WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина Институт экспериментальной физики, Фрайбергский технический ...»

Культивирование и дифференцировка

мезенхимальных стромальных клеток жировой

ткани человека в носителях на основе

хитиновых скелетов морских губок

Е.Ю. Рогульская1*, В.В. Муценко1, Е.Б. Ревенко1,

Ю.А. Петренко1, Г. Эрлих2, А.Ю. Петренко1

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина

Институт экспериментальной физики, Фрайбергский технический университет, Фрайберг,

Германия

*rog-helen@yandex.ru

Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, хитин, морские губки, носитель, тканевая инженерия.

Тканевая инженерия — интенсивно развивающееся направление биотехнологии, объединяющее принципы клеточной биологии, медицины и материаловедения с целью создания функциональных структур, позволяющих заменить поврежденный орган или ткань при трансплантации. Разработка тканеинженерных конструкций возможна при наличии, по крайней мере, двух исходных компонентов — клеток и трехмерной матрицы из биосовместимого материала [4].

В качестве клеточной основы биоинженерных тканей наиболее перспективными являются мезенхимальные стромальные клетки (МСК), обладающие высоким пролиферативным потенциалом и способностью к направленной мультилинейной дифференцировке [5]. Жировая ткань обладает рядом преимуществ перед другими источниками МСК, благодаря минимальной инвазивности процедуры получения, относительной доступности материала и высокому содержанию клеток-предшественников [7].

Выбор оптимального носителя для клеточной экспансии остается ключевой задачей при разработке тканеинженерных структур.


В настоящее время применяются скаффолды на основе как природных, так и синтетических материалов из коллагена, альгината, хитозана, желатина, гидроксилапатита, полимолочной и полигликолевой кислот и т.д. [6]. Физикохимические свойства синтетических полимеров чрезвычайно разнообразны, что позволяет выбрать материал с необходимой пористостью, прочностью, эластичностью и регулировать Культивирование и дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в носителях… скорость его деградации. Разработка скаффолдов с заданными параметрами – технологически сложный процесс, который требует затраты больших усилий не только специалистов различных дисциплин, но и существенных капиталовложений. Вместе с тем природные носители характеризуются большей биосовместимостью, способствуют оптимальной адгезии, миграции и пролиферации клеток [6].

В последние годы существенно возрос интерес исследователей к биотехнологическому потенциалу морских губок. Скелет морских губок представляет собой сложную систему пересекающихся спикул, образованную известковым или кремнеземным минеральным компонентом и/или органической частью, которая формирует уникальную трехмерную конструкцию. Как правило, органический матрикс состоит из белков коллагеновой природы, тогда как внешняя оболочка спикул губок Verongula gigantea, Ianthella basta и Aplysina sp. отряда Verongida образована -хитином [2]. Однако вопрос о возможности применения хитиновых скелетов этих губок в регенеративной медицине и тканевой инженерии остается открытым.

Целью настоящего исследования явилось изучение распределения, метаболической активности и способности к направленной дифференцировке мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека при культивировании в составе скаффолдов на основе скелета морских губок представителей отряда Verongida (Aplysina fulva, Aplysina aerophoba, Ianthella basta).

Материалы и методы. Для выделения хитинового скелета образцы морских губок Aplysina fulva, Aplysina aerophoba и Ianthella basta, подвергали ступенчатой обработке, как описано в работе [3]. Перед заселением клетками деминерализованные скелеты морских губок разрезали на фрагменты 442 мм. Полученные носители на сутки помещали в 70% этиловый спирт, после чего тщательно промывали раствором Хенкса. Заселение скаффолдов клетками проводили с использованием перфузионного метода, ранее разработанного в нашей лаборатории [1].

В работе использовали МСК жировой ткани человека 57-го пассажей, полученные после письменного согласия взрослых доноров с соблюдением норм комиссии по биоэтике ИПКиК НАН Украины.

Культивирование клеток проводили в среде -MEM (Sigma, США), дополненной 10% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота (РАА, Австрия), 2 мМ Lглютамина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при 37оС, 5 % СО2 и 95% влажности.

Е.Ю. Рогульская, В.В. Муценко, Е.Б. Ревенко и др.

Прижизненные микроскопические наблюдения, микрофотосъемку, а также анализ окрашенных азур-эозином препаратов культур клеток выполняли с использованием инвертированного микроскопа CETI (Бельгия), снабженного цифровой камерой Nikon CoolPix 4500.

Метаболическую и пролиферативную активность клеток в составе носителей на основе скелета морских губок оценивали с использованием Redox индикаторов Alamar Blue и МТТ.

Для индукции остеогенеза применяли среду -МЕМ, содержавшую 10% ЭС, 0,1 мкМ дексаметазона, 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глицерол-фосфата. Остеогенез выявляли по экспрессии щелочной фосфатазы с использованием набора Fast Blue RR Salt, Naphtol AS-MX Phosphate Alkaline Solution kit № 85 (Sigma-Aldrich) согласно инструкции производителя.

Индукцию адипогенеза проводили в среде -МЕМ, содержащей 0.5 мM 3-изобутил-1метил-ксантин, 1 мкM дексаметазон (Sigma-Aldrich), 10 мкг/мл инсулин, и 100 мкM индометацин (Sigma-Aldrich). Адипогенную дифференцировку клеток определяли по накоплению внутриклеточных нейтральных липидов, которые позитивно окрашивались Oil Red O.

Все количественные характеристики представлены в виде среднее значение ± стандартное отклонение. Для оценки различий между группами использовался t-критерий Стьюдента, достоверно отличными считали результаты при р 0,05.

Результаты и их обсуждение. Матрицы, полученные после деминерализации и очистки скелетов морских губок, представляли собой прозрачную сетчатую структуру из хитиновых поперечно-сшитых фибрилл (рис. 1).

После заселения МСК жировой ткани человека прикреплялись и распластывались на поверхности хитиновых тяжей A. fulva (рис. 2А) и A. аerophoba (рис. 2Б), равномерно распределяясь в губках от периферии к центру. При культивирования в составе матриц на основе скелета I. basta МСК активно делились, постепенно заполняя все свободное пространство между тяжами. Через 2,5-3 недели на поверхности скаффолда формировался непрерывный клеточный слой (рис. 2В).

Определение метаболической активности клеток после заселения носителей показало, что в первые сутки культивирования уровни восстановления редокс-индикатора Аlamar Blue в губках A. fulva и A. aerophoba не различались (рис. 3) и были на 25-30% ниже показателей матриц на основе I. basta. При последующем культивировании МСК в составе губок A. fulva интенсивность флюоресценции продукта восстановления АВ возрастала, а при Культивирование и дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в носителях… культивировании в составе в губок A. аerophoba и I. basta не изменялась. Учитывая, что АВ является интегральным показателем активности окислительно-восстановительных ферментов, постоянный высокий уровень его восстановления свидетельствует о сохранении клетками своей метаболической активности и способности к пролиферации при культивировании в составе хитиновых скелетов морских губок.

Следует отметить, что при длительном культивировании носители на основе деминерализованного скелета губки A. aerophoba распадались на отдельные тяжи, были рыхлыми и нестабильными. В связи с этим дальнейшие исследования были проведены на хитиновых матрицах A. fulva и I. basta.

Для визуализации локализации клеток на 14-е сутки культивирования использовали МТТ-тест. Установлено, что структура губок позволяла МСК равномерно распределяться во всем объеме носителей, а интенсивное накопление кристаллов формазана свидетельствовало о жизнеспособности и метаболической активности клеток в составе исследуемых матриц (рис. 4).

Для индукции адипогенной и остеогенной дифференцировки МСК жировой ткани после 7 суток культивирования в губках, переносили в среды, содержащие специфичные факторы, стимулирующие адипо- и остеогенез, соответственно. Через 3 недели индукции адипогенной дифференцировки наблюдалось накопление нейтральных внутриклеточных липидов (рис. 5), которые позитивно окрашивались раствором Oil Red O. При культивировании в остеогенной среде в данных условиях большинство клеток были позитивны по окрашиванию на щелочную фосфатазу (рис. 6), которая является ранним маркером остеогенеза. Спонтанной дифференцировки через 21 сутки культивирования в среде -MEM с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота обнаружено не было.





Таким образом, матрицы на основе скелета морских губок отряда Verongida способствуют адгезии и пролиферации МСК жировой ткани человека. Кроме того, клетки сохраняют свою способность вступать в направленную дифференцировку в остеогенном и адипогенном направлениях, что открывает широкие перспективы использования хитиновых скелетов губок для создания новых биосовместимых и функционально активных биоинженерных конструкций.

Список использованной литературы

1. Петренко Ю.А., Иванов Р.В., Лозинский В.И., Петренко А.Ю. Сравнительное исследование методов заселения широкопористых носителей на основе альгинатного криогеля мезенхимальными стромальными клетками костного мозга человека//Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2010. - №4. – С. 225-228 Е.Ю. Рогульская, В.В. Муценко, Е.Б. Ревенко и др.

2. Ehrlich H. Biological Materials of Marine Origin. Invertebrates. - Springer Science+Business Media B.V., 2010. – 569 p.

3. Ehrlich H., Ilan M., Maldonado M. et al. Three-dimensional chitin-based scaffolds from Verongida sponges (Demospongiae: Porifera). Part I. Isolation and identification of chitin// International Journal of Biological Macromolecules. – 2010. – V. 47. – P. 132–140

4. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering. Science. – 1993. –V.260. – P. 920–926.

5. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells//Science.- 1999. – V.284. – P.143–147.

6. Shoichet M.S. Polymer scaffolds for biomaterials applications// Macromolecules. - 2010. – V.43. – P. 581–591.

7. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Mol. Biol. Cell. – 2002. – V.13, № 12. – P. 4279–4295.

А Б Рис. 1. Внешний вид губок до и после процедуры деминерализации: А – морская губка Aplysina fulva, Б – морская губка Ianthella basta

–  –  –

Культивирование и дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в носителях… Рис. 3. Метаболическая активность МСК при культивировании в составе хитиновых скелетов губок A. fulva, A. aerophoba и I. basta, оцененная по уровню восстановления АВ (* – р 0,05 по отношению к первым суткам, # – p 0,05 по отношению к A. fulva и A. aerophoba).

Рис. 4. Распределение МСК в носителе на основе скелета морских губок через 14 суток культивирования: А – A. fulva, Б – I. basta. МТТ-тест, 10.

–  –  –

Рис. 5. Адипогенная дифференцировка МСК, культивированных в составе деминерализованного скелета морских губок: А – срез носителя на основе A. fulva, Б – матрица на основе скелета I. basta. Окрашивание Oil Red O.

Рис. 6. Остеогенная дифференцировка МСК, культивированных в составе деминерализованного скелета морских губок: А – срез носителя на основе A. fulva с дифференцированными клетками, Б – клетки, экспрессирующие щелочную фосфатазу в матрице на основе скелета I. basta. Окрашивание набором Fast Blue RR Salt.





Похожие работы:

«Научно-исследовательская работа Тема работы: «Исследование влияния почвы из различных районов г. Белово на рост и развитие растений»Выполнил: Мудриченко Михаил Сергеевич учащийся 7 «А» класса МБОУ СОШ №32 г. Белово Руководитель: Законнова Людмила Ивановна доктор биологических наук,...»

«Итоговая контрольная работа по биологии “Растения” 6 класс 1 вариант Инструкция для учащихся Тест состоит из частей А и В. Задания рекомендуется выполнять по порядку, не пропуская ни одного, даже самого лёгкого. Если задание не удаётся выпо...»

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ СИСТЕМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ А.М. Адам К.В. Торопов ПТИЦЫ ЮЖНОТАЕЖНОЙ ПОЙМЫ ОБИ Ответственные редакторы: д-р биол. наук, профессор Ю.С. Равкин, д-р биол. наук, профессор Н.С....»

«ЧАСТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «РУССКАЯ ХРИСТИАНСКАЯ ГУМАНИТАРНАЯ АКАДЕМИЯ» ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ ПСИХОЛОГИЯ РЕЛИГИИ ОСНОВНАЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА ПОДГОТОВКИ БАКАЛАВРА по направлению 47.04.03 РЕЛИГИОВЕДЕНИЕ Квалификация (степень) выпускника БАКАЛАВР Утверждено н...»

«Образовательный портал «РЕШУ ЕГЭ» (https://bio-ege.sdamgia.ru) Вариант № 396496 МИОО: Диагностическая работа по биологии 03.04.2014 вариант БИ10801.1. Процесс «трансляции» наследственной информации происходит на уровне орг...»

«http://www.izdatgeo.ru Геология и геофизика, 2009, т. 50, № 4, с. 341–362 УДК 553.982+553.046 О СТРАТЕГИИ ОЧЕРЕДНОГО ЭТАПА НЕФТЕПОИСКОВЫХ РАБОТ В ПРИКАСПИЙСКОЙ НЕФТЕГАЗОНОСНОЙ ПРОВИНЦИИ Ю.А. Волож, А.Н. Дмитриевский*, Ю.Г. Леонов, Н.В. Милетенко**, Л.И. Ровнин*** Геологический институт РАН, 119017, Москва, Пыжевский пер., 7, Ро...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра микробиологии Методические рекомендации к практическим занятиям для преподавателей ИГМУ по теме: «Иммунитет » Иркутск – 2010г.Методиче...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.