WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«Игорь Степанович Брюховецкий1, Полина Викторовна Мищенко2,  Юрий Степанович Хотимченко3, Андрей Степанович Брюховецкий4 ОБОСНОВАНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO ФЕНОМЕНА НАПРАВЛЕННОЙ МИГРАЦИИ ...»

Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 25, №1—2, 2014

Игорь Степанович Брюховецкий1, Полина Викторовна Мищенко2, 

Юрий Степанович Хотимченко3, Андрей Степанович Брюховецкий4

ОБОСНОВАНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO ФЕНОМЕНА

НАПРАВЛЕННОЙ МИГРАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ

И ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ВЗРОСЛЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

К КЛЕТКАМ КРЫСИНОЙ ГЛИОМЫ ЛИНИИ C6

 К. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной нейробиологии,   Школа биомедицины ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет»   (690091, РФ, г. Владивосток, ул. Суханова, д. 8); научный сотрудник, лаборатория фармакологии   ФГБУН «Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского» ДВО РАН   (690041, РФ, г. Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17)  Аспирант, лаборатория фармакологии, ФГБУН «Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского»   ДВО РАН (690041, РФ, г. Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17)  Д. б. н., профессор, директор, Школа биомедицины   ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет»   (690091, РФ, г. Владивосток, ул. Суханова, д. 8)  Д. м. н, профессор, генеральный директор, ЗАО «Клиника восстановительной   и интервенционной неврологии и терапии “Нейровита”»   (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 23); руководитель, Центр биомедицинских технологий   ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской   помощи и медицинских технологий» ФМБА России   (115682, РФ, г.


 Москва, Ореховый бульвар, д. 28) Адрес для переписки: 690091, РФ, г. Владивосток, ул. Суханова, д. 8, Школа биомедицины ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет», лаборатория молекулярной и клеточной нейробиологии, Брюховецкий Игорь Степанович; e-mail: bruhovetsky@mail.ru Мультиформная глиобластома — наиболее распространенная первичная высокоинвазивная злокачественная опухоль центральной нервной системы. Прогноз крайне неблагоприятный. Медиана продолжительности жизни больных после хирургической резекции, облучения и химиотерапии не превышает 12—15 мес, что обусловливает необходимость поиска новых подходов к лечению заболевания.

Феномен направленной миграции стволовых клеток в опухолевый очаг открывает новые перспективы для создания технологий адресной доставки лекарственных веществ и других терапевтических средств непосредственно в опухолевый очаг. Гемопоэтические стволовые клетки CD34+/CD133+ обладают большим репаративным потенциалом и инертны по отношению к нормальной нервной ткани. Цель работы — подтвердить способность взрослых предшественников гемопоэза к направленной миграции к клеткам глиомы. В опытах использовали линию глиомы C6, культуру гемопоэтических стволовых клеток CD34+/CD133+, первичные культуры астроцитов и фибробластов крысы. Клетки культивировали в течение 5 дней. Эксперимент позволил обнаружить формирование клеточного вала гемопоэтическими стволовыми клетками по периметру культуральной вставки, содержавшей культуру глиомы. Такую картину не наблюдали в лунках с культурами фибробластов и астроцитов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гемопоэтические стволовые клетки обладают высоким потенциалом направленной миграции к клеткам глиомы линии C6; это позволяет рассматривать их в качестве перспективной линии для разработки новых противоопухолевых биомедицинских технологий и проливает свет на ранее не известные аспекты канцерогенеза глиальных опухолей.





Ключевые слова: мультиформная глиобластома, глиома линии C6, гемопоэтические стволовые клетки, нейральные стволовые клетки.

Мультиформная глиобластома — наиболее распро- должительности жизни больных после хирургической страненная первичная глиальная высокоинвазивная резекции, облучения и химиотерапии не превышает злокачественная опухоль центральной нервной системы 12—15 мес [1—3]. Опухоль характеризуется инвазивным с крайне неблагоприятным прогнозом. Медиана про- ростом, выраженной инфильтрацией вещества мозга и

Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 25, №1—2, 2014

1 106 опухолевых клеток, размораживали в течение высокой резистентностью к лучевой и лекарственной терапии, что обусловливает необходимость поиска новых 10 мин при температуре 37°C, отмывали от DMSO среподходов к лечению заболевания [4]. дой DMEM (Gibco®), содержащей FBS (10%) и антибиоВ последние годы в центре внимания исследовате- тик-антимикотик (10 000 ЕД/мл). Клетки осаждали ценлей оказался феномен направленной миграции ней- трифугированием и высаживали в 50-миллиметровые ральных стволовых и прогениторных клеток в опухо- культуральные матрасы. Культивирование продолжали левый очаг, открывающий широкие перспективы для до образования монослоя. После этого клетки снимали адресной доставки в опухоль лекарственных молекул, ферментативной диссоциацией (0,05% раствор трипсиспецифических генов, антител и других терапевтиче- на-ЭДТА, 1:4, 10 мин, 37°C), центрифугировали (120 g, ских средств [5—9]. Особую актуальность приобретает 6 мин), супернатант сливали. Опухолеродность испольпроблема выбора оптимальных клеточных линий, без- зуемой в эксперименте клеточной линии глиомы С6 проверяли посредством имплантации 0,5 106 клеток глиомы опасных для трансплантации, поскольку использование собственных нейральных стволовых клеток нейроонко- линии C6 в головной мозг половозрелых крыс с помощью логического больного сопряжено с высоким риском их стереотаксического аппарата (David Kopf Instruments) по неопластической трансформации [10—12]. методике, описанной Карен Эбоди [5].

Как мы полагаем, альтернативой могут стать гемоВыделение первичной культуры фибробластов крысы поэтические стволовые клетки (ГСК) CD34+/CD133+, получение и хранение которых не представляет больших Для получения первичной культуры фибробластов технических сложностей, а применение не сопряжено использовали крысиные 12-дневные эмбрионы. Самку с этическими и юридическими ограничениями. Кроме крысы глубоко наркотизировали эфиром, тело протитого, эти клетки уже более полувека успешно использу- рали спиртом. В стерильных условиях вскрывали брюшются для лечения онкологических больных [13]. ную полость, из рогов матки вынимали эмбрионы и поВнимание ученых сосредоточено также на нейраль- мещали их в раствор Хенкса с добавлением антибиотика.

ных стволовых и прогениторных клетках головного моз- У эмбриона удаляли конечности, голову и внутренние орга человека как на наиболее вероятном источнике про- ганы. Оставшуюся массу измельчали ножницами на маисхождения злокачественных глиом [5; 14—16]. В свою ленькие кусочки и подвергали ферментной диссоциации очередь, способность клеток — предшественников гемо- (0,25% трипсин, 40 мин, 37°C). Клетки осаждали центрипоэза взрослых млекопитающих и человека направленно фугированием (1000 g, 5 мин). Осадок ресуспендировали мигрировать в неопластический очаг открывает принци- в полной среде DMEM/F12, HEPES (Gibco®), содержащей пиально новые аспекты процессов канцерогенеза в го- 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 0,8% глюкозы, 0,2 ед/мл инсуловном мозге. лина и антибиотик-антимикотик (10 000 ЕД/мл).

Цель настоящей работы состояла в получении эксВыделение первичной культуры астроцитов крысы периментальных доказательств способности клеток — предшественников гемопоэза взрослых млекопитающих Для работы использовали новорожденных белых к направленной миграции к клеткам крысиной глиомы крыс. Животных глубоко наркотизировали, в стерильлинии C6 при совместном культивировании. ных условиях отделяли голову, вскрывали череп, мозг вынимали и помещали в чашку Петри с раствором Хенкса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОдЫ Затем выделяли кору больших полушарий, очищали ее ГСК крысы от сосудистых оболочек, нарезали ножницами на мелКультура крысиных ГСК предоставлена АНО кие кусочки, отмывали 2 раза раствором Хенкса и подНациональный институт регенеративной медицины» вергали ферментативной диссоциации 0,05% раствором (Москва). Фенотип и чистоту клеточной популяции ха- трипсина-ЭДТА в течение 10 мин при температуре 37°C.

рактеризовали на проточном цитофлуориметре Becton Ферментативную диссоциацию останавливали добавлеDickinson FACScan с использованием anti-CD34/anti- нием 5% FBS (в растворе Хенкса). Клеточную суспензию CD133 FITC-conj-Mab. Перед внесением в сочетанную осаждали центрифугированием и ресуспендировали в культуру клетки окрашивали флюоресцентным мар- полной среде (DMEM/F12 (90%), FCS (10%), L-глутамин кером Vybrant® CFDA SE Cell Tracer (Life Technologies, (2 мМ), глюкоза (0,8%), инсулин (0,2 ед/мл), HEPES V12883) в соответствии с рекомендациями производи- (25 мМ), антибиотик-антимикотик (10 000 ЕД/мл)).

теля.

Создание совместных культур Культура клеток глиомы линии C6 Для создания совместных культур использовали кульПо данным литературы, культура крысиной глиомы туральные вставки (Millipore) диаметром 12 мм с порами линии C6 по характеру поражения вещества мозга со- размером 0,4 мкм. Дно лунок 12-луночного культуральответствует мультиформной глиобластоме человека [17; ного планшета покрывали полиэтиленимином (Gibco®), а 18]. Линия глиомы C6 для проведения эксперимента затем ламинином (Gibco®). После этого в каждую лунку предоставлена Школой биомедицины Дальневосточного планшета помещали культуральную вставку, которую федерального университета. Аликвоту, содержавшую иммобилизовали каплей стерильного парафина. Внутрь культуральной вставки вносили по 0,5 106 опухолевых клеток, нормальных астроцитов и фибробластов. Одну © Брюховецкий И. С., Мищенко П. В., Хотимченко Ю. С., из вставок оставляли пустой (рис. 1, А). Планшет с кульБрюховецкий А. С., 2014 туральными вставками инкубировали в течение 24 ч, УДК 616-006.484-092.9:611.018.46

–  –  –

В Г Д Е Рисунок 2. Характеристика ГСК и неопластических клеток глиомы линии C6.

А. ГСК в культуре, фазовый контраст (20). Б. Флюоресценция ГСК, окрашенных Vybrant® CFDA SE Cell Tracer непосредственно перед внесением в культуру (10). В. Неопластические клетки крысиной глиомы линии C6: клетки различной формы и размера на 3-й день культивирования активно распластываются по поверхности, формируя многочисленные отростки; отчетливо видны многоядерные клетки. Инвертированная микроскопия (32). Г. Неопластические клетки глиомы линии C6 окрашены anti-GFAP Mab, ядра докрашены DAPI (100). Д. Препарат мозга крысы через 6 дней после имплантации клеток глиомы линии C6. Е. Магнитно-резонансная томограмма мозга крысы через 7 дней после имплантации клеток глиомы линии C6, T2-взвешенное изображение: видны признаки сдавления желудочков мозга, отека и дислокации срединных мозговых структур.

–  –  –

В Г Д Е Ж Рисунок 3. Характеристика клеточных линий контрольных культур фибробластов и астроцитов и реакция различных клеточных линий на совместное культивирование с клетками глиомы в ходе эксперимента.

А. Фибробласты крысы, окраска гематоксилином и эозином (40). Б. Фибробласт крысы: фагоцитоз коллагена, иммобилизованного на поверхности флюоресцирующих микрочастиц FluoSpheres® Collagen I-Labeled Microspheres (630). В. Астроциты крысы при окраске anti-GFAP Mab, ядра докрашены DAPI (200). Г. Астроцит крысы при окраске anti-GFAP Mab (200). Д. Формирование ГСК, окрашенными Vybrant® CFDA SE Cell Tracer, флюоресцирующего клеточного вала по периметру культуральной вставки, содержащей клетки глиомы (10). Е. Культура ГСК и фибробластов крысы: формирования клеточного вала не происходит (10). Ж. Культура ГСК и астроцитов крысы: формирования клеточного вала не происходит (10).

тов и факторов роста и не менее 20 типов рецепторов, ных клеток, или хемокина CXCL12 подсемейства CXC, управляющих процессами миграции и хоуминга ГСК. закодированного у человека геном CXCL12. SDF-1a Доказана первостепенная роль в этом процессе SDF- связывается с рецепторами CXCR4 и CXCR7 мембраны 1a (stromal cell-derived factor-1a), или фактора стромаль- стволовых клеток и вовлекает их в миграционный проВестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 25, №1—2, 2014 Igor Stepanovich Bryukhovetsky1, Polina Victorovna Mischenko2,  Yury Stepanovich Khotimchenko3, Andrey Stepanovich Bryukhovetsky4

DIRECTED MIGRATION OF ADULT HEMOPOIETIC PROGENITOR CELLS

TOWARDS C6 RAT GLIOMA IN VITRO

 MD, PhD, Senior Researcher, Molecular and Cellular Neurobiology Laboratory, School of Biomedicine,   Far Eastern Federal University (8, Sukhanova ul.,Vladivostok, RF, 690091);   Researcher, Laboratory of Pharmacology, A. V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS   (17, Palchevskogo ul., Vladivostok, RF, 690041)  Postgraduate Student, Laboratory of Pharmacology, A. V. Zhirmunski Institute of Marine Biology,  

–  –  –

and Therapy Clinic (23, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478 );   Head, Center of Biomedical Technologies, Federal Research and Clinical Center for Specialized   Medical Care and Health Technologies, FMBA (28, Orehovy Bulvar, Moscow, RF, 115682)

–  –  –

Glioblastoma multiforme is the most common, highly invasive, primary malignant tumor of the central nervous system with an extremely poor prognosis. Median survival of patients after surgical resection, radiation, and chemotherapy is not more than 12 to 15 months, and new approaches to the treatment of the disease are therefore needed.

The observed directed migration of stem cells to the tumor center opens the opportunity for targeted delivery of therapeutic agents directly to the brain tumor. Hematopoietic CD34+/CD133+ stem cells have a great reparative potential and are inert to normal neural tissue. The purpose of this study was to demonstrate experimentally the directed migration of adult hematopoietic progenitor cells towards glioma. We used C6 glioma line, culture of hematopoietic CD34+/CD133+ stem cells, primary cultures of rat astrocytes and fibroblasts. The cells were cultured for 5 days. Hemopoietic cells formed a cell shaft on the perimeter of the glioma-containing culture insert. This phenomenon was not observed in the fibroblast and astrocyte culture.

The conclusion may be made that hematopoietic stem cells have a high potential for directional migration towards C6 glioma cells, and may therefore be a promising candidates for the development of new anticancer biomedical technologies.

Key words: glioblastoma multiforme, glioma C6, hematopoietic stem cells, neural stem cells.



Похожие работы:

«06.03.2003 № 5/12040 РАЗДЕЛ ПЯТЫЙ ПОСТАНОВЛЕНИЯ ПРАВИТЕЛЬСТВА РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ И РАСПОРЯЖЕНИЯ ПРЕМЬЕР МИНИСТРА РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ПОСТАНОВЛЕНИЕ СОВЕТА МИНИСТРОВ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ 22 февраля 2003 г. № 227 5/12040 Об утве...»

«Модернизация муниципальной и экологической инфраструктуры в Казахстане Одним из важных направлений деятельности ЕБРР по финансированию проектов является инфраструктура как фактор развития экономики и улучшения качества жизни. Будь то оказание помощи в совершенствовании систем водоснабжения, сбора и удаления отходов, отопления или общест...»

«С.Л. Загускин (д.б.н.) ЗДОРОВЬЕ ЭТО ГАРМОНИЯ БИОРИТМОВ г. Ростов-на-Дону, НИИ физики, Южный Федеральный университет Человек обычно задумывается о своем здоровье только когда заболеет. Болезнь, однако, легче предупредить, ч...»

«(из Н.М. Сланевская «Мозг, мышление и общество», часть 2, Санкт-Петербург, Центр Междисциплинарной нейронауки, 2012, стр.180-207) 6.7. Нейросоциология. Нейросоциология (Neurosociology) – это междисциплинарная область нейронауки и социологии, изучающая то, как биологические системы осуществляют социальные процессы и поведенческие акты и создаю...»

«Yestestvennye Nauki (Natural Sciences), 2013, 1 (42) Cultivation, Breeding and Genetics of Annimals УДК 636.3.043 РАЗРАБОТКА НОРМ КОРМЛЕНИЯ СТЕРЛЯДИ ПРОДУКЦИОННЫМ КОМБИКОРМОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНОЙ МОДЕЛИ МАССОНАКОПЛЕНИЯ Наталья Васильевна Сорокина, научный сотр...»

«УДК 631.333.93 ВЛИЯНИЕ АКТИВНОЙ АЭРАЦИИ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОТЕКАНИЯ БИОТЕРМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КОМПОСТИРУЕМОЙ СМЕСИ В.В. Миронов, В.Д. Хмыров Мичуринский государственный аграрный университет Представлена членом редколлегии профессором В.И. Коноваловым Ключевые слова и фразы: активная аэрация; бурт; компост; удобрения...»

«ЭТОТ ДОКЛАД ПОДГОТОВЛЕН В СОТРУДНИЧЕСТВЕ С: ДОКЛАД IN T Живая планета Виды и территории, люди и места WWF Всемирный фонд дикой природы (WWF) — одна из крупнейших в мире и наиболее опытн...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный университет им. А.М. Горького» ИОНЦ «Физика в биологии и медицине» Би...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Воспитание экологической культуры актуальнейшая задача сложившейся социальнокультурной ситуации начала XXI века. Актуальность. В условиях разностороннего глубочайшего экологического кризиса 1. усиливается значение экологичес...»

«Мякинников Сергей Петрович К ПОСТАНОВКЕ ПРОБЛЕМЫ ЦЕЛОСТНОЙ КАРТИНЫ МИРА В ЦЕЛЯХ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МИРОВОЗЗРЕНИЯ В статье осуществлен краткий обзор основных точек зрения по проблеме разновидностей картины мира. Рассмотр...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.