-подобных белков для штаммов, содержащих плазмиды pAGMo и pAGH (контрольный вектор), были равны, в супернатанте штамма, содержащего плазмиду pAGR, образовывалось больше этих белков, что, вероятно, отражается на процессе активации покоящихся форм.

Для «некультивируемых» форм M. tuberculosis, в отличие от дикого штамма быстрорастущих микобактерий, было характерно наличие самооживления в жидкой среде, т.е. активация клеток проходила в жидкой среде без каких-либо добавок (рис.16).

Для изучения роли белков Rpf в процессе самовосстановления M. tuberculosis были исследованы мутанты M. tuberculosis, у которых были заблокированы путем аллельного обмена по три Rpf-подобных гена. Эти мутанты, так же как и дикий тип образовали «некультивируемые» формы. Однако, они оказались не способны к самовосстановлению, в отличие от дикого типа (рис.16), что подтверждает роль белков Rpf в реактивации покоящихся клеток M. tuberculosis.

–  –  –

Таким образом, нам впервые удалось установить зависимость перехода в активное состояние покоящихся клеток M. tuberculosis от функционирования белков семейства Rpf.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на довольно большое количество экспериментально зарегистрированных «некультивируемых» форм бактерий, практически во всех случаях не была продемонстрирована обратимость этого процесса, т. е. способность «некультивируемых»

форм к переходу в активное, делящееся состояние. Однако, если такая обратимость не доказана, подобные клетки должны рассматриваться как нежизнеспособные. При отсутствии оживления ставится под сомнение микробиологическое и медицинское значение таких форм.

В нашей работе мы разработали методы для получения и оживления «некультивируемых»

клеток M. tuberculosis, R. rhodochrous и M. smegmatis, относящихся к Г-Ц - богатым бактериям. Однако имеется существенное различие между «некультивируемыми»

клетками R. rhodochrous, M. smegmatis и M.tuberculosis в их способности к реактивации.

Для первых двух культур необходимым условием реактивации «некультивируемых»

клеток являлось добавление в среду восстановления супернатанта, полученного из активно растущих клеток, или белка Rpf. В то время как в случае с M. tuberculosis происходило существенное увеличение числа жизнеспособных клеток (до 5 порядков) при культивировании клеток на свежей среде Сатона без специальных добавок (рис.13).

Возможно, это свойство возбудителя туберкулеза как-то связано с его способностью к длительной персистенции в организме хозяина и реактивации туберкулеза.

Очевидно, действующим началом, способствующим реактивации микобактерий, является белок, сходный с ранее обнаруженным в супернатанте M.luteus, белком Rpf. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов с клетками M. tuberculosis с нокаутированными генами Rpf. Этот вывод представляется существенным для понимания механизмов персистенции возбудителя туберкулеза и патогенеза латентных форм туберкулеза.

Выводы:

1) Впервые обнаружено, что при культивировании в длительной стационарной фазе клетки M. tuberculosis, M. smegmatis и R. rhodochrous образуют «некультивируемые» формы, которые по своим характеристикам могут быть отнесены к покоящимся. Необходимым фактором перехода клеток в неактивное состояние является рост бактерий в условиях сочетания нескольких неблагоприятных факторов (различные типы голодания, недостаток кислорода).

2) При образовании «некультивируемых» форм в среде выращивания обнаружено появление смеси свободных жирных кислот, среди которых преобладает олеиновая кислота. Возможно, что накопление жирных кислот является одним из факторов образования покоящихся клеток при адаптации микобактерий к субоптимальным условиям роста.

3) «Некультивируемые» клетки M. smegmatis и R. rhodochrous могут быть реактивированы в жидкой среде в присутствии белка Rpf или веществ(а) содержащихся в супернатанте активно растущих клеток, близких к Rpf.

4) «Некультивируемые клетки» трансформанта M. smegmatis, продуцирующего секретируемую форму Rpf, способны к самовосстановлению.

5) «Некультивируемые» клетки M. tuberculosis дикого типа способны к самовосстановлению в жидкой среде. Клетки, содержащие по три одновременно инактивированных гена Rpf (Rv0867+Rv1884+Rv1009 и Rv0867+Rv1884+Rv2389) теряют споcобность к самовосстановлению, что подтверждает роль белков Rpf в оживлении покоящихся клеток M. tuberculosis.

Список публикаций Cписок статей

1. M. O. Shleeva, K. Bagramyan, M. V. Telkov, G. V. Mukamolova, M. Young, D. B. Kell and A. S. Kaprelyants. Formation and resuscitation of “non-culturable” cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase. (2002). Microbiology UK, 148, 1581-1591.

2. M.O. Шлеева, Г.В. Мукамолова, М.В. Телков, T.Л. Березинская, A.В. Сыроешкин, С.Ф. Бикетов, A.С. Капрельянц. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление.(2003).Микробиология,Т.72, стр. 76-83.

3. Матвеева И.С., Плетенева Т.В., Березинская Т.Л., Аветисян А., Шлеева М. О., Капрельянц А.С., Лебедев И.М., Колесников М.Н., Бикетов С.Ф., Фролов В.А., Сыроешкин А.В. (2003).Элементные профили металлов как векторная характеристика вида и физиологического состояния. Микроэлементы в медицине.

Т.4 (3), стр. 6-12.

4. Kuznetsov BA, Davydova ME, Shleeva MO, Shleev SV, Kaprelyants AS, Yaropolov AI.(2004) Electrochemical investigation of the dynamics of Mycobacterium smegmatis cells' transformation to dormant, nonculturable form. Bioelectrochemistry.

Sep;64(2):125-31.

5. Shleeva M, Mukamolova GV, Young M, Williams HD, Kaprelyants AS. Formation of 'non-culturable' cells of Mycobacterium smegmatis in stationary phase in response to growth under suboptimal conditions and their Rpf-mediated resuscitation. Microbiology.

Jun;150(Pt 6):1687-97.

Тезисы конференций

1. A.Kaprelyants, G.Mukamolova, M.Shleeva, D.Kell, M.Young."Non-culturable" bacteria.

The role of bacterial cytokines in resuscitation( 2000) Abstracts of International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology". Puschino, p.53.

2. M.Telkov, M.Shleeva, K.Bagramyan et al. In vitro model of "nonculturable" Mycobacteria and their resuscitation with bacterial cytokines of Rpf family.

(2000)Abstracts of International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology". Puschino, p.126.

3. М.О.Шлеева, К.Баграмян, М.В.Телков, А.С.Капрельянц. Образование некультивируемых (покоящихся) форм микроорганизмов рода Микобактерии.

(2000). Материалы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии". Пущино, стр.215.

4. M.O. Shleeva, G.V. Mukamolova, K. Bagramyan, M.V. Telkov, D.B. Kell, M.Young, A.S. Kaprelyants. Formation and resuscitation of "non-culturable" mycobacteria in stationary phase.(2001). Abstracts of Society for General Microbiology-149th Ordinary Meeting. University of East Anglia, Norwich, p.44.

5. M. Shleeva. Cultivation of Mycobacteria under non-optimum conditions in logarithmic phase results in formation of ‘non-culturable’(dormant) cells in stationary phase.(2002).Abstracts of 10 International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology ‘The World of Microbes’, Paris, p. 233.

6. Obolbek A. Turapov, Margarita O. Shleeva, Galina V. Mukamolova, Danielle I. Young, Arseny S. Kaprelyants, Michael Young, PBMG 27 Rpf-mediated resuscitation of stressed mycobacteria. Abstracts of 153rd meeting Society for General Microbiology. (2003).p.

68.



Похожие работы:

«Факультет экономики и менеджмента 341 2) Изученность среды до планирования условий возведения недвижимости;3) Учет исторического наследия здания при его функционировании, как жилой недвижимости;4) Экологические возможности качества жизни;5) Участие представителей сообщества дом...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, МЕХАНИКИ И ОПТИКИ ИНСТИТУТ ХОЛОДА И БИОТЕХНОЛОГИЙ Н.Л. Самосюк РУССКИЙ ЯЗЫК КАК ИНОСТРАННЫЙ ЭКОНОМИКА И МЕНЕДЖМЕНТ Учебное пособие Санкт-Петербур...»

«European Researcher, 2013, Vol.(45), № 4-1 Biological sciences Биологические науки UDC 577.151:54-38 Study of Body Adaptation Reactions in Rats’ Organs and Tissues in Terms of Chronic Lead Intoxication 1 Halina P. Andreyko 2 Olena O. Konovalova 3 Olena O. Gladka...»

«Демография. Миграции © 2003 г. М.А. КЛУПТ ДЕМОГРАФИЧЕСКАЯ ПОЛИТИКА КАК ПРЕДМЕТ КОНТЕНТ-АНАЛИЗА КЛУПТ Михаил Александрович доктор экономических наук, профессор Санкт-Петербургского государственного университета экономики...»

«Большой практикум по вторичной продукции Министерство образования Российской Федерации Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова Кафедра экологии и зоологии Большой практикум по вторичной продукции Методические указания Ярос...»

«Документ [ /20/32/237/ ]: ФЗ № 0169 Об архитектурной деятельности в Российской Федерации Федеральный закон Об архитектурной деятельности в Российской Федерации/N 169-ФЗ от 17.11.1995/ 17 ноября 1995 года N 169-ФЗ Принят Государственной Думой 18 октября 1995 года Глава I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Статья 1. Цель и задачи настоящего Федер...»

«КАЗАНСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ РИ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ Кафедра прикладной экологии В.В. ЗОБОВ ФИЗИОЛОГИЯ АДАПТАЦИЙ Конспект лекций Казань – 2014 УДК 821.111.09 ББК Ш3(4) Принято на заседании кафедры прикладной экологии Протокол № 5 от «26» декабря 2014 года Рецензенты: доктор химических наук, профессор...»

«Программа составлена в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом высшего образования (ФГОС ВО) по направлению подготовки 06.04.01 Биология (уровень магистратуры), утвержденным приказом Министерства образования и науки Российской Федерации от «23»...»

«© 1993г. А.Г.КАХХАРОВ ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ИМПЕРАТИВ КАК ФАКТОР ПОЛИТИЧЕСКОЙ ИНТЕГРАЦИИ КАХХАРОВ Абдулахат Гамиевич — кандидат философских наук, заведующий сектором социологии Института философии и права им. ИМ. Муминова АН Республик...»

«УДК: 538.9: 577.31 Теоретические и экспериментальные исследования открытых состояний ДНК ©2013 Шигаев А.С., Пономарёв О.А., Лахно В.Д. Институт математических проблем биологии, Российская академия наук, Пущино, Московская область, 142290, Россия Аннотация. Работа посвящена обзору и анализу литературных данны...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.