WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |

«Медицинская микробиология Новиков Д.К., Генералов И.И., Данющенкова Н.М. и др. Витебск, 2010 Кафедра клинической микробиологии Версия неполная и неофициальная. Права на ...»

-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКОЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Медицинская микробиология

Новиков Д.К., Генералов И.И., Данющенкова Н.М. и др.

Витебск, 2010

Кафедра клинической микробиологии

Версия неполная и неофициальная.

Права на текст принадлежат его авторам.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РАЗДЕЛ I. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

I. МИКРОБИОЛОГИЯ И ЕЕ РАЗВИТИЕ

(Н.В. Железняк)

II. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

(Н.М. Данющенкова, И.И. Генералов)

2.1. Систематика и номенклатура микроорганизмов 21

2.2. Структура бактериальной клетки и химический состав микроорганизмов 27

2.3. Формы бактерий 34

2.4. Морфология спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм, грибов, актиномицетов 36

III. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

(Н.М. Данющенкова)

3.1. Метаболизм 42

3.2. Источники углерода и типы питания 42

3.3. Источники энергии и доноры электронов 43

3.4. Факторы роста 43

3.5. Транспорт питательных веществ и механизм питания 43

3.6. Ферменты бактерий 44

3.7. Дыхание микроорганизмов 45

3.8. Рост и размножение бактерий 48



3.9. Питательные среды, их классификация 50

IV. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ

(Н.М. Данющенкова)

4.1. Классификация вирусов 52

4.2. Строение вирусов 55

4.3. Взаимодействие вируса с клеткой

4.4. Культивирование и индикация вирусов 61

4.5. Бактериофаги 63

V. ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

(И.И. Генералов)

5.1. Особенности генетики микроорганизмов 68

5.2. Организация генетического аппарата микроорганизмов 69

5.3. Внехромосомные факторы наследственности (плазмиды и эписомы) 72

5.4. Инсерционные (Is) последовательности и транспозоны 76

5.5. Изменчивость микроорганизмов 77

5.6. Фенотипическая изменчивость 77

5.7. Генотипическая изменчивость 78 5.7.1. Мутации 78 5.7.2. Диссоциация 81 5.7.3. Репарации 81

5.8. Рекомбинационная (комбинативная) изменчивость 83 5.8.1. Трансформация 84 5.8.2. Трансдукция 86 5.8.3. Конъюгац

–  –  –

РАЗДЕЛ III. ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ ПО

МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

РАЗДЕЛ IV. СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

РАЗДЕЛ V. КОНТРОЛЬНЫЕ ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ПО

МЕДИЦИНСКОЙ БАКТЕРИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ,

ИММУНОЛОГИИ

РАЗДЕЛ VI. ИЛЛЮСТРАЦИИ: РИСУНКИ И СХЕМЫ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АГ – антиген(ы);

АДФ – аденозиндифосфат АКДС – адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина цАМФ – циклический 3`-5`-аденозинмонофосфат АТ – антитело(а) АДФ – аденозиндифосфат АТФ – аденозинтрифосфорная кислота БГКП – бактерии группы кишечной палочки ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВИЭФ – встречный иммуноэлектрофорез ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ЖСА – желточно-солевой агар ИЛ – интерлейкин(ы) ИФА – иммуноферментный анализ КОЕ – колониеобразующие единицы КУА – казеиново-угольный агар ЛПС – липополисахарид МБК – минимальная бактерицидная концентрация МЖСА – молочно-желточно-солевой агар МИК – минимальная ингибирующая концентрация МПА – мясо-пептонный агар МПБ – мясо-пептонный бульон МПК – минимальная подавляющая концентрация ПАБК – пара-аминобензойная кислота ПАВ – поверхностно-активные вещества ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЧЗТ – повышенная чувствительность замедленного типа РА – реакция агглютинации РИФ – реакция иммунной флюоресценции РПГА – реакция пассивной гемагглютинации РСК – реакция связывания комплемента РТ – ретикулярные тельца РТГА – реакция торможения гемагглютинации СПИД – синдром приобретенного иммунного дефицита СПМ – cанитарно-показательные микроорганизмы ХТИ – химиотерапевтический индекс ЦНС – центральная нервная система ЦПМ – цитоплазматическая мембрана ЭПКП – энтеропатогенные кишечные палочки ЭТ – элементарные тельца

–  –  –

Микробиология выделилась в самостоятельную научную дисциплину из породившей ее науки биологии. Любая отрасль знаний лишь тогда может считаться наукой, когда она имеет свой предмет изучения и свои, присущие ей, методы исследования. Предметом изучения микробиологии является особый мир существ, невидимых невооруженным глазом, величина которых колеблется от нескольких нм до 0.1-1 мм. Отсюда возникло и название науки «Микробиология», которое состоит из сочетания греческих слов micros - малый, bios - жизнь, logos - учение.

Таким образом микробиология является наукой, изучающей жизнь и развитие мельчайших организмов – микроорганизмов – в их единстве со средой обитания.

В связи с той огромной ролью, которую микроорганизмы играют в природе, задачи микробиологии весьма многообразны. Происходит постоянная дифференциация ее на самостоятельные научные разделы и дисциплины. В настоящее время самостоятельное значение имеют общая микробиология – изучает общие закономерности функционирования микроорганизмов, промышленная микробиология – важнейший раздел современной биотехнологии, сельскохозяйственная микробиология, космическая микробиология, санитарная микробиология, ветеринарная микробиология и медицинская микробиология.

Предмет медицинской микробиологии – это болезнетворные (патогенные) микроорганизмы, вызывающие заболевания у человека, а также непатогенные микроорганизмы, находящиеся в организме человека и в окружающей среде и имеющие значение для его здоровья.

Задачи медицинской микробиологии:

- диагностика с помощью микробиологических методов инфекционных заболеваний, носительства, обнаружение патогенных возбудителей в организме и во внешней среде;

- санитарно-бактериологический контроль микробного загрязнения пищевых продуктов, лекарственного сырья, воды, почвы, помещений и других объектов;

- разработка специфических препаратов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

В своем развитии микробиология прошла длительный и сложный, но весьма успешный и плодотворный путь.

Начиная с ранних этапов становления науки, врачи и естествоиспытатели стремились выяснить причины инфекционных болезней. Еще древние ученые Гиппократ, Лукреций, Плиний, Гален высказывали гипотезы о живой природе возбудителей заразных заболеваний. Авиценна считал, что причиной возникновения заразных болезней являются невидимые глазом мельчайшие живые существа, передающиеся через воду и воздух.

Голландский ученый А. Левенгук (1632-1723) был первым, кто увидел и описал микробы. С помощью простой лупы, дающей увеличение в 160-300 раз, он наблюдал простейших, эритроциты, сперматозоиды. В 1678 г. А. Левенгук опубликовал письма об animalcula viva – «живых зверьках», которых он обнаружил в воде, различных настоях, испражнениях, зубном налете и зарисовал. В 1695 г. им издан труд «Тайны природы, открытые Антонием Левенгуком». Этот период был чисто морфологическим, т.к. описывались лишь общая форма микроорганизмов.

Русский врач Д.С. Самойлович (1742-1810) высказал мысль о том, что «...чума вызывается особливым и совсем отменным существом». Наблюдая за чумой, он пришел к выводу, что для предупреждения заболеваний следует вводить в организм ослабленное заразное начало. Для доказательства правильности своего предположения, Самойлович самоотверженно произвел опаснейший опыт, привив себе в 1771 г.

заразный материал, взятый от человека, выздоравливающего от бубонной формы чумы. Одна из главных научных заслуг Д.С. Самойловича – идея о возможности создания искусственного иммунитета против чумы с помощью прививок. За глубокое изучение вопросов борьбы с чумой Д.С. Самойлович был избран почетным членом 12 западноевропейских академий наук.

В это же время (конец 18 – начало 19 в.в.) английский врач Э. Дженнер опубликовал свои наблюдения о результатах прививок против оспы. Он доказал, что прививки людям коровьей оспы предохраняют их от заражения натуральной оспой. Открытие Э. Дженнера вооружило медицину могущественным средством для успешной борьбы с этой болезнью.





В первой половине XIX века были выявлены первые микроорганизмы – возбудители инфекционных заболеваний. В 1839 г. И. Шенлейн установил, что фавус (парша) вызывается болезнетворным грибом, в 1843 г. Д. Гурби обнаружил возбудителя трихофитии (стригущего лишая), в 1849-1854 гг. А. Поллендером, К. Давеном и Ф.А. Брауэллем был описан возбудитель сибирской язвы.

Во второй половине XIX века появились более усовершенствованные микроскопы, намного улучшилась техника микроскопирования. В изучении микроорганизмов стали уделять внимание биохимическим процессам – способности микробов ферментировать органические вещества.

Второй период развития микробиологии как самостоятельной биологической науки связан с именем гениального французского ученого, химика и микробиолога Л.

Пастера (1822-1895). Л. Пастер установил, что процессы брожения вызываются микроорганизмами, причем каждый вид брожения – определенным видом. Им было выяснено, что гниение – результат жизнедеятельности микроорганизмов. Большое значение имели работы Пастера о болезнях вина и пива, шелковичных червей, вызванных микроорганизмами. Он предложил и метод их предупреждения, названный позднее «пастеризацией» (прогревание при 600С).

Исследования Пастера о возбудителях куриной холеры, сибирской язвы, бешенства положили начало применению прививок.

Л. Пастер разработал методику исследований, обеспечивающую предохранение питательных сред от попадания в них микробов.

Благодаря открытиям Пастера хирургия обогатилась совершенными методами борьбы с нагноительными процессами ран. Английский хирург Д. Листер ввел в хирургию принцип антисептики (обеззараживание ран химическими дезинфицирующими веществами).

Большое значение в развитии медицинской микробиологии имели открытия немецкого ученого Р. Коха (1843-1910), который обогатил микробиологию более совершенными методами исследования. Им и его учениками в практику лабораторной техники были введены плотные питательные среды (картофель, желатин, свернутая сыворотка, мясопептонный агар), анилиновые красители, иммерсионная система, микрофотографирование, методика исследования микробов в живом виде, известная под названием «висячая капля».

Р. Кох произвел подробное исследование раневых инфекций, разработал способ выделения в чистой культуре патогенных бактерий. Исследования специфических возбудителей позволили ему экспериментально подтвердить критерии развития инфекционных болезней, ранее сформулированные Генле.

В настоящее время они известны как «триада Генле-Коха»:

Должен быть обнаружен микроорганизм в каждом случае конкретного инфекционного заболевания.

Такой микроорганизм не выявляется при других болезнях как случайный и непатогенный паразит.

После изоляции из организма больного и выделения чистой культуры патогенный микроорганизм должен вызвать аналогичное заболевание у восприимчивого животного.

Эти постулаты позволили конкретизировать инфекционные заболевания, хотя в настоящее время стало ясно, что не все они соответствуют инфекциям человека (в частности пункт 3).

Благодаря усовершенствованию техники и методики микробиологических исследований, Р. Кох окончательно установил этиологию сибирской язвы (1876), открыл возбудителей туберкулеза (1882), холеры (1883) и получил из культур туберкулезных микобактерий туберкулин (туберкулин Коха).

В ходе исторического развития микробиологии возникли и стали бурно развиваться новые биологические науки – иммунология, вирусология, учение об антибиотиках.

Выдающийся русский ученый И.И. Мечников вместе с П. Эрлихом считается основоположником иммунологии. Кроме того, много внимания И.И. Мечников уделял выяснению причин преждевременного старения и борьбе за долголетие человека. Им было заложено начало учения об антагонизме микробов, впоследствии использованного при получении антибиотиков. Совместно с французским микробиологом Э. Ру в 1903 г. И.И. Мечников разработал метод воспроизведения экспериментального сифилиса.

И.И. Мечников был организатором первой в России бактериологической станции в Одессе. Им была создана большая школа микробиологов (Г.Н. Габричевский, А.М.

Безредка, И.Г. Савченко, Л.А. Тарасевич, Н.Ф. Гамалея, Д.К. Заболотный, Н.Я. Чистович и Ф.Я. Чистович).

В 1888 г. французские ученые Э. Ру и А. Иерсен установили, что возбудитель дифтерии продуцирует биологический яд (токсин), и выяснили его значение в развитии болезни. Немецкий ученый Э. Беринг (1890 г.) и японский исследователь С. Китазато путем повторных введений животным небольших доз столбнячного или дифтерийного токсина изготовили соответствующие иммунные сыворотки, предохраняющие животных от смертельного отравления токсинами. Э. Ру в институте Пастера получил противодифтерийную сыворотку и применил ее для лечения детей, больных дифтерией. В России противодифтерийная сыворотка была изготовлена Г.Н. Габричевским в 1894 г.

Эти открытия послужили основой для приготовления лечебных сывороток против ботулизма, газовой анаэробной инфекции, укуса ядовитых змей и др.

Немецкий исследователь П. Эрлих (1854-1915) создал теорию гуморального иммунитета, вокруг которой возникла длительная и упорная борьба мнений, разделившая ученых на два лагеря: сторонников П. Эрлиха и его противников во главе с И.И.

Мечниковым. Эта полемика вызвала бурный поток исследований вопросов иммунитета и привела к большим практическим результатам: были разработаны более совершенные лабораторные методы диагностики инфекционных болезней, получены вакцины против брюшного тифа, холеры, чумы и других болезней. Благодаря широкой дискуссии было установлено, что невосприимчивость к инфекционным заболеваниям зависит как от клеточного, так и от гуморального иммунитета. В 1908 г. за разработку учения об иммунитете И.И. Мечникову и П. Эрлиху была присуждена Нобелевская премия.

12 февраля 1892 г. Д.И. Ивановский на заседании Российской Академии наук сообщил, что возбудителем мозаичной болезни табака является фильтрующийся вирус.

Очень скоро выяснилось, что вирусы вызывают заболевания не только у растений, но и у человека, животных, бактерий.

В ХХ веке были проведены весьма важные исследования в области специфической профилактики заразных болезней. В 1924-1925 гг. Г. Рамон разработал метод изготовления анатоксинов (обезвреженных формалином токсинов), с помощью которых стали успешно проводиться прививки против дифтерии и столбняка. Были получены вакцинные препараты из живых, но ослабленных возбудителей против туберкулеза (А. Кальметт и Ш. Герен, 1919), чумы (Г. Жирар и Ж. Робик, 1931), желтой лихорадки (М. Тейлер, 1936), туляремии (Н.А. Гайский, Б.Я. Эльберт, 1939-1942), полиомиелита (А. Себин, 1954-1958).

Совершенствование уже известных бактериологических методов позволило выделить новые патогенные бактерии – бледную спирохету, лептоспиры, боррелии, риккетсии, хламидии и др. Были открыты фильтрующиеся инфекционные агенты – вирусы, L-формы бактерий, микоплазмы. Более интенсивно развивались прикладные аспекты иммунологии: были разработаны многие диагностические реакции (Вассермана, Видаля, Вейля-Феликса и др.) Второй важной вехой этого периода явились становление и первые сенсационные успехи химиотерапии инфекционных болезней. Ее основные принципы заложили П.Л. Романовский и П. Эрлих, которого считают основоположником химиотерапии.

Первым истинно этиотропным препаратом явился сальварсан – 606-е производное атоксила, изученное Эрлихом. Позднее были синтезированы синтетические аналоги хинина, первые сульфаниламиды и антибиотики.

Создание электронного микроскопа сделало видимым мир вирусов и макромолекулярных соединений. На бактериях О. Эвери, К. Маклеод и М. МакКарти доказали роль ДНК в передаче наследственных признаков. Расшифровка основных принципов кодирования генетической информации в ДНК бактерий, а также универсальность генетического кода бактерий и вирусов позволили установить общие молекулярногенетические закономерности, свойственные высшим организмам. Расшифровка генома кишечной палочки сделала возможными искусственное конструирование генов и пересадку отдельных генов из одних клеток в другие. Исследования в области молекулярной вирусологии показали способность вирусной ДНК встраиваться в геном чувствительной клетки, а также позволили идентифицировать различные вирусы на уровне молекулярной структуры.

Одновременно произошла существенная переоценка классических понятий в иммунологии: возникли представления о структуре и функциях иммунной системы, объединившие концепции инфекционной и неинфекционной иммунологии. Были установлены основные популяции иммунокомпетентных клеток и их функции; выяснены закономерности развития аутоиммунопатологии и иммунологической толерантности. В медицинскую практику прочно вошли понятия об иммунодефицитах и реакциях гиперчувствительности. Восьмидесятые годы XX века завершились окончательным доказательством правоты клонально-селекционной теории генетического контроля иммунных реакций, предложенной Ф. Бернетом в 1957 г.

На пороге XXI века микробиология составляет одно из основных направлений медицины. В настоящее время ежегодно открывают два-три новых вида микроорганизмов. Спектр новых возбудителей достаточно широк и включает вирусы, бактерии, грибы и паразитарные микроорганизмы.

Можно без преувеличения сказать, что в настоящее время нет ни одной медицинской дисциплины, прогрессу которой не способствовали бы открытия в области микробиологии.

Большая заслуга в развитии микробиологии принадлежит российским ученым.

Современник Л. Пастера и И.И. Мечникова Л.С. Ценковский в своих исследованиях указал на сходство бактерий с микроскопическими сине-зелеными водорослями. В 1883 г. он получил высокоэффективную, устойчивую вакцину, которая в течение более 60 лет использовалась для профилактики сибирской язвы среди сельскохозяйственных животных.

В конце XIX века возникла сельскохозяйственная микробиология, основателем которой был С.Н. Виноградский. В 1890 г. он открыл нитрифицирующие бактерии и изучил их значение в круговороте азота в природе.

Большую роль сыграли русские ученые в развитии медицинской протозоологии.

Ф.А. Леш наблюдал в 1875 г. в испражнениях больного дизентерией амебы, которые Ф. Шаудин идентифицировал как Entamoeba coli и Entamoeba histolytica. В 1898 г.

П.Ф. Боровский открыл возбудителя кожного лейшманиоза.

В 1892 г. ближайший сотрудник И.И. Мечникова Н.Ф. Гамалея (1859-1949) обнаружил явление спонтанного растворения микробов, которое, как было установлено Ф. д'Эреллем, обусловлено действием вируса бактерий – бактериофагом.

Под руководством И.И. Мечникова Н.Ф. Гамалея участвовал в создании первой бактериологической станции в России и второй в мире пастеровской станции. Его исследования посвящены изучению инфекции и иммунитета, изменчивости бактерий, профилактике сыпного тифа, оспы, чумы и других болезней.

Деятельность многих русских исследователей характеризуется примерами самопожертвования как в научной, так и в практической работе. Исключительный героизм проявили И.А. Деминский, М.А. Лебедева, В.И. Турчинович-Вижникевич, И.В. Мамонтов и др., которые заразились во время работы по изучению чумы и погибли от этой инфекции.

В 1876 г. Г.Н. Минх и О.О. Мочутковский в опытах на самих себе установили заразность возвратного и сыпного тифа и пришли к заключению, что эти болезни передаются кровососущими насекомыми.

Основоположнику московской микробиологической школы Г.Н. Габричевскому (1860-1907) принадлежат труды по исследованию скарлатины, дифтерии, чумы и других инфекций. Он организовал в Москве производство противодифтерийной сыворотки и успешно применил ее для лечения детей, больных дифтерией.

Д.К. Заболотный (1866-1929), В.К. Высокович изучали эпидемиологию чумы.

Они доказали лечебное действие противочумной сыворотки, научно обосновали эпидемиологическую роль сурков в образовании природных очагов чумы; установили токсическое действие сывороток крови больных сифилисом на трепонемы.

Марциновский Е. И. провел исследования по борьбе с малярией, лейшманиозом, клещевым возвратным тифом, бруцеллезом, москитной лихорадкой; Л.А. Тарасевич изучал механизм действия ферментов фагоцитов, эффективность прививок против туберкулеза, методы борьбы с сыпным тифом и другими болезнями; И.Г. Савченко исследовал вопросы иммунитета при сибирской язве, холере и возвратном тифе, скарлатине и других инфекционных болезнях.

Зильбер Л.А. (1894-1966) с сотрудниками открыл вирус клещевого энцефалита и разработал метод профилактики этого заболевания; им сформулирована вирусногенетическая теория происхождения злокачественных опухолей, исследованы механизмы трансформации нормальных клеток в злокачественные, в частности интеграции вирусных и клеточных геномов.

Ермольева З.В. (1898-1974) выяснила вопросы бактериофагии, профилактики холеры, получила впервые в СССР пенициллин. П.Ф. Здродовский (1890-1976) внес большой вклад в изучение механизмов развития малярии, бруцеллеза, менингококковой инфекции, дифтерии, и особенно природноочаговых риккетсиозов; В.Д. Тимаков (1905-1977) разработал средства и методы профилактики инфекционных болезней, раскрыл проблемы генетики микроорганизмов, вопросы бактериофагии; им разработан раздел, касающийся роли L-форм бактерий и микоплазм в инфекционной патологии людей.

Для развития микробиологии в Беларуси важное значение имело создание крупных научных центров (Витебский химико-бактериологический институт, 1921; Минский пастеровский институт, 1924; кафедра микробиологии медицинского факультета Белорусского государственного университета, 1923), расширение сети бактериологических учреждений, формирование научных медицинских связей с учеными различных республик и зарубежных стран.

Серьезный вклад в развитие бактериологии, вирусологии, инфекционной иммунологии в Республике Беларусь внесли научные школы, созданные ведущими учеными республики Б.Я. Эльбертом и В.И. Вотяковым. Впервые в мире Б.Я. Эльберт и Н.А. Гайский разработали живую туляремийную вакцину и провели широкое испытание ее на людях (1936-1945); Б.Я. Эльбертом предложен новый способ накожного применения живой туляремийной вакцины (1944), что намного упростило ее внедрение в практику.

Ученым Беларуси принадлежит приоритет в комплексной разработке проблем склеромы. Главными итогами проведенных исследований в 1920-30 г. (Б.Я. Эльберт, В.М. Геркес и др.) были предложены схемы классификации и дифференциации капсульных бактерий, изучение антигенной обособленности клебсиеллы склеромы, разработка схемы бактериологической и серологической диагностики склеромы.

Микробиологи Беларуси совместно с клиницистами работали над актуальной проблемой внутрибольничных инфекций и связанных с ней вопросами противомикробных мероприятий. Разработан микробиологический мониторинг за этиологической структурой и лекарственной устойчивостью возбудителей внутрибольничных инфекций, осуществляемый в хирургических и ожоговых отделениях больниц (А.П.

Красильников, А.А. Адарченко, Л.С. Змушко, 1971-1996).

Начиная с 1987 г., в Беларуси ведутся работы по исследованию эпидемиологии и этиологии ВИЧ-инфекции. Белорусским НИИ эпидемиологии и микробиологии в 1989 г. впервые в СССР выделен высокопродуктивный штамм ВИЧ-1 zmb, зарегистрированный в Национальной коллекции вирусов в Институте вирусологии им. Д.И.

Ивановского. На основе его были разработаны диагностические препараты для иммуноферментного анализа и иммуноблотинга.

–  –  –

Мир микроорганизмов разнообразен и организмы в нем различаются по уровню организации геномов, наличию и составу белоксинтезирующих систем и клеточной стенки.

В соответствии с этими признаками микроорганизмы делят на 3 надцарства:

эукариоты, прокариоты, вирусы.

Микроорганизмы – это невидимые простым глазом представители всех царств (бактерии, грибы, простейшие, сине-зеленые водоросли, вирусы). Они занимают низшие ступени эволюции, но играют важную роль в существовании и развитии природы, в круговороте веществ, в патологии человека, животных и растений.

Эукариоты имеют дифференцированное ядро, отграниченное от цитоплазмы ядерной мембраной, аппарат митоза и ядрышко. К эукариотам относятся простейшие, дрожжи и нитчатые грибы.

Ядерная ДНК эукариотов находится в комплексе с гистонами в соотношении 1:1, хромосомы построены в виде нуклеосом, состоящих из белковых глобул, и фрагмента ДНК размером в 200 пар нуклеотидов. Эукариоты имеют рибосомы 80S, митохондрии или хлоропласты, не содержат пептидогликана, являются аэробами.

Прокариоты – это организмы, у которых нет оформленного ядра, а есть эквивалент ядра – нуклеоид, который представлен одной или несколькими хромосомами, расположенными в цитоплазме и не отграниченными от нее никакой мембраной. Прокариоты не имеют дифференцированного аппарата митоза, у них нет ядрышка. Они имеют рибосомы 70S, клеточную стенку, содержащую пептидогликан. Размеры прокариотов колеблются от 1 до 20 мкм, у них нет митохондрий и хлоропластов. Среди прокариотов есть аэробные и анаэробные организмы.

К вирусам относят организмы, у которых геном представлен ДНК или РНК, отсутствуют белоксинтезирующие системы, вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

Систематика микроорганизмов занимается подробным описанием видов организмов, выяснением степени родства между ними, объединением их по уровню родства в классификационные единицы – таксоны. Отсюда таксономия – это наука о принципах и методах распределения организмов в иерархическом плане.

Классификация – составная часть систематики, она распределяет микроорганизмы по различным таксонам.

Основной таксономической единицей является вид.

Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение, сходный генотип, среду обитания и свойства, а также способность вызывать сходные процессы в организме человека или внешней среде.

Последующие более крупные таксономические единицы: род, семейство, порядок, класс, отдел, царство.

В настоящее время в микробиологии для классификации используется несколько основных способов.

1. Нумерический подход.

Он основан на оценке степени сходства и различия организмов по максимально возможному количеству фенотипических свойств и проявлений. Иногда проводят оценку более 100 показателей. Для увеличения достоверности определения признакам присваиваются коэффициенты (их еще называют весом). Чем более важен данный признак для определения возбудителя, чем реже он встречается у других микроорганизмов, тем выше вес признака и тем специфичнее он определяет данного возбудителя (например, продукция плазмокоагулазы у золотистого стафилококка).

2. Генетический подход.

Он основан на сходстве в строении ДНК геномов изучаемых бактерий.

Считается, что микроорганизмы, принадлежащие к 1 виду, обладают от 70 до 100% гомологией ДНК. При 60% совпадении речь может идти о принадлежности бактерий к 1 роду.

Для генетической классификации используют метод гибридизации нуклеиновых кислот, изучают процентное содержание гуанина и цитозина в ДНК генома, определяют молекулярный вес ДНК, наличие плазмид. В последнее время, особенно для внутривидовой дифференциации микроорганизмов, используют метод полимеразной цепной реакции.

3. Типирование по рибосомальной РНК (риботипирование).

Оказалось, что рибосомальная РНК бактерий содержит высококонсервативные последовательности, которые в процессе эволюции изменялись незначительно. Различия в структуре рибосомальной РНК позволяют дифференцировать крупные таксоны (порядки, классы, семейства) у бактерий.

Генетические механизмы, лежащие в основе изменчивости микроорганизмов, обеспечивают только относительную стабильность признаков, которые в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложилось понятие о вариантах (типах) микроорганизмов, отличающихся отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают: морфологические (морфовары), биологические (биовары), ферментативные (ферментовары), различные по резистентности к антибиотикам (резистенсвары) и бактериофагам (фаговары) варианты бактерий. Наряду с этим отдельные виды могут включать варианты, различающиеся по антигенной структуре (серовары), экологическим нишам, в которых они обитают (эковары) и патогенности для определенных хозяев (патовары).

Штаммом называют культуру одного вида микроорганизмов, выделенную из различных источников (организма человека, животного, окружающей среды) или из одного и того же источника, но в разное время. Обычно штаммы обозначают протокольными номерами или называют либо по источнику выделения (водный, кишечный), либо по местности, где он был выделен. Штаммы микробов одного вида могут быть совершенно идентичными или различаться по степени вирулентности, метаболической активности, чувствительности к антибиотикам и антисептикам, однако свойства отдельных штаммов не выходят за пределы данного вида микроорганизмов.

Согласно биноминальной номенклатуре каждый микроорганизм имеет название, состоящее из двух слов: первое слово означает род и пишется с прописной буквы, второе слово означает вид и пишется со строчной буквы, например Escherichia coli. Возможно сокращение рода до первой буквы, реже встречаются сокращения до первых двух или трех букв. Достаточно часто используют только родовое название, имея в виду все виды данного рода, или то, что идентификация проводилась только до рода. Вместо видового названия в этом случае используют сокращение: spp.

Клон – культура микроорганизмов, полученная из одной особи.

Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида, выращенные на питательной среде.

Особенности микроорганизмов определили набор признаков и свойств, которые используются в систематике и классификации:

1. Морфологические – величина, форма, взаимное расположение.

2. Тинкториальные – способность окрашиваться различными красителями при сложных методах окрашивания. Одним из наиболе важных признаков является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического строения клеточной стенки. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные.

3. Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких и плотных питательных средах.

4. Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии разделяются на ползающие и плавающие, у которых подвижность связана с наличием жгутиков.

5. Физиологические свойства – способы питания, дыхания.

6. Биохимические свойства – способность расщеплять белки, углеводы, жиры до конечных продуктов обмена.

7. Чувствительность к специфическим бактериофагам.

8. Антигенные свойства (выявляют в иммунологических реакциях).

9. Липидный, белковый и углеводный состав. Белковые спектры определяют с помощью метода двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, где разделяют смеси рибосомных, мембранных и внутриклеточных белков, получая белковые спектры соответствующей фракции определенного вида бактерий. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии.

10. Генетические свойства. Их изучают, используя методы геносистематики. Наиболее точным методом установления генетического родства является определение степени сходства ДНК.

Молекулярно-биологические признаки основываются на гомологии эталонной и исследуемой ДНК, о которой судят по процентному содержанию гуанин-цитозин (Г+Ц)-пар или по степени гибридизации этих молекул. Химическими методами после гидролиза ДНК и разделения свободных оснований можно узнать нуклеотидный состав. Наиболее часто используется определение точки плавления ДНК, при которой происходит ее денатурация в результате разрыва водородных связей, соединяющих две цепи. Разделение цепей сопровождается заметным увеличением оптической плотности при 260 нм. Если она достигает 90% и выше, говорят о близком генетическом родстве эталонной ДНК с выделенной из исследуемого микроба. Содержание Г+Ц в ДНК можно измерить также путем центрифугирования образца ДНК в градиенте хлорида цезия. ДНК. Наибольшее разнообразие в содержании Г+Ц наблюдается в группе прокариотов, у которых эта величина колеблется от 30 до 75%, но среднее содержание Г+Ц у многих различных штаммов микроорганизмов одного вида очень близко или идентично. В то же время два организма с одинаковым средним нуклеотидным составом ДНК могут резко различаться в генетическом отношении.

Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволяет точно оценить генетическую гомологию штаммов. При быстром охлаждении раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации, ее одиночные цепи остаются разделенными. Однако при температуре на 10-300С ниже точки плавления происходит специфическая реассоциация («отжиг») комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул. Может быть проведена аналогичная реассоциация между молекулами ДНК и РНК, реассоциация «ДНК-рибосомальная РНК» представляет таксономический интерес.

Обычно при гибридизации нуклеиновых кислот используют образцы ДНК с радиоактивной меткой. На этом признаке основан метод молекулярных зондов, применяемый с диагностическими целями. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после этого определяется степень его гомологии с исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить наличие в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить микробиологический диагноз заболевания.

В таксономии микроорганизмов международное признание получил определитель бактерий, изданный Д. Берги (1923 г.), который впоследствии неоднократно переиздавался.

Определитель выделяет грамположительные и грамотрицательные бактерии;

эубактерии, лишенные клеточной стенки (микоплазмы); архебактерии (метан- и сульфатредуцирующие архебактерии, галофильные и термофильные архебактерии и архебактерии, лишенные клеточной стенки).

Прокариоты включают царства Eubacteria и Archaebacteria. В них входят отделы.

Отдел I. Gracilicutes, к нему относятся грамотрицательные бактерии.

Отдел II. Firmicutes, к нему относятся грамположительные бактерии.

Отдел III. Tenericutes – организмы, не имеющие клеточной стенки (сюда относятся микоплазмы).

Отдел IV. Mendosicutes – бактерии, у которых в клеточной стенке нет пептидогликана.

Для удобства использования определителя описание отделов дается по группам.

Патогенные для человека бактерии входят в достаточно небольшое число групп.

Группа 1. Спирохеты.

Включает свободноживущие и паразитические виды; для человека патогенными являются представители родов Treponema, Borrelia и Leptospira.

Группа 2. Аэробные и микроаэрофильные подвижные извитые и изогнутые грам(-) бактерии.

Патогенные для человека виды входят в роды Campylobacter, Helicobacter и Spirillum.

Группа 3. Неподвижные (редко подвижные) грамотрицательные бактерии (не содержит патогенные виды).

Группа 4. Грамотрицательные аэробные и микроаэрофильные палочки и кокки.

Патогенные для человека виды включены в состав семейств Legionellaceae, Neisseriaceae и Pseudomonadaceae; в группу входят также патогенные и условнопатогенные бактерии родов Acinetobacter, Afipia, Alcaligenes, Bordetella, Brucella, Flavobacterium, Francisella, Kingella, Moraxella.

Группа 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки.

Образована тремя семействами – Enterobacteriaceae, Vibrionaceae и Pasteurellaceae, каждое из которых включает патогенные виды, а также патогенные и условно-патогенные бактерии родов Calymmobacterium, Cardiobacterium, Eikenella, Gardnerella и Streptobacillus Группа 6. Грамотрицательные анаэробные прямые, изогнутые и спиральные бактерии. Патогенные и условно-патогенные виды входят в состав родов Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas и Prevotella.

Группа 7. Бактерии, осуществляющие диссимиляционное восстановление сульфата или серы.

Не включает патогенные виды.

Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки.

Включает условно-патогенные бактерии рода Veillonella.

Группа 9. Риккетсии и хламидии.

Три семейства – Rickettsiaceae, Bartonellaceae и Chlamydiaceae, каждое из которых содержит патогенные для человека виды.

Группы 10 и 11. Включают анокси- и оксигенные фототрофные бактерии, непатогенные для человека.

Группа 12. Аэробные хемолитотрофные бактерии и родственные организмы.

Объединяет серо-, железо- и марганецокисляющие и нитрифицирующие бактерии (не вызывают поражений у человека).

Группы 13 и 14. Включают почкующиеся и/или бактерии с выростами и бактерии, обладающие чехлом. Представлены свободноживущими видами, непатогенными для человека.

Группы 15 и 16 Объединяют скользящие бактерии, не образующие плодовых тел, и скользящие бактерии, образующие плодовые тела (непатогенны для человека).

Группа 17. Грамположительные кокки.

Включает условно-патогенные виды родов Enterococcus, Leuconostoc, Peptococcus, Peptostreptococcus, Sarcina, Staphylococcus, Stomatococсus и Streptococcus.

Группа 18. Спорообразующие грамположительные палочки и кокки.

Включает патогенные и условно-патогенные палочки родов Clostridium и Bacillus.

Группа 19. Неспорообразующие грамположительные палочки правильной формы.

Включает условно-патогенные виды родов Erysipelothrix и Listeria.

Группа 20. Неспорообразующие грамположительные палочки неправильной формы.

В состав группы входят патогенные и условно-патогенные виды родов Actinomyces, Corynebacterium, Gardnerella, Mobiluncus и др.

Группа 21. Микобактерии.

Включает единственный род Mycobacterium, объединяющий патогенные и условно-патогенные виды.

Группы 22-29. Актиномицеты. Среди многочисленных видов лишь нокардиоформные актиномицеты (группа 22) родов Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Jonesia, Oerskovia и Terrabacter способны вызывать поражения у человека.

Группа 30. Микоплазмы.

Патогенны для человека виды, включенные в состав родов Acholeplasma, Mycoplasma и Ureaplasma.

Не содержат патогенных для человека видов – метаногенные бактерии (группа 31), сульфатредуцирующие бактерии (32), экстремально галофильные аэробные археобактерии (33), археобактерии, лишенные клеточной стенки (34), и экстремальные термофилы и гипертермофилы, метаболизирующие серу (35 группа).

2.2. Структура бактериальной клетки и химический состав микроорганизмов Бактерии I и II отделов – это простейшие одноклеточные организмы, не имеют хлорофилла. Содержат нуклеиновую кислоту, белки, полисахариды, липиды, минеральные вещества, воду, микроэлементы. У них всегда присутствуют оболочка, цитоплазма и нуклеоид. Не у всех бактерий имеются капсула, жгутики, фибриллы, пили, споры, включения.

Все эти структуры выявлены различными методами. Их величину определяют ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией, микроскопией с использованием микрометра. Она колеблется от 0,1 нм до 10-20 нм (1000 нм=1 мкм; 1000 мкм=1 мм).

Оболочка бактерий состоит из трех слоев: слизистого (поверхностного), собственно клеточной стенки и ЦПМ – цитоплазматической мембраны.

Слизистый слой располагается поверх клеточной стенки, состоит из высокополимерных мукополисахаридов, которые не имеют с клеточной стенкой постоянной и прочной связи.

Клеточная стенка бактерий и грибов располагается между цитоплазматической мембраной и капсулой (если она имеется) или ионизированным слоем внешней среды (рис. 1 и 2).

Толщина клеточной стенки колеблется от 10 до 35 нм. Клеточная стенка составляет 10-50% сухой массы бактерий, построена из полимеров или блоков, включающих липопротеиды, липополисахариды, протеины, тейхоевые кислоты.

Главным и специфичным для клеточной стенки компонентом является муреин или пептидогликан. Он имеется только у эубактерий (кроме микоплазм). Пептидогликан включает в себя остов и два набора пептидных цепочек – боковых и поперечных.

Остов состоит из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, связанных между собой -гликозидными связями. Основу пептидов связи составляют тетрапептиды, состоящие из чередующихся L- и D-аминокислот, например, L-аланинD-глютаминовая кислота- мезодиаминопимелиновая кислота-D-аланин.

В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая кислота – уникальный компонент клеточной стенки, который имеется только у прокариотов.

У грамотрицательных бактерий клеточная стенка слоиста. Внутренний слой построен из пептидогликана (5-10%), не содержит тейхоевых кислот. Наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с цитоплазматической мембраной. Основной компонент этих мембран – двойной слой липидов. Наружная мембрана представлена липополисахаридами, фосфолипидами и белками. В состав белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных («мажорных»), которые составляют 70% суммарных белков наружной мембраны; два из основных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидогликаном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузионные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второстепенные белки участвуют в облегченной диффузии и активном транспорте молекул, участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорских ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления.

С внешней её стороны располагается липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, базисной части (ядра) и О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями.

ЛПС грамотрицательных бактерий обладает токсическими свойствами (связан с эндотоксином) и выраженными антигенными свойствами (О-антиген определяет серогруппу, серовар), по которым можно дифференцировать бактерии. Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соединений, которые опосредуют патогенез эндотоксикоза и обладают пирогенным действием.

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную структуру, пластичный слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Она толще, чем у грамотрицательных бактерий – 20-60 нм. У грамположительных бактерий клеточная стенка на 60-90% состоит из пептидогликана и тесно связанных с ним тейхоевых кислот. Тейхоевые кислоты (от греч. teichos – стенка) – растворимые в воде линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибитола, связанные между собой фосфодиэфирными связями.

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генцианфиолетовый в комплексе с иодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с краской. Обработка окрашенного по Граму мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пептидогликане и задержку красителя в клеточной стенке. Наоборот, грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются, поры открываются и при обработке фуксином бактерии окрашиваются в красный цвет.

Пептидогликан может разрушаться под действием фермента лизоцима (мурамидазы), гидролизующего связи между ацетилглюкозамином и ацетилмурамовой кислотой.

Клеточная стенка выполняет следующие функции:

* определяет и сохраняет постоянную форму микробной клетки;

* является осмотическим барьером, защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды;

* имеет своеобразное строение в виде «сита», через ее поры в клетку проникают питательные вещества, а из клетки выделяются продукты метаболизма, токсины, ферменты;

* участвует в регуляции роста и деления клеток;

* в клеточной стенке находятся гидролитические ферменты. Они обеспечивают рост клеточной стенки, а при гибели - аутолиз её;

* защищает клетку от неблагоприятных воздействий (температура, химические вещества);

* в ней локализуются основные антигенные детерминанты для взаимодействия со специфическими антителами и бактериофагами;

* имеет сложный химический состав, который позволяет дифференцировать клетки на грамположительные и грамотрицательные;

Способы выявления клеточной стенки:

* опыт Фишера – клетку помещают в гипертонический раствор соли или сахара. Вещества из клетки выходят в сторону большего осмотического давления – клеточная стенка отслаивается от цитоплазмы и видна в световом микроскопе;

* электронная микроскопия и ультрацентрифугирование с учетом по константе седиментации;

* действие лизоцима или антибиотиков приводит к растворению клеточной стенки.

Если клеточная стенка полностью разрушается – образуются протопласты или L-формы бактерий. В отличие от протопластов, L-формы способны размножаться.

Они бывают стабильные, если не восстанавливаются в исходную форму, и нестабильные (восстанавливаются). Если клеточная стенка растворяется частично, то образуется сферопласт.

Цитоплазматическая мембрана. Цитоплазматическая мембрана имеет три слоя

– двойной фосфолипидный и глобулярный белковый. Она ограничивает цитоплазму, поддерживает постоянство осмотического давления, необходимого для нормального метаболизма клетки, контролирует водный и солевой обмен, обеспечивает питание бактерий за счет ферментов-пермеаз, расположенных в ЦПМ. За счет окислительновосстановительных ферментов ЦПМ принимает участие в процессах дыхания. ЦПМ участвует в делении клетки, биосинтезе компонентов клеточной стенки и капсулы, в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид.

Имеется система внутренних мембран – мезосомы – это аналоги митохондрий.

Они являются производными ЦПМ, связаны с нуклеоидом. Принимают участие в делении клеток, в распределении дочерних нуклеоидов в делящихся клетках, участвуют в спорообразовании, в синтезе материала клеточной стенки, в энергетическом метаболизме.

Цитоплазма – это коллоидная масса, заключенная в оболочку. Химический состав её сложный (белки, полисахариды, липиды, РНК, микроэлементы, минеральные вещества).

В электронном микроскопе в цитоплазме выявлены: эндоплазматическая сеть, рибосомы и гранулярные образования.

Рибосомы – структуры, в которых идет синтез белка. В свободном состоянии рибосомы могут находиться в виде 2 субъединиц с константой седиментации 30S и 50S.

Перед синтезом белка субъединицы объединяются в рибосому с константой седиментации 70S. Количество рибосом в клетке колеблется от 5 до 10000. Часто они группируются в полисомы – полирибосомы.

Гранулы гликогена, крахмала, жира, зерна волютина (полифосфаты) играют трофическую и диагностическую роль (у дифтерийной палочки зерна волютина располагаются по полюсам и интенсивно прокрашиваются «метахромазия»). В цитоплазме могут быть плазмиды – участки дополнительного генетического материала, представленные двойной нитью ДНК, обеспечивающие определенные свойства бактерий (см. в разделе генетики бактерий).

Нуклеоид (хромосома). Нуклеоид бактерий содержит циркулярно-замкнутую двойную нить ДНК, располагается в цитоплазме в виде клубка. У нуклеоида нет ядерной оболочки, ядрышек, белков гистонов и протаминов; при этом микробная клетка не делится митозом, т.к. нет митотического аппарата.

В нуклеоиде есть ДНК, РНК и ферменты, в частности РНК-полимераза. РНК и РНК-полимераза находятся в центре, а на них намотана ДНК, которая расположена компактно. Один конец ДНК связан с мезосомами ЦПМ, что способствует разделению дочерних хромосом при репликации. Бактерии – гаплоидные существа. Содержат 1 молекулу ДНК, ее можно рассматривать как одиночную хромосому, в расправленном состоянии ее длина 1 мм.

Форма нуклеоида различна: сферическая, палочковидная, подковообразная. В клетке в зависимости от физиологического состояния может быть один или кратное двум количество нуклеоидов. В молодых клетках – несколько, в старых – 1, у кокков – 1, у палочковидных – много.

Функции нуклеоида: хранитель генетической информации, которая закодирована в ДНК; принимает участие в генетических процессах (мутациях, рекомбинациях), а также в делении бактерий и спорообразовании.

Доказательства наличия нуклеоида:

– цитохимическая реакция Фельгена на ДНК. На мазок бактерий наносят соляную кислоту, при этом из дезоксирибозы образуются альдегиды, которые с фуксинсернистой кислотой реактива Шиффа дают фиолетовое окрашивание;

– люминесцентная микроскопия: при окраске мазка акридиновым оранжевым ДНК в ультрафиолете светится зеленым светом, РНК – красным;

– электронная микроскопия ультратонких срезов.

Жгутики – органы передвижения бактерий. Это тончайшие длинные нити (3х12-25 нм), одетые чехлом белковой природы, берут начало в цитоплазме и связаны с телом клетки при помощи дисков. Наружный диск находится в клеточной стенке, внутренний в ЦПМ. В состав жгутиков входит белок флагеллин, он относится к числу сократительных белков, обладает высокой антигенной активностью и специфичностью (см. Н-антиген).

Для изучения жгутиков существуют прямые и косвенные методы. Прямые – это электронная микроскопия и световая после окраски по Лёффлеру. Косвенные – посев уколом в столбик полужидкого агара и микроскопия нативного материала в препаратах «висячая» и «раздавленная» капли в световом и фазово-контрастном микроскопах.

По наличию жгутиков и их расположению микробы разделяются на монотрихи – имеют 1 жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков с одной стороны, амфитрихи – по одному жгутику или по пучку жгутиков по полюсам, перитрихи – жгутики по всей поверхности тела клетки, атрихи – без жгутиков.

Помимо жгутиков есть ворсинки (пили, бахромки) – это органы прикрепления.

Наиболее изучены 2 вида пилей – половые (sex) пили, через которые идет передача генетического материала из клетки донора в клетку реципиента в процессе конъюгации, и пили, обеспечивающие прикрепление или адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина.

Фибриллы (периплазматические жгутики) – органы передвижения у спирохет, они состоят из отдельных переплетающихся нитей и располагаются между клеточной стенкой и ЦПМ.

Споры – покоящиеся формы жизненного цикла бактерий, образуются внутри цитоплазмы вегетативных клеток в неблагоприятных условиях существования и обеспечивают сохранение вида. В спорах микробы находятся в состоянии анабиоза. Микробы, образующие споры, называются бациллами (аэробы) или клостридиями (анаэробные бактерии, имеющие форму веретена). Споры отличаются от вегетативной клетки тем, что происходит репрессия генома и клетка переходит в состояние анабиоза, при котором отсутствует обмен веществ, вода переходит из свободного состояния в связанное, повышается концентрация ионов кальция, появляется дипиколиновая кислота, которая обусловливает термоустойчивость споры.

Процесс спорообразования сходен у большинства бактерий. Вначале образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки. Затем в ЦПМ образуется инвагинация, разделяющая клетку на 2 протопласта, каждый из которых содержит 1 хромосому. Меньший из протопластов – проспора (предспора) – покрывается второй оболочкой, которая синтезируется мембраной материнской клетки. В оболочке клетки содержится дипиколиновая кислота и ионы кальция. Далее между двумя листками мембраны формируется специфический для споры кортикальный слой (кортекс), состоящий из пептидогликана, который отличается по составу от пептидогликана клеточной стенки. Снаружи спора покрывается толстой рыхлой оболочкой – экзоспориумом, содержащей немного углеводов. Белковая оболочка споры богата остатками цистеина и лизина и обладает гидрофобностью. После этого наступает аутолиз вегетативной клетки.

При попадании споры в благоприятные условия происходит активация споры и ее прорастание в вегетативные клетки. Идет дерепрессия генома, мобилизация метаболических процессов, из клетки удаляется дипиколиновая кислота, ионы кальция, разрушается пептидогликан кортекса.

Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и стадию роста.

Активация является обязательным условием прорастания спор. Она осуществляется различными воздействиями: снижением рН, веществами, содержащими свободные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическим повреждением спор.

Начальная стадия: происходит активация автолизина, который разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, выходит дипиколинат кальция.

Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры появляется вегетативная клетка, которая при наличии питательных веществ удваивает свою биомассу, делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются. Процесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного геномов.

Для обнаружения спор используют электронную микроскопию, а также специальный метод окраски по Ожешко, на первом этапе которого нефиксированный мазок обрабатывают в течение 1-2 минут 0,5% р-ром HCl при подогревании, а далее препарат окрашивают по методу Циль-Нильсена. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий. При простых методах окраски оболочка не пропускает красители, споры сильно преломляют свет и видны в микроскопе как прозрачные зерна.

Капсула – структура бактериальной клетки, которая расположена на поверхности клеточной стенки и тесно связана с ней. Она состоит из высокогидрофильных мицелл гетерополисахаридов (у кишечных бактерий), белков (у стрептококков), полипептидов (бацилл сибирской язвы). В зависимости от толщины слоя и прочности соединения с телом различают капсулу или макрокапсулу, которая видна в световом микроскопе, микрокапсулу (К-антиген), которая выявляется при электронной микроскопии, серологическими и химическими методами, и слизистый слой, который непрочно связан с клеточной стенкой и состоит из экстрацеллюлярных веществ микроба.

У некоторых бактерий капсула постоянна, содержится у всех особей и во всех средах (Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes). У пневмококков, возбудителей сибирской язвы, C. perfringens капсульное вещество образуется только в макроорганизме, а на питательных средах синтез его прекращается. Капсула является важным фактором вирулентности, защищает бактерии от действия фагоцитов, связывает ионы тяжелых металлов, защищает от действия антител, комплемента и от высыхания. Определение капсулы используют для классификации и идентификации бактерий и установления их вирулентности. Капсула выявляется при специальных методах окраски (метод Бурри-Гинса), создающих негативное контрастирование вещества капсулы тушью.

2.3. Формы бактерий

Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах (мкм). Они варьируют в широких пределах от 0,1-0,15 (микоплазмы) до 10-15 мкм (клостридии) в длине и от 0,1 мкм до 1,5-2,5 мкм в диаметре.

Бактерии бывают шаровидные (сферические), палочковидные (цилиндрические), извитые (спиралевидные), нитевидные и ветвящиеся.

Кокки – шаровидные клетки, которые в зависимости от взаимного расположения делятся на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины, стафилококки (рис. 3). Микрококки располагаются в виде отдельных клеток, делятся в одной плоскости, сапрофиты, патогенных для человека нет. Диплококки, или парные кокки, располагаются парами (пневмококк, гонококк, менингококк), так как клетки после деления не расходятся. Пневмококк (возбудитель пневмонии) имеет ланцетовидную форму, а гонококк (возбудитель гонореи) и менингококк (возбудитель эпидемического менингита) – форму кофейных зерен, обращенных вогнутой поверхностью друг к другу. Стрептококки (от греч. streptos – цепочка) – клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними в месте деления. Многие стрептококки являются патогенными для человека и вызывают различные заболевания: скарлатину, ангину, гнойные воспаления и другие. У тетракокков (от лат. tetra – четыре) деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием тетрад. Патогенные для человека виды встречаются очень редко. Сарцины (от лат. sarcina – связка, тюк) располагаются в виде пакетов из 8 и более кокков, которые образуются при делении клеток в трех взаимно перпендикулярных областях. Среди них имеются условно патогенные представители. Особенно часто встречаются в воздухе. Стафилококки (от греч. staphyle – виноградная гроздь) представляют собой кокки, расположенные группами (гроздьями) в результате деления в разных плоскостях.

Палочковидные бактерии различаются по размерам, форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Длина клеток варьирует от 1 до 8 мкм, толщина – от 0,5 до 2 мкм. Термин «бактерия» (от греч. bacteria – палочка) применяется как для названия всего царства прокариот, так и для названия палочек, не образующих спор.

Палочки, образующие споры, подразделяют на бациллы (от лат. bacillus – палочка) – аэробные спорообразующие бактерии, например, Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы и клостридии (от лат. сlostridium – веретенообразный) – анаэробные спорообразующие бактерии, например, Сlostridium tetani – возбудитель столбняка.

Палочки могут быть правильной (кишечная палочка и др.) и неправильной (коринебактерии и др.) формы, в том числе ветвящиеся, например, актиномицеты. Наиболее мелкие палочковидные бактерии – риккетсии. Концы палочек могут быть как бы обрезанными (сибиреязвенная бацилла), закругленными (кишечная палочка), заостренными (фузобактерии) или в виде утолщения, и тогда палочка похожа на булаву (коринебактерии дифтерии). Большинство палочковидных бактерий располагается беспорядочно, так как после деления клетки расходятся. Если после деления клетки остаются связанными общими фрагментами клеточной стенки и не расходятся, они располагаются под углом друг к другу (коринебактерии дифтерии), образуют цепочку (сибиреязвенная бацилла).

По взаимному расположению бактерии подразделяют на три группы:

– монобактерии – палочки располагаются одиночно и беспорядочно, сюда относится большинство палочковидных бактерий;

– диплобактерии располагаются попарно (род Pseudomonas);

– стрептобактерии или стрептобациллы – бактерии располагаются цепочкой.

Извитые формы – спиралевидные бактерии, по количеству и характеру завитков, а также по диаметру клеток подразделяют на три группы:

– вибрионы (от греч. vibrio – извиваюсь), имеют один изгиб, не превышающий четверти оборота спирали (Vibrio cholerae – возбудитель холеры);

– спириллы, имеющие вид штопорообразно извитых клеток. К патогенным спириллам относятся возбудитель содоку (болезни укуса крыс), близки к ним и такие бактерии, как кампилобактерии и хеликобактерии;

– спирохеты в сравнении со спириллами имеют большее количество равномерных или неравномерных завитков. Выделены в особый порядок Spirochaetales Нитевидные и ветвящиеся формы бактерий.

Различают два типа нитевидных бактерий, которые образуют временные или постоянные нити. Временные нити с ветвлениями образуют палочковидные бактерии при нарушении регуляции клеточного деления (микобактерии, коринебактерии). При восстановлении механизма регуляции деления эти бактерии восстанавливают обычные размеры. Постоянные нитевидные формы образуют палочковидные бактерии, которые соединяются в длинные цепочки или с помощью слизи, или чехлами, или мостиками.

Нитевидные формы образуют серобактерии и железобактерии.

Бактерии отличаются полиморфизмом (индивидуальная изменчивость формы, не передающаяся по наследству) при культивировании на искусственных питательных средах и под воздействием химических веществ и антибиотиков.

2.4. Морфология спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицетов, грибов Морфология спирохет. Спирохеты выделены в самостоятельный порядок Spirochaetales, который включает два семейства: Spirochaetaceae и Leptospiraceae. В семейство Spirochaetaceae входят 7 родов, из них наибольший интерес представляют патогенные для человека роды Borrelia и Treponema. В семейство Leptospiraceae включен род Leptospira Спирохеты (spira – завиток, chaite – волос) – тонкие, длинные, извитые подвижные бактерии спиралевидной формы. Они состоят из наружной мембраны (клеточной стенки), которая окружает протоплазматический цилиндр с цитоплазматической мембраной и аксиальной нитью (аксостиль). Размеры клеток спирохет составляют 0,05х5-500 мкм.

Аксиальная нить находится под наружной мембраной и как бы закручивается вокруг протоплазматического цилиндра спирохеты, при этом образуются первичные завитки, что придает бактерии винтообразную форму. Аксиальная нить состоит из фибрилл – аналогов жгутиков бактерий, в состав которых входит сократительный белок флагеллин. Они прикреплены к концам клетки и направлены навстречу друг другу, другой конец фибрилл свободен. Число и расположение фибрилл варьирует у различных спирохет (от 1 до 100). Фибриллы участвуют в передвижении спирохет и придают клеткам вращательное, сгибательное, поступательное движение. При этом спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые получили название вторичных завитков. Тип, число завитков, шаг, высота, угол наклона спирали играют играют важную систематическую роль. Спирохеты плохо воспринимают красители. Обычно их окрашивают по методу Романовского-Гимзы или серебрением, они грамотрицательны, но в процессе окраски по этому методу тело спирохет часто разрушается. В живом виде их исследуют с помощью фазово-контрастной или темнопольной микроскопии. Содержание Г+Ц в ДНК спирохет варьирует от 32 до 66 моль%. При неблагоприятных условиях среды спирохеты могут превращаться в цисты: спирохеты свертываются в клубок и выделяют слизь, которая, уплотняясь, образует оболочку цисты.

Патогенные спирохеты подразделяются на 3 рода: Borrelia; Treponema;

Leptospira.

Спирохеты рода Borrelia имеют 3-8 крупных неравномерных, грубых завитков (рис. 4). Содержат много нуклеопротеидов, хорошо воспринимают анилиновые красители. По Романовскому-Гимзе окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Периплазматическая нить состоит из 15-20 параллельных фибрилл, сокращение которых вызывает сгибательно-поступательное, реже вращательно-поступательное движение. Боррелии вызывают возвратный тиф и другие боррелиозы.

Род Treponema включает спиралевидно извитые нитевидные подвижные бактерии, имеющие размеры 0,1-0,5х5-20 мкм с периплазматической нитью, имеющей от 1 до 4 фибрилл. Завитки у трепонем мелкие, равномерные, количеством 8-12, содержание Г+Ц 32-50%. Окрашиваются по Романовскому-Гимзе в розовый цвет, так как содержат мало нуклеопротеидов и много липидов. Подвижны, движения медленные сгибательно-поступательные или хаотичные. Форма и движения хорошо видны в живом состоянии в темном поле зрения микроскопа. К облигатно-патогенным для человека относится Т.pallidum – возбудитель сифилиса.

Среди трепонем много сапрофитов, которые обитают в полости рта или в иле водоемов.

Представители рода Leptospira имеют завитки неглубокие, частые, в виде закрученной веревки. Концы этих нитевидных спирохет изогнуты наподобие крючков с утолщениями на концах. Имеют 1-2 фибриллы. Образуя вторичные завитки, они приобретают вид букв S или С, почти не окрашиваются анилиновыми красителями. Главный тип движения – поступательно-вращательный. По способу Романовского-Гимзы окрашиваются в красный цвет, но при фиксации резко меняются их характерные признаки. Изучают лептоспиры в темном поле, фазово-контрастном микроскопе. Патогенный представитель – Leptospira interrogans, возбудитель лептоспироза. Сапрофитные представители обитают в воде.

Микоплазмы – самые мелкие среди прокариотов, способных к самостоятельному метаболизму и репродукции. Относятся к отделу Tenericutes классу Mollicutes. Описано более 100 видов микоплазм. Они входят в семейство Micoplasmataceae. Патогенные для человека виды обнаружены у представителей рода Mycoplasma, Ureaplаsma.

Среди микоплазм встречаются как свободноживущие (сапрофиты), так и поражающие млекопитающих, птиц, насекомых. Размеры их мелкие (0,15-0,3 мкм). Микоплазмы полностью лишены клеточной стенки, имеют разнообразную форму: кокковидную, клювовидную, нитевидную, звездчатую. Эти формы видны при фазовоконтрастной микроскопии.

Микоплазмы грамотрицательны, не имеют спор и капсул. Существуют микоплазмы, обладающие скользящей подвижностью (подобно амебе), некоторые обладают жгутиками. Клетки микоплазм окружены трехслойной липопротеиновой мембраной, которая состоит из стериновых липидов. Это определяет потребность микоплазм в стероле для роста и синтеза мембран. ЦПМ выполняет одновременно функции клеточной стенки и собственно мембраны и несет ряд важнейших физиологических функций: регулирует процессы метаболизма; энергетический обмен; рецепцию токсинов; обеспечивает адсорбцию эритроцитов, сперматозоидов, эпителиальных клеток.

Отсутствие клеточной стенки определяет следующие отличительные свойства: чрезвычайную пластичность; чувствительность к лизису под влиянием осмотического шока, алкоголя, детергентов; фильтруемость через мембранные фильтры; устойчивость к антибиотикам, действующим на клеточную стенку (пенициллину, цефалоспоринам).

На специальных питательных средах микоплазмы образуют колонии размерами 10-200 мкм, похожие на яичницу-глазунью (рис. 5). В зависимости от вида недостаток белков-ферментов ограничивает число метаболических путей, поэтому микоплазмы очень чувствительны к питательным средам, в состав которых должны входить пуриновые и пиримидиновые основания, аминокислоты, витамины, липиды, в том числе стеролы. Паразитируя в организме хозяина, микоплазмы потребляют эти вещества непосредственно из тканей хозяина.

M. pneumoniae и M. hominus вызывают заболевания верхних дыхательных путей – пневмонии. M. hominus, M. genitalium вызывают урогенитальные процессы: уретриты, цервициты, простатиты, часто с ними связано нарушение репродуктивной функции у мужчин и женщин.

Морфология риккетсий и хламидий. Риккетсии и хламидии входят в отдел Gracilicutes и составляют соответственно роды Rickettsia, Chlamidia и Chlamydophila.

Они являются энергетическими облигатными внутриклеточными паразитами. У них отсутствует система регенерации АТФ. Они поражают членистоногих, птиц, животных и человека. Их не культивируют на искусственных питательных средах. Они размножаются: в желточном мешке куриного эмбриона, в организме экспериментальных животных, в тканевых культурах.

Риккетсии названы в честь американского ученого Риккетса, который описал возбудителя риккетсиоза. Имеют все структуры, присущие прокариотам: клеточную стенку (в ней содержится мурамовая кислота), нуклеоид, рибосомы. Спор, жгутиков, капсул не имеют.

Грамотрицательны, окрашиваются по Романовскому-Гимзе в лиловый цвет, по Здродовскому (аналог метода Циль-Нильсена) – в красный. Риккетсии полиморфны, т.

е. имеют различные морфологические формы: кокковидные (0,5 мкм); палочковидные (1,5 мкм); бациллярные (2-4 мкм); нитевидные (10-40 мкм).

Размножаются риккетсии простым делением, а нитевидные формы – дроблением.

Хламидии (сhlamydis – плащ). Хламидии выделены в отдельный порядок Chlamydiales, который включает 4 семейства. Ведущие патогенные для человека представители хламидий сосредоточены в семействах Chlamydiaceae и Parachlamydiaceae, включающие, соответственно, роды Chlamydia и Chlamydophila.

Основными, наиболее важными в патологии человека представителями этих родов являются C. psittaci, C. pneumoniae, C. trachomatis.

Хламидии грамотрицательные, очень мелкие (0,5 мкм), сферической формы микроорганизмы с облигатным внутриклеточным паразитизмом. Спор, капсул, жгутиков не образуют. Биологическое своеобразие хламидий состоит в энергозависимом паразитизме и уникальном цикле развития. Имеются 2 стадии жизненного цикла. Одна – инфекционная стадия – элементарные тельца (ЭТ), она приспособлена к внеклеточному существованию; другая – ретикулярные тельца (РТ) – внутриклеточная неинфекционная форма, лабильна, обладает выраженной метаболической активностью.

Элементарные тельца имеют размер 0,3 мкм, содержат нуклеоид, в клеточной стенке имеется слой – аналог пептидогликана грамотрицательных бактерий. ЭТ проникают в клетку при фагоцитозе. Из поверхностных мембран клетки хозяина вокруг ЭТ образуется вакуоль и ЭТ превращаются в крупные ретикулярные тельца (диаметр 0,5-1 мкм). Внутри образованной вакуоли РТ многократно делятся. В конечном счете вакуоль через 8-12 циклов деления заполняется этими частицами и превращается в микроколонию (включение). На последней генерации из РТ образуются ЭТ нового поколения. Затем мембрана, которая окружает микроколонию, разрушается, и хламидии выходят в цитоплазму, а далее за пределы клетки. Диагностическое значение имеет обнаружение цитоплазматических включений РТ или мелких ЭТ, которые отличаются от ядра клетки и цитоплазмы по цвету и внутренней структуре. Хламидии вызывают трахому, орнитоз, венерический лимфогранулематоз, бленнорею с включениями.

Актиномицеты. Тело акциномицетов имеет форму тонких (0,2-2 мкм) ветвящихся, разделенных перегородками, нитей (гифы). Гифы мицелия могут быть прямыми или спиралевидными. Кроме мицеллярной, встречаются палочковидные и кокковидные формы. От грибов отличаются отсутствием ядра. Как и другие бактерии, они имеют нуклеоид, клеточную стенку, в которой содержится пептидогликан и нет хитина и целлюлозы; чувствительны к антибактериальным препаратам, в частности к пенициллинам.

Среди актиномицетов бывают подвижные и неподвижные виды. Капсул не образуют, грамположительны. Размножаются с помощью спор, которые формируются в результате сегментации и фрагментации гиф. Описан половой способ размножения.

Мицелярные виды на плотных питательных средах образуют субстратный (врастающий в среду) и воздушный мицелий.

Основная среда обитания акциномицетов – почва, могут встречаться в воде, воздухе, на предметах, на кожных покровах человека и животных. Играют важную роль в круговороте веществ и энергии, в плодородии почвы, являются продуцентами антибиотиков, витаминов, ферментов.

В патологии человека имеют значение семейства: Actinomycetaceae, Nocardiaceae, Mycobacteriaceae.

Морфология грибов. Грибы являются эукариотами, имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с органеллами, цитоплазматическую мембрану, мощную клеточную стенку, состоящую из гликана, целлюлозы, хитина, белка, липидов и др. Это микроскопические и макроскопические (свободно живущие, симбиотические и паразитические) организмы, которые находятся в биосфере повсеместно. Свободноживущие грибы обитают в больших количествах в воде, почве и воздухе. Симбионты сожительствуют с водорослями (лишайники), растениями.

Грибы состоят из длинных тонких нитей – гиф, которые, сплетаясь, образуют мицелий (рис. 6). Гифы низших грибов – фикомицетов – не имеют перегородок. У высших грибов – эумицетов – гифы разделены перегородками, а мицелий многоклеточный.

Грибы размножаются спорами, половым и бесполым способами, вегетативным путем (почкованием или фрагментацией гиф).

Грибы, которые размножаются половым и бесполым путем, относятся к совершенным. Несовершенными называются грибы, у которых отсутствует половой путь размножения.

Бесполое размножение у низших грибов происходит с помощью эндогенных спор, которые созревают в головке – спорангии, и экзогенных спор – конидий, которые формируются на концах плодоносящих гиф.

Среди грибов выделяют зигомицеты; аскомицеты; базидиомицеты; дейтеромицеты.

Широко распространен Mycor mucedo – одноклеточный гриб. Он относится к зигомицетам. Мицелий разветвлен, но не септирован, имеет спорангиеносец со спорангием, в котором находятся эндоспоры. Мукор размножается половым и бесполым путем, вызывает мукоромикозы, поражает легкие, печень, кожу, головной мозг. Мукор обитает в почве, воздухе, пищевых продуктах.

Аскомицеты или сумчатые грибы объединяют группу грибов, которые имеют септированный мицелий. Название получили из-за органа плодоношения – сумки или аска, которые содержат 4 или 8 гаплоидных половых спор. К аскомицетам относятся представители родов Aspergillus, Penicillium, которые отличаются особенностями формирования плодоносящих гиф.

Аспергилловая плесень (род Aspergillus) – мицелий септирован, конидиеносец одноклеточный, заканчивается утолщением, от которого отходят экзоспоры, напоминающие струйки воды, вытекающие из лейки. Обитают эти грибы на хлебе, варенье. У человека вызывают аспергиллезы. Поражаются роговица глаза, кожа.

Пеницилловая плесень (род Penicillium) – кистевик – мицелий и конидиеносец септированный, т. е. многоклеточный. Плодоносящее тело имеет вид кисточки. Конидиеносец разветвлен, на концах находятся стеригмы, от них отшнуровываются экзоспоры. Грибок находится в кормах, молочных продуктах, варенье.

Пенициллы могут вызывать заболевания – пенициллиозы. Многие виды аскомицетов являются продуцентами антибиотиков.

Представителями аскомицетов являются и дрожжи – одноклеточные грибы, которые утратили способность к образованию истинного мицелия. Дрожжи имеют овальную форму клеток, диаметр которых 3-15 мкм. Они размножаются почкованием, бинарным делением или половым путем с образованием аскоспор. Дрожжи используют при биотехнологических процессах. Заболевания, которые вызывают некоторые виды дрожжей – дрожжевые микозы.

К аскомицетам относится возбудитель эрготизма – его вызывает спорынья, которая паразитирует на злаках.

Базидиомицеты – это шляпочные грибы, которые имеют септированный мицелий.

Различают также несовершенные грибы (fungi imperfecti или дейтеромицеты).

Они размножаются бесполым путем. Имеют многоклеточный мицелий, но нет конидиеносцев. Паразитируют в зерновых культурах. Вызывает трихофитию, микроспорию, паршу.

К несовершенным грибам относятся дрожжеподобные грибы рода Candida, которые поражают кожу, слизистые оболочки, внутренние органы (кандидоз). Они имеют овальную форму, диаметр 2-5 мкм, делятся почкованием, образуя псевдомицелий – длинные почкующиеся клетки вытянуты в длину и узким основанием соприкасаются друг с другом. На концах клеток находятся хламидоспоры.

–  –  –

Физиология микроорганизмов изучает жизнедеятельность микробных клеток, процессы их питания, дыхания, роста, размножения, закономерности взаимодействия с окружающей средой.

Метаболизм – это совокупность биохимических процессов, направленных на получение энергии и воспроизведение клеточного материала. Он складывается из двух взаимосвязанных процессов: катаболизма и анаболизма. Катаболизм (энергетический метаболизм) – это процесс расщепления крупных молекул до более простых, в результате которого выделяется энергия, накапливающаяся в форме АТФ.

Анаболизм (конструктивный метаболизм) – обеспечивает синтез макромолекул, из которых строится клетка. При этом используется энергия, полученная в процессе катаболизма. Для метаболизма бактерий характерны высокая скорость процесса и быстрая адаптация к меняющимся условиям окружающей среды.

3.2. Источники углерода и типы питания

Различные органические и неорганические вещества поступают в бактериальную клетку в процессе питания. Специальных органов питания у бактерий нет. Вещества проникают через всю поверхность клетки, в виде мелких молекул. Такой способ питания называется голофитным. Необходимым условием для прохождения питательных веществ в клетку является их растворимость в воде и малая величина (т.е. белки должны быть гидролизованы до аминокислот, углеводы – до ди- или моносахаридов и т. д.).

Типы питания. Широкому распространению бактерий способствует разнообразные типы питания. Микробы нуждаются в углероде, кислороде, азоте, водороде, сере, фосфоре и других элементах (органогенах).

По источникам углерода бактерии делятся на:

1) аутотрофы (aytos – сам, trophe – пища), которые используют для построения своих клеток диоксид углерода (CO2) и другие неорганические соединения и не нуждаются в сложных органических соединениях (белках, углеводах). Они способны синтезировать все необходимые соединения из простых веществ. Аутотрофами являются нитрифицирующие бактерии, которые находятся в почве, серобактерии, обитающие в воде, железобактерии, живущие в воде с закисным железом;

2) гетеротрофы (heteros – другой), которые питаются за счет готовых органических соединений.

Гетеротрофы подразделяются на сапрофиты, которые используют органические остатки отмерших организмов и паразиты – нуждаются в белках живых тканей. Выделяют облигатных и факультативных паразитов. Облигатные паразиты способны существовать только внутри клетки – это риккетсии, хламидии, вирусы. Факультативные паразиты могут менять тип питания и размножаться на питательных средах.

3.3. Источники энергии и доноры электронов В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода микробы подразделяют на 2 группы:

1) литотрофы – используют в качестве доноров электронов неорганические соединения (от греческого lithos – камень);

2) органотрофы используют в качестве доноров органические соединения.

По источнику энергии среди бактерий различают: фототрофы – используют энергию света; хемотрофы – нуждаются в химических источниках энергии.

Большинство микробов – хемоорганотрофы – они используют энергию органических соединений.

3.4. Факторы роста

Факторы роста – вещества, необходимые для роста и размножения микробов: витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания. Некоторые микроорганизмы синтезируют факторы роста из промежуточных продуктов обмена (кишечная палочка). Для других требуется добавлять факторы роста в среду. По отношению к факторам роста различают: а) ауксотрофы – нуждаются в одном или нескольких факторах роста; б) прототрофы – могут сами синтезировать факторы роста из глюкозы и солей аммония.

3.5. Транспорт питательных веществ и механизм питания

Поступление веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран.

Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Да. Основным регулятором поступления веществ в клетку является ЦПМ.

Выделяют 4 механизма проникновения веществ в клетку: 1) простая диффузия по градиенту концентрации; 2) облегченная диффузия по градиенту концентрации и с участием ферментов; 3) активный транспорт против градиента концентрации с затратой энергии и с участием ферментов-пермеаз; 4) транслокация химических групп (перенос измененных молекул).

При простой диффузии перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны ЦПМ. Вещества проходят через липидную часть ЦПМ (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в ЦПМ. Пассивная диффузия идет без затраты энергии. Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны ЦПМ. Но этот процесс идет с помощью белков-переносчиков пермеаз, которые синтезируются в ЦПМ. Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой концентрации к более низкой.

Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей. Поэтому этот процесс сопровождается затратой метаболической энергии АТФ, которая образуется в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке.

Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, но отличается тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется. Выход веществ из клетки идет за счет диффузии и при участии транспортных систем.

3.6. Ферменты бактерий

Ферменты – биологические катализаторы. Они имеют белковую природу, сравнительно высокий молекулярный вес, высокоспецифичны, быстро действуют, термолабильны, способны сохранять свою активность и после гибели клеток.

Ферменты классифицируются на:

1) экзоферменты, катализирующие процессы расщепления сложных веществ вне клетки;

2) эндоферменты – катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки.

По объекту действия они подразделяются:

а) ферменты белкового синтеза – связаны с рибосомами,

б) ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ, располагаются в ЦПМ и мезосомах,

в) ферменты метаболизма белка,

г) ферменты, расщепляющие углеводы.

Известно более 2000 ферментов, которые объединены в 6 классов:

1) оксидоредуктазы – окислительно-восстановительные ферменты (к ним относят дегидрогеназы, оксидазы);

2) трансферазы – переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим;

3) гидролазы – ускоряют реакции гидролиза, т.е. расщепление веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы);

4) лиазы – разрывают связи между атомами углерода негидролитическим путем (карбоксилазы);

5) изомеразы – превращают органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза).

6) лигазы – ускоряют синтез сложных соединений из более простых (аспарагинсинтетаза).

Кроме этого различают: а) конститутивные ферменты, которые синтезируются клеткой постоянно (лиазы, оксидазы); б) индуктивно-адаптивные – синтезируются только в присутствии субстрата (пенициллиназа, щелочная фосфатаза).

У патогенных микробов есть еще и ферменты агрессии, которые способствуют проникновению, распространению и паразитированию микроорганизмов в макроорганизме (гиалуронидаза, коллагеназа, нейраминидаза, коагулаза, ДНКаза).

Значение ферментов: 1) катализируют процессы дыхания, питания, размножения;

2) используются в диагностике при определении вида возбудителя по биохимическим свойствам. С этой целью применяют среды «пестрого ряда», на которых изучают способность ферментов микробов разлагать углеводы, белки до конечных продуктов обмена. Каждый вид микроба обладает определенным набором ферментов, что обусловлено генотипом. Наибольшая активность у непатогенных микробов. У патогенных микробов биохимическая активность ниже. Ферменты микробов используют в генной инженерии (рестриктазы, лигазы) для получения биологически активных соединений, для получения уксусной, молочной, лимонной и других кислот, молочнокислых продуктов, в виноделии и других отраслях. Их добавляют в качестве биодобавок в стиральные порошки для уничтожения загрязнений белковой природы.

3.7. Дыхание микроорганизмов

Дыхание микроорганизмов – сопряженный окислительно-восстановительный процесс, при котором происходит перенос электронов и протонов от окисляемого вещества до восстанавливаемого, в результате образуется АТФ – универсальный аккумулятор химической энергии.

Все физиологические процессы – питание, рост, размножение, образование спор, капсул, выработка токсинов – осуществляются при постоянном притоке энергии.

Микробы добывают энергию за счет окисления различных химических соединений:

углеводов (чаще глюкозы), спиртов, органических кислот, жиров. Основную роль в дыхании большинства микроорганизмов играет цикл трикарбоновых кислот, где органические вещества как источник энергии окисляются до углекислого газа и воды, а отнятый от них пиридиновыми и флавиновыми ферментами электрон передается по дыхательной цепи активированному кислороду. Освободившаяся в результате этих процессов энергия закрепляется в АТФ или других органических фосфатах. У микроорганизмов, кроме цикла трикарбоновых кислот, может проходить цикл дикарбоновых кислот, пентозофосфатный шунт.

По типу дыхания все микроорганизмы разделяются на:

1) облигатные (строгие) аэробы,

2) облигатные анаэробы,

3) факультативные (необязательные) анаэробы,

4) микроаэрофилы.

1. Строгие аэробы (Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis) не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода, так как они его используют в качестве акцептора электронов. Молекулы АТФ образуются ими при окислительном фосфорилировании с участием оксидаз и флавинзависимых дегидрогеназ с дальнейшим включением в цикл трикарбоновых кислот. При этом, если конечным акцептором электронов является молекулярный кислород, выделяется значительное количество энергии.

2. Облигатные анаэробы (Сlostridium tetani, Сlostridium botulinum, Сlostridium perfringens, бактероиды) способны жить и размножаться только в отсутствии свободного кислорода воздуха. Они могут образовывать АТФ в результате окисления углеводов, белков, липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата (пировиноградной кислоты). При этом выделяется небольшое количество энергии. Акцептором водорода или электронов у анаэробов может быть сульфат. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. По конечному продукту расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, муравьинокислое, маслянокислое и пропионовокислое брожение. Наличие свободного кислорода для строгих анаэробов является губительным, так как у них нет ферментов (каталаз), способных расщеплять Н2О2; понижен окислительно-восстановительный (редокс) потенциал; отсутствуют цитохромы.

3. Факультативные анаэробы могут расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и без него (стафилококки, кишечная палочка). Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании. Факультативные анаэробы могут осуществлять анаэробное дыхание, которое называется нитратным. Нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака.

Среди факультативных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые растут при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.

4. Микроаэрофилы растут при сниженном парциальном давлении кислорода.

Различают микроаэрофильные аэробы (например, гонококки), которые лучше культивируются при уменьшенном содержании О2 (около 5%), и микроаэрофильные анаэробы, которые способны расти в анаэробных и микроаэрофильных условиях, но не культивируются в обычной воздушной среде или в СО2.

Выделяют также капнофильные микроорганизмы. Они представляют собой бактерии, растущие в присутствии повышенных концентраций углекислого газа (3-5%). К ним относятся бактероиды, фузобактерии, гемофильные бактерии и др.

Методы культивирования строгих анаэробов:

1) Посев уколом в высокий столбик сахарного агара, который сверху заливается слоем вазелинового масла.

2) Посев на среду Китта-Тароцци (МПБ, глюкоза, кусочки печени или мяса в качестве редуцирующих веществ, сверху среда залита слоем вазелинового масла).

3) Удаление воздуха из среды механическим путем. Используют анаэростаты, из которых выкачивается воздух.

4) Замена воздуха другим индифферентным газом, например азотом, аргоном, водородом.

5) Механическая защита от кислорода воздуха (метод Виньяль-Вейона). Берут стеклянную трубку, один конец которой вытягивают в капилляр, расплавляют агар, в него засевают культуру и затем насасывают агар в стерилизованную трубку, затем капилляр запаивают и трубку помещают в термостат. В среде вырастают колонии, которые можно извлечь, распилив трубку.

6) Химическое поглощение кислорода воздуха, например щелочным раствором пирогаллола.

7) Биологический метод – комбинированный посев культур анаэробов и аэробов.

Посев производят на чашку с толстым слоем кровяного агара с глюкозой, разделенную пополам небольшой дорожкой, вырезанной посередине чашки прокаленным скальпелем. На одной половине чашки делают посев культуры аэробов, а на другой – анаэробов. Края чашки смазывают парафином для герметизации и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробов, когда они исчерпывают из чашки кислород, начинается рост анаэробов.

3.8. Рост и размножение бактерий

Рост – увеличение размеров отдельной особи и упорядоченное воспроизведение всех химических компонентов и структур.

Размножение – процесс воспроизведения себе подобных особей, обеспечивающий продолжение существования вида.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты размножаются путем фрагментации нитевидных клеток, могут размножаться спорами.

Грамположительные бактерии делятся путем врастания внутрь клетки синтезирующихся перегородок деления, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате чего формируются гантелевидные фигуры, из которых образуются две одинаковых клетки. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу, приводящая к удвоению молекул ДНК нуклеоида.

Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует увеличение размеров растущей клетки. По мере увеличения объема клетки прикрепленные к ЦПМ хромосомы удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается образованием перетяжки или перегородки деления. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия аутолитических ферментов, которые разрушают сердцевину перегородки деления.

Аутолиз может происходить неравномерно, и тогда делящиеся клетки в одном участке остаются связанными частью клеточной стенки в области перегородки деления. Такие клетки располагаются под углом друг к другу, что характерно для дифтерийных коринебактерий.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит к истощению среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называется периодическим культивированием, а культуру – периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной. При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдаются: придонный рост, диффузное помутнение среды, образование пленки на поверхности среды.

Рост бактерий на жидкой среде подразделяют на несколько фаз или периодов.

І. Исходная стационарная фаза (1-2 часа) – время от момента посева до начала роста.

ІІ. Lag-фаза (запаздывание) – период между посевом бактерий и началом размножения. В лаг-фазе не увеличивается число клеток, но идет метаболизм, увеличивается количество белка, РНК, размеры, и остается неизменным количество ДНК. Идет фенотипическая и генотипическая адаптация к среде, синтезируются индуцибельные ферменты. Продолжительность фазы 4-5 часов.

ІІІ. Log-фаза (фаза логарифмического роста). Характеризуется максимальной скоростью размножения бактерий для данной среды. Число клеток в культуре возрастает в геометрической прогрессии. Продолжительность 5-6 часов. Большинство видов бактерий делится каждые 20-30 мин, хотя существуют виды (микобактерии туберкулеза), которые делятся каждые 18 часов.

ІV. Фаза отрицательного ускорения – начинается замедление размножения из-за истощения питательной среды (около 2 ч).

V. Стационарная фаза максимума – когда количество погибших клеток равно количеству вновь появившихся. Она характеризуется М-концентрацией (концентрация микробных клеток в единице объема достигает максимума, длительность фазы составляет 2 ч).

VI. Фаза ускорения гибели (3 ч).

VII. Фаза логарифмической гибели, когда отмирание клеток происходит с постоянной скоростью (5 ч).

VII. Фаза уменьшения скорости отмирания –остающиеся в живых особи переходят в состояние покоя.

Продолжительность фаз гибели колеблется от десятка часов до нескольких недель.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотной питательной среде, образуют изолированные колонии, которые представляют собой видимые скопления особей одного вида микроорганизмов, образующихся из одной или нескольких клеток.

Колонии бывают выпуклыми, плоскими, куполообразными, вдавленными. Поверхность их – гладкой (S-формы) или шероховатой (R-формы), края – ровные или неровные. Форма колоний может быть различной: круглая, розеткообразная, звездчатая и др. По величине колонии подразделяют на крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

Колонии отличаются также по консистенции (сухие, слизистые, влажные), цвету, который зависит от наличия пигментов.

Характер роста на плотных и жидких питательных средах относят к культуральным свойствам бактерий.

3.9. Питательные среды, их классификация

Питательные среды необходимы для получения чистой культуры микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, для длительного сохранения микробов в лабораторных условиях.

Классификация питательных сред. По составу: а) естественные – это натуральные продукты животного и растительного происхождения (молоко, яйца, сыворотка, кровь); б) искусственные – готовят по определенным рецептам из отваров животного происхождения с добавлением солей и пептона; в) синтетические – содержат определенные химические соединения в точно указанных концентрациях (например, среда Сотона для возбудителя туберкулеза).

По консистенции: 1) жидкие – МПБ (мясо-пептонный бульон), пептонная вода;

их используют для изучения биохимических свойств микробов, накопления биомассы; 2) полужидкие – обычно используют для сохранения культур микробов; 3) плотные – мясо-пептонный агар (МПА) – используют для выделения чистой культуры, получения отдельных колоний, определения количественного роста, антагонистических свойств бактерий, чувствительности к антибиотикам).

По назначению: 1) универсальные – МПА, МПБ; 2) специальные – используют для выращивания определенных видов микробов (сахарный бульон - для стрептококков, кровяной агар – для менингококков, среда Сабуро – для грибов); 3) элективные – используют для выделения определенных видов микробов, другие микробы или совсем не растут на таких средах, или их развитие сильно задерживается (щелочная пептонная вода с рН 9,0 для Vibrio choleraе); 4) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств микробов и отличия (дифференцировки) одного вида микроба от другого по характеру их ферментативной активности. Например, среда Эндо, в состав которой входят МПА, лактоза и фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная среда имеет светло-розовый цвет. При разложении лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом натрия, при этом колонии окрашиваются в ярко-красный цвет. Поэтому Е. coli, которая разлагает лактозу, при росте на среде Эндо образует красные колонии, а сальмонеллы и шигеллы – бесцветные, т.к. они лактозу не разлагают.

Требования, предъявляемые к питательным средам: стерильность; прозрачность; достаточное содержание основных органических и зольных элементов; наличие факторов роста (витамины, липиды); соответствующий рН (7,2-7,4); изотоничность (0,85% NaCl); определенный окислительно- восстановительный потенциал и вязкость.

IV. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ

Начало истории вирусологии связано с именем Д.И. Ивановского, который в 1892 г. опубликовал работу по изучению мозаичной болезни табака. Он отметил, что возбудитель – мельчайшее существо, проходит через бактериальные фильтры, не растет на питательных средах, невидим в световом микроскопе.

В 1898 г. Леффлер и Фрош открыли вирус ящура.

В 1901 г. Рид и Кэррол выделили вирус из трупов людей, умерших от желтой лихорадки.

Д Эррель в 1910 г. обнаружил вирусы бактерий – бактериофаги.

Вирусы широко распространены в природе, окружающей среде и практически вездесущи. Они находятся в воздухе, воде, пище, космосе и в живых организмах, а вирусы бактерий – бактериофаги – в бактериях.

Медицинская вирусология изучает лишь вирусы, патогенные для человека или значимые для медицины (бактериофаги).

Основной задачей медицинской вирусологии является изучение морфологии, физиологии, генетики, экологии и эволюции вирусов и разработка методов диагностики, лечения и профилактики инфекций у человека.

Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты, имеющие собственный геном, структурные белки и ферменты, способные репродуцироваться только в чувствительных к ним клетках животных, растений, бактериях. Это своеобразная форма жизни, биологически активные структуры, которые подчиняются законам эволюции, не имеют типичного клеточного строения, состоят из белков и одной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), где закодирована вся генетическая информация вируса. Вирусы не обладают собственными метаболическими и энергетическими системами; их размножение происходит с использованием белоксинтезирующих и энергетических систем клетки хозяина, поэтому они являются облигатными внутриклеточными паразитами и размножаются в цитоплазме или в ядре клеток. Они используют рибосомы клетки хозяина для синтеза собственных белков. Имеют особый способ размножения

– дизъюнктивную (разобщенную) репродукцию: в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты и белки вирусов, а затем происходит сборка их в вирусные частицы. Возможен второй путь – генетическая информация вируса интегрируется с геномом клетки и образуется провирус (например, у ретровирусов).

Вирусы имеют малые размеры (от 15 до 250 нм и более). Как и другие формы жизни вирусы обладают наследственностью и изменчивостью, многие вирусы сохраняют жизнеспособность при замораживании, высушивании, резистентны к антибиотикам, но чувствительны к высокой температуре.

Вирус вне клетки – вирион, имеет нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) и белковую оболочку, способен кристаллизоваться, обладает инфекционностью, т.е.

благодаря адресным белкам, белкам прикрепления, ферментам проникает в клетку, где его называют «вирус», интегрированный с ДНК хозяина вирус называется провирус.

Кроме типичных вирусов известны необычные инфекционные частицы – прионы и вироиды.

Прионы – белковые инфекционные частицы, которые имеют вид фибрилл размером 10-20х100-200 нм, массу 30 кД, не содержат нуклеиновой кислоты, устойчивы к нагреванию, к действию протеаз, ультрафиолетовых лучей, ультразвука и ионизирующей радиации. Прионы возникают как продукты мутации собственного гена или попадают в организм при употреблении мяса животных, содержащего прионы. Прионы накапливаются в пораженном органе, не вызывая цитопатогенного действия (ЦПД), иммунного ответа и воспалительных реакций. Они могут блокировать или активировать гены человека или животного.

Вироиды – это небольшие молекулы кольцевой суперспирализованной РНК, не содержащие белка, вызывающие заболевания у растений, возможно и у млекопитающих.

<

4.1. Классификация вирусов

В силу своих особенностей вирусы выделены в отдельное надцарство Vira, в котором по типу нуклеиновой кислоты различают рибовирусы и дезоксирибовирусы (табл. 1).

Подцарства делятся на семейства, которые подразделяются на подсемейства и роды. Вид – совокупность вирусов, имеющих почти идентичные геном (ДНК или РНК), свойства и способность вызывать определенный патологический процесс.

Названия семейства имеют окончание viridae, подсемейство – virinae, рода – virus.

Признаки, используемые для классификации вирусов: 1) тип нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК; 2) их структура (однонитевая, двунитевая, линейная, кольцевая, фрагментированная, нефрагментированная с повторяющимися и инвертированными последовательностями); 3) структура, размеры, тип симметрии, число капсомеров; 4) наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида); 5) антигенная структура;

6) феномены генетических взаимодействий; 7) круг восприимчивых хозяев; 8) географическое распространение; 9) внутриядерная или цитоплазматическая локализация;

10) чувствительность к эфиру и детергентам; 11) путь передачи инфекции.

Для определения принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие фермента обратной транскриптазы.

Вирусы, вызывающие инфекционные процессы у человека, входят в состав как ДНК-содержащих, так и РНК-содержащих вирусных семейств (см. табл. 1).

–  –  –

По строению различают два типа вирусных частиц – простые и сложные. В составе простых вирионов есть ДНК или РНК и белки. У сложных в суперкапсиде содержатся липиды, полисахариды.

Внутренняя структура простых и сложных вируосв сходна, сердцевина вируса – вирусный геном, который содержит от 3 до 100 и более генов.

Морфология и структура вирусов. Простые вирусы имеют одну белковую оболочку – капсид, который состоит из капсомеров – белковых молекул, форма укладки которых определяет тип симметрии. Капсид представлен -спиральными белками, способными к полимеризации.

Сложные вирусы имеют внешнюю оболочку – суперкапсид, расположенную поверх капсида. В состав суперкапсида входит внутренний белковый слой – М-белок, затем более объемный слой липидов и углеводов, извлеченных из клеточных мембран клетки хозяина. Вирусспецифические гликопротеиды проникают внутрь суперкапсида, образуя фигурные выпячивания (шипы, фибры), которые выполняют рецепторную функцию.

Различают 3 типа симметрии: 1) спиральный, когда капсомеры укладываются по спирали – винтообразная структура нуклеокапсида; 2) кубический (икосаэдрический), когда капсомеры укладываются по граням многогранника (12-20-гранника) – в основе лежит фигура икосаэдра (20-гранника). В зависимости от типа перегруппировки и числа субъединиц число капсомеров будет равным 30, 20, или 12. Вирионы со сложным капсидом, построенным более чем из 60 капсомеров, содержат группы из 5 субъединиц – пентамеры, или из 6 субъединиц – гексамеры; 3) смешанный тип симметрии (у бактериофагов).

Комплекс капсида и генома вируса называют нуклеокапсид. Сложные вирусы имеют суперкапсид (пеплос). Эта поверхностная оболочка вируса, состоит из липидов и белков клеточного происхождения.

Вирусные белки бывают: 1) структурные; 2) неструктурные.

Среди структурных различают: капсидные – входят в состав капсомеров и образуют футляр, защищающий нуклеиновую кислоту; суперкапсидные – это гликопротеиды, которые формируют шипы на поверхности суперкапсида и выполняют: адресную функцию – узнают чувствительную клетку и адсорбируются на ней; прикрепительные белки, которые взаимодействуют со специфическими рецепторами клетки;

белки слияния – способствуют слиянию вирусной и клеточной мембран и приводят к образованию симпластов; геномные – обладают антигенными свойсвами, участвуют во взаимодействии с клеткой.

Среди неструктурных белков различают: предшественники вирусных белков (нестабильные); РНК- и ДНК-полимеразы – участвуют в репликации вирусного генома;

регуляторные белки – участвуют в репродукции вируса.

Функции белков: обладают антигенными и иммуногенными свойствами; участвуют в распознавании клетки и взаимодействии с ней; защищают геном от нуклеаз;

обеспечивают тип симметрии.

Липиды входят в состав суперкапсида и представляют смесь нейтральных фосфо- и гликолипидов, многие из них – продукты мембраны клеток хозяина.

Они обусловливают инфекционность, чувствительность или устойчивость к эфиру; стабилизируют вирусную частицу.

Углеводы входят в состав гликопротеидов суперкапсида. Углеводы и липиды – составная часть гемагглютинина, который вызывает склеивание эритроцитов и обладает антигенной специфичностью.

Различают вирионные и вирусиндуцированные ферменты вирусов. К вирионным относят ферменты транскрипции и репликации (ДНК и РНК-полимеразы); обратную транскриптазу (у ретровирусов), АТФ-азы, эндо- и экзонуклеазы, нейраминидазы.

К вирусиндуцированным относятся ферменты, о которых имеется только информация в вирусном геноме, а появляются они в клетке. Это РНК-полимеразы тога-, орто-, пикорна- и парамиксовирусов; и ДНК-полимеразы у покс- и герпесвирусов.

Нуклеиновые кислоты обеспечивают наследственные признаки; являются хранителями генетической информации; необходимы для репродукции вирусов, многие из них могут вызывать инфекционный процесс самостоятельно, достаточно их проникновения в клетку.

Вирусная ДНК. Молекулярная масса равна 1,106-1,108 дальтон. ДНК может быть одно- или двунитчатой, фрагментированной и сверхспирализованной, линейной или кольцевой, содержит несколько сотен генов. В каждой нити ДНК есть нуклеотидные последовательности, а на концах есть прямые или инвертированные (повернутые на 180о) повторы, которые являются маркерами для отличия вирусной ДНК от клеточной. Эти повторы обеспечивают способность ДНК замыкаться в кольцо для последующих репликации, транскрибирования и встраивания в клеточный геном. Генетическая информация инфекционной ДНК транслируется на мРНК в клетке с помощью полимераз.

Вирусная РНК может быть одно- и двунитчатой, линейной, кольцевой, фрагментированной. У РНК-содержащих вирусов генетическая информация закодирована в РНК таким же кодом, как в ДНК всех других вирусов и клеточных организмов. Вирусные РНК по своему химическому составу не отличаются от РНК клеточного происхождения, но характеризуются разной структурой.

Наряду с типичной для всех РНК однонитевой формой у ряда вирусов имеется двунитевая РНК. В составе однонитевых РНК имеются спиральные участки типа двойной спирали ДНК, образующиеся вследствие спаривания комлементарных азотистых оснований. Вирусы с однонитчатой РНК делятся на 2 группы: (+)РНК (положительный геном) и (-)РНК (отрицательный геном). Вирусная (+)РНК инфекционная и обладает функциями информационной РНК. Она может передовать генетическую информацию на рибосомы, как иРНК. Вирусы с отрицательным геномом не обладают инфекциозностью, т.к. нить (-)РНК выполняет только наследственную функцию и не обладает функцией иРНК. В зараженной клетке на матрице вирусной геномной РНК с помощью фермента транскриптазы осуществляется синтез РНК-комплементарной геному.

Нити (+)РНК вирусов в отличие от (-)РНК имеют специальные концы в виде «шапочки» для специфического узнавания рибосом.

Патогенность вирусов обусловлена совокупностью их свойств: способностью проникать в макроорганизм, связываться с клеточными мембранами и проникать в клетку, управлять метаболизмом и белоксинтезирующей функцией клетки, обеспечивать транскрипцию и репликацию собственного генома и осуществлять весь цикл репродукции вирусов. Все эти свойства зависят от генома вирусов и наличия соответствующих структурных белков и ферментов. Репродукция вирусов приводит к развитию патологии: цитопатогенному (разрушающему) действию, развитию воспаления, повреждению различных клеток и тканей.

4.3. Взаимодействие вируса с клеткой

Различают 3 типа взаимодействия: продуктивный тип – репродукция завершается образованием вирусного потомства; абортивный тип – не образуются новые вирусные частицы, т.к. инфекционный процесс прерывается на одном из этапов; интегрированный тип – вирогения – характеризуется встраиванием вирусной ДНК в хромосому клетки хозяина.

РНК-вирусы размножаются в цитоплазме, кроме вирусов гриппа и ретровирусов, которые осуществляют это в ядре. Однако ДHК-поксвирусы репродуцируются в цитоплазме.

Репродукция вирусов протекает в несколько стадий (рис. 7).

1. Адсорбция вируса на специфических рецепторах чувствительной клетки благодаря белкам прикрепления (адгезинам) и адресным. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки 10 4-105. Белки адгезины имеют форму нитей (фибры у аденовирусов) или шипов у орто-, парамиксовирусов, рабдовирусов. Адсорбция определяется неспецифическими слоями межмолекулярного натяжения и специфической комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов. Вначале происходит единичная связь вириона с рецептором – такое прикрепление непрочное – адсорбция носит обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция должны появиться множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т.е. стабильное мультивалентное прикрепление.

На клетках существуют различные структуры-рецепторы, к которым прикрепляются вирусы своими рецепторами. У орто- и парамиксовирусов их роль выполняют ганглиозиды (сиалосодержащие гликолипиды), у вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) – гликопротеид 120 и др. Примеры клеточных рецепторов: CD4 – молекула для ВИЧ, рецепторы для С3-комплемента – для вируса Эпштейна-Барра, адренергические рецепторы – для реовирусов.

2. Проникновение вируса в клетку может идти двумя путями: виропексиса и слияния вирусной и клеточной мембран.

При виропексисе (эндоцитозе) происходит инвагинация участка клеточной мембраны, образование внутриклеточной вакуоли, а далее вакуоль с вирусом может попадать в разные участки цитоплазмы или в ядро клетки.

Процесс слияния осуществляется с помощью вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочек, которые сливаются с плазматической мембраной клетки хозяина.

У парамиксовирусов имеется специальный F-белок, вызывающий слияние клеточных и вирусных мембран. Сходные белки имеются у других вирусов. У вируса гриппа это гемагглютин, который обусловливает адсорбцию его на мембране клетки.

Белки слияния служат важнейшими факторами вирулентности вирусов. Они приводят к образованию клеточного синцития (например, при ВИЧ-инфекции).

3. «Раздевание» вирионов или депротеинизация – это процесс освобождения нуклеиновой кислоты вируса от окружающей ее оболочки с последующим проникновением ее в цитоплазму или в ядро клетки. «Раздевание» вириона начинается сразу же после его прикрепления к клеточным рецепторам и продолжается в эндоцитарной вакуоли, а также в ядерных порах и околоядерном пространстве.

4. Биосинтез компонентов вирусов. Нуклеиновая кислота, проникшая в клетку, несет генетическую информацию, которая конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать вирусные белки и нуклеиновые кислоты, которые идут на построение вирусного потомства.

Так как генетический аппарат вирусов различен, то передача наследственной информации и синтез ДНК и РНК отличаются.

При инфицировании ДНК-содержащим вирусом идет транскрипция ДНК-вируса на иРНК с помощью ДНК-зависимой РНК полимеразы, которая может быть вирусной при репродукции его в цитоплазме или клеточной, если это происходит в ядре (аденовирусы и др.). Причем, если это происходит в цитоплазме (поксвирусы), то вирусная РНКполимераза считывает часть ДНК-генома и запускает синтез мРНК, а она – образование первичных ферментов для репликации вирусной ДНК. Эти ферменты индуцируют считывание второй части исходной ДНК – появляется «поздняя» мРНК, обеспечивающая синтез структурных белков.

При инфицировании РНК-содержащим вирусом РНК синтезируется с помощью РНК-полимеразы на матрице вирусной РНК; синтез вирусных белков происходит в цитоплазме, а РНК в ядре или в цитоплазме (пикорнавирусы, тогавирусы).

Для (+)РНК-нитевых вирусов (флави-, пикорна-, тогавирусы) функцию информационной РНК выполняет сам геном, который является матрицей для новых молекул РНК, на основе которых в рибосомах синтезируются вирусные белки.

У (-)РНК-вирусов (орто-, парамиксо-, рабдовирусы) геном не выполняет функцию информационной РНК, не обладает инфекционностью, но вирусы имеют РНКполимеразы, необходимые для синтеза РНК, комлементарных геному, т.е. мРНК, которые обеспечивают синтез вирусных белков.

Иначе осуществляется репликация РНК-содержащих ретровирусов (онкогенные, ВИЧ), в составе которых есть обратная транскриптаза или ревертаза (см. рис. 7). Уникальность этого фермента состоит в его способности индуцировать синтез цепи вирусной ДНК на матрице вирусной РНК. Этот процесс называется обратной транскрипцией. На матрице одной ДНК-цепи синтезируется комплементарная ей вторая;

образовавшаяся двунитевая ДНК переносится в ядро. Клеточная ДНК подвергается сплайсингу (под влиянием эндонуклеаз) с образованием рекомбинантов с этой вирусной ДНК. Возникает ДНК-провирус. С помощью клеточной ДНК-зависимой РНКполимеразы интегрированный в ДНК клетки ДНК-провирус считывается с последующим синтезом вирусных (+)РНК и мРНК, которые определяют образование вирусных структурных белков и ферментов. Продолжающийся синтез цепей ДНК обеспечивает новые вирионы геномом.

Количество генов в вирусном геноме ограничено, поэтому есть дополнительные механизмы для передачи большей информации, чем несет вирусная нуклеиновая кислота. Например, транскрипция информации с переписывающихся участков ДНК на иРНК может происходить путем сплайсинга (вырезание бессмысленных кодонов и сшивание концов), а также вследствие считывания антикодонами тРНК с разных нуклеотидов одной и той же молекулы иРНК, в результате возникают новые триплеты и увеличивается транслируемая информация.

Формирование нуклекапсидов происходит, когда синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки специфично узнают друг друга и соединяются гидрофобными солевыми и водородными связями. Основой самосборки простых вирионов служит способность вирусных полипептидов соединяться в капсомеры, образующие многогранник. Полипептиды могут также окружать в виде спирали вирусную нуклеиновую кислоту.

Для вирусов важен синтез М-белка (матриксный белок), который участвует в сборке вирионов.

Нередко простые вирионы монтируются на репликативных комплексах, которыми служат мембраны эндоплазматического ретикулума. Сборка нуклеокапсида сложных вирионов начинается на репликативных комплексах и продолжается на плазматической мембране, где присутствуют гликопротеиды суперкапсида.

Нуклеокапсиды вируса герпеса и многих ДНК-содержащих вирусов монтируются в ядре клетки на ее мембране. Затем они отпочковываются и приобретают суперкапсидную оболочку. Окончательное формирование вириона осуществляется в мембранах эндоплазматического ретикулума и в аппарате Гольджи.

Выход вирусов из клетки происходит: 1) путем взрыва оболочки (клетка при этом погибает), что характерно для вирусов, не имеющих суперкапсида (пикорнавирусы); 2) путем почкования, что присуще вирусам, имеющим суперкапсид. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды фиксируются на клеточной плазматической мембране и выпячивают ее, образуется «почка», которая затем отделяется от клетки (орто-, парамиксо-, рабдовирусы). Клетка при этом сохраняет жизнеспособность.

Время, необходимое для репродукции, колеблется от 5-6 часов (для вируса гриппа) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы).

Интеграция с клеточным геномом. Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) вирусов могут быть включены в геном клетки с помощью эндонуклеаз, рестриктаз и лигаз.

Вирусная ДНК в кольцевой форме интегрируется в клеточный геном. Место включения в геном определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями определенных участков (ДНК-сайтов). После включения в геном клетки ДНК-вируса становится провирусом, который может изменять клеточный метаболизм, что приводит к возникновению аутоиммунных, хронических заболеваний и опухолей. Под влиянием физических и химических факторов ДНК-провирус вырезается из клеточной хромосомы и становится обычным вирусом.

Геном РНК-вирусов включается в клеточный геном при участии обратной транскриптазы, образующей ДНК-транскрипт одной цепи на матрице РНК (см. рис. 7).

Образовавшаяся нить ДНК служит матрицей для образования второй нити, а затем двуцепочечный ДНК-транскрипт замыкается в кольцо и встраивается в клеточный геном. Этот процесс интеграции РНК-вируса в геном клетки называют вирогенией. Как и в случае с ДНК-провирусами в клетке могут изменяться свойства, что приводит к заболеваниям.

Виды вирусной инфекции. На клеточном уровне выделяют автономные инфекции, если вирусный геном реплицируетсЯ независимо от клеточного и интеграционные инфекции, если вирусный геном включается в состав клеточного. Автономная инфекция делится на продуктивную, при которой образуется инфекционное потомство и абртивную, при которой инфекционный процесс обрывается и новые инфекционные частицы не образуются.

По течению различают острую и персистирующую инфекции. Острая инфекция в зависимости от судьбы зараженной клетки делится на цитолитическую и нецитолитическую, цитолитическая заканчивается образованием ЦПД. Она сопровождает продуктивную фазу взаимодействия вируса с клеткой. Персистирующая инфекция может протекать в виде вирусоносительства, латентной, хронической или медленной инфекции. Латентная – это инфекция без выделения вируса в окружающую среду. Хроническая инфекция сопровождается выделением вируса и периодами ремиссии и обострения. Медленная инфекция характеризуется длительным инкубационным периодом и последующим длительным прогрессирующим течением с летальным исходом.

На уровне организма вирусные инфекции делятся на очаговые – когда размножение вирусов происходит у входных ворот и генерализованные – когда вирус разносится по различным органам и тканям.

Особенности вирусных инфекций.

1. Внутриклеточный паразитизм вирусов приводит к гибели клеток.

2. Размножение некоторых вирусов в клетках иммунной системы приводит к развитию иммунодефицитных состояний (вирус кори, ВИЧ, гепатита В, С).

3. Некоторые вирусы способны интегрировать с геномом клетки хозяина (ВИЧ, онкогенные РНК-содержащие вирусы).

4. Некоторые вирусы обладают тератогенным действием (вирус цитомегалии, краснухи).

5. Диагностика вирусных инфекций не проводится в каждом случае заболевания из-за массовости.

6. Вирусы могут вызывать медленные инфекции (вирусы кори, ВИЧ, бешенства, гепатит В, герпес).

7. Некоторые вирусы могут провоцировать развитие опухолей (герпесвирусы, гепатита В, С, аденовирусы). гепатита В, С

4.4. Культивирование и индикация вирусов

Культивирование вирусов человека проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, для получения диагностических и вакцинных препаратов. Так как вирусы абсолютные паразиты, то их культивируют в организме или в живых клетках.

Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы, культуры клеток.

Лабораторных животных разными способами заражают (учитывают тропизм вирусов: ортомиксовирусами заражают интраназально, нейровирусами – субдурально). На основании типичных признаков заболевания и патоморфологических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, т.е. проводить индикацию вирусов.

Куриный эмбрион является удобной моделью для культивирования вирусов, т.к.

полости его стерильны, защищены твердой оболочкой. Индикацию вируса в курином эмбрионе проводят: по гибели эмбриона; помутнению хорион-аллантоисной оболочки; образованию бляшек на оболочке; в реакции гемагглютинации (происходит склеивание эритроцитов под действием гемагглютинина вирусов, который расположен в шипах суперкапсида).

Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размножению.

Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные фибробласты, человеческие фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред – наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бычей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.

Некоторые вирусы размножаются в органных культурах – это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.

О размножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопатогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; феномену гемадсорбции; цветной пробе.

Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток – слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомиелита, Коксаки); частичной дегенерацией – округлением клеток, слиянием и образованием симпластов (вирус кори).

Образование включений в клетках – это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы – внутриядерные включения.

Появление бляшек – зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тонким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, поэтому данный тест используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.

Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды.

При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет.

При отсутствии ЦПД можно поставить реакцию интерференйии – исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная), если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций. Используют методы экспресс-диагностики для обнаружения возбудителя или его антигенов в клиническом материале (ИФА, РИА, метод молекулярной гибридизации, ИФА, ПЦР, ВИЭФ, РПГА, электронной микроскопии, иммуно электронной микроскопии).

Выделение вируса и его индикацию и идентификацию проводят в вирусологическом методе диагностики. С этой целью необходимо обеспечить взятие материла от больного, правильную транспортировку его в лабораторию и грамотного заполнения сопроводительных документов. Выделение вируса из клинического материала проводят путем заражения культур клеток куриных эмбрионов и лабораторных животных.

Индикацию вирусов проводят по гибели эмбрионов, постановке РГА, ЦПД в культуре клеток.

Идентификацию вирусов проводят с помощью серологических методов (постановки РТГА, РСК, ИФА, РИА, РН). Серологическая диагностика вирусных инфекций проводится с парными сыворотками больного, взятыми в острой фазе заболевания и через 10-14 дней. Обнаружение четырехкратного и более повышения титра антител рассматривается как диагностический признак острой вирусной инфекции.

Принципы химиотерапии и химипрофилактики вирусных инфекций. Мишенью действия противовирусных препаратов являются процессы адсорбции, проникновения вируса в клетку, депротеинизации, транскрипции, репликации и сборки вирусов.

1. Аномальные нуклеозиды ингибируют функции вирусных полимераз (иоддезоксиуредин, ацикловир при лечении герпеса).

2. Производные адамантамина гидрохлорида. Ремантадин ингибирует репролукцию вирусов гриппа, кори, краснухи

3. Тиосемикарбазон подавляет синтез вирусных белков и сборки вирусных частиц, активен против вирусов натуральной оспы.

4. Ингибиторы протеаз (гордокс, контрикал, аминокапроновая кислота).

5. Нарушают синтез вирусных белков – интерфероны.

4.5. Бактериофаги

Бактериофаги (от бактерий и греч, рhagos-пожиратель) – вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их лизис. Они не размножаются в эукариотических клетках.

В 1910 г. Ф. д’Эрелль обнаружил лизис бактерий дизентерии после добавления к ним бесклеточного фильтрата испражнений больных дизентерией и назвал фактор лизиса бактериофагом.

Бактериофаги широко распространены в природе, их обнаруживают в воде, почве, пищевых продукта, в различных выделениях из организма человека и животных.

Морфология. Большинство фагов под электронным микроскопом напоминают по форме головастика или сперматозоида; имеют головку и отросток (рис. 8), но встречаются и другие морфологические варианты. Размеры фагов – 20-200 нм. Выделяют пять основных типов бактериофагов. К 1 типу относятся ДНК-овые фаги нитевидной формы, которые лизируют бактерии, содержащие F- или R-плазмиду; II тип – РНК-содержащие фаги с рудиментом отростка; III тип – фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком; IV тип – фаги с несокращающимся чехлом отростка и двунитевой ДНК (Т1, Т5 и др.); V тип – ДНКсодержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, который заканчивается базальной пластинкой. Наиболее изучены Т-фаги (англ. type – типовые) E.coli – группа колидизентерийных фагов, включающая 7 представителей Т1-Т7.

Структура. Фаги имеют нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) и белок. Двунитевая ДНК фагов замкнута в кольцо и упакована в головке. Некоторые фаги содержат однонитевую ДНК или РНК. Капсид головки фага образован белками по кубическому типу симметрии.

В частицах некоторых фагов под чехлом дистальной части отростка (фаг T2) содержится фермент лизоцим, АТФ-аза и ионы кальция. Внутри головки (фаг T2) имеется внутренний белок, связанный с нуклеиновой кислотой, который содержит полиамины (спермин, путресцин). Он обеспечивает суперспирализацию фаговой ДНК и ее упаковку в головке фага. Отросток (хвост) фага имеет полый белковый стержень (построен по типу спиральной симметрии), покрытый сократительным чехлом. Белки чехла связаны с молекулами АТФ и ионами кальция. Чехол способен сокращаться.

Под чехлом в конце отростка может находиться лизоцим. Отросток обычно заканчивается базальной пластинкой, имеющей короткие зубцы, от которых отходят тонкие нити – структуры, обеспечивающие адсорбцию фага на бактерии.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действую физических и химических факторов, чем бактерии и вирусы. Они выдерживают давление до 6 000 атм, сохраняют свою активность при рН от 2,5 до 8; не все дезинфицирующие вещества (0,5% раствор фенола, 1% раствора сулемы, этиловый спирт, эфир, хлороформ) разрушают фаги. Однако ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация, 1% раствор формалина, температура 65-70 С инактивируют их.

Они сохраняются длительное время при высушивании в запаянных ампулах, замораживании, в глицерине при температуре 185 С.

Антигенные свойства. Бактериофаги обладают иммуногенными свойствами, вызывают синтез антител (AT), которые не дают перекрестных реакций с антигенами (АГ) бактерий, инфицированных фагами. Для идентификации фагов применяют реакцию нейтрализации с гомологичной антисывороткой, реакцию преципитации, реакцию агглютинации. По антигенам фаги делятся на серотипы.

Взаимодействие фагов с бактерией включает несколько стадий.

Адсорбция фагов на бактерии осуществляется рецепторами фага, имеющимися на конце отростка, которые связываются с поверхностными структурами бактериальной стенки. Бактериофаги не адсорбируются на бактериях, лишенных клеточной стенки (протопластах). Некоторые фаги адсорбируются на F-пилях бактерий. Адсорбция фагов зависит от рН среды, температуры, наличия некоторых веществ (триптофана для Т2-фага). На одной клетке может адсорбироваться до 300 фагов.

Внедрение нуклеиновой кислоты фага (инъекция фага). Базальная пластина отростка и его лизоцим лизируют участок клеточной стенки бактерии. Одновременно в чехле высвобождаются ионы кальция, активирующие АТФ-азу, происходит сокращение чехла и вталкивание стержня отростка через мембрану в бактерию. При этом фаговая ДНК (РНК) через стержень впрыскивается в цитоплазму клетки, белки головки и отростка остаются снаружи.

Репродукция фага. Проникнув в клетку ДНК фага переходит в латентное состояние (скрытая – эклипс-фаза). В этот период она подавляет синтетические клеточные процессы клетки и индуцирует синтез фаговых белков.

Синтез фаговых белков. Бактериальная РНК-полимераза транскрибирует фаговую ДНК в мРНК, по которой в рибосомах синтезируются ранние белки фага и его РНК-полимераза. Последняя обеспечивает транскрипцию поздних белков оболочки..

Репликацию фаговой нуклеиновой кислоты осуществляют синтезированные в клетке ДНК-полимеразы. ДНКбактерии нередко расщепляется и служит материалом для синтеза нуклеиновой кислоты фага.

Сборка фаговых частиц заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки. Весь процесс осуществляется за 40 минут. Выход зрелых фагов обычно происходит путем лизиса бактериальной клетки. Лизис чаще всего осуществляется фаговым лизоцимом. Фаги, лизировавшие бактерии, называют вирулентными и они могут находиться в двух состояниях: 1) в виде зрелого фага – метаболически инертного, существующего вне клетки, и 2) вегетативного, который размножается в клетке и вызывает «продуктивную» инфекцию у бактерий. Некоторые ДНКсодержащие фаги (фаг fd) выходят из клетки путем «просачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерии, где упаковываются в капсиды.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуются высокой специфичностью. Моновалентные фаги взаимодействуют только с бактериями определенного вида, а типовые фаги – только с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий. Типоспецифические бактериофаги используют для выявления соответствующих бактерий – т.е. для их фаготипирования. Поливалентные фаги могут взаимодействовать с родственными видами бактерий.

Умеренные фаги и лизогения. Взаимодействие фага с клеткой иногда ведет к интеграции его генома в геном бактерии. Фаги, вызывающие данный тип взаимодействия, называют умеренными. ДНК умеренного фага встраивается в ДНК бактерии и такой фаг называют профагом. Таким образом, умеренные фаги бывают в трех состояниях: зрелый фаг, вегетативный фаг и профаг. Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении реплицируется синхронно с ее геномом, но не вызывает бактериолизиса, а передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.

Явление интеграции генома бактерии с умеренным фагом в состоянии профага называется лизогенией, а бактерии, несущие профаг – лизогенными. Бактериальная клетка, несущая в себе профаг, становится резистентной к действию идентичного фага. В клетке вырабатываются репрессоры – белки генома профага, препятствующие его размножению и проникновению в клетку идентичных фагов. Связь генома профага и бактерии непостоянна и под действием ультрафиолетовых лучей, радиации, некоторых химических веществ возможно образование зрелых форм фага и лизис бактерии. Эти фаги, бывшие профагами, могут со своей ДНК переносить группы генов бактерии в другую бактерию, в которой они снова переходят в профаг. Бактерия, зараженная таким фагом, приобретает новые свойства за счет генов предыдущей бактерии, перенесенных дефектным фагом.

Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага обозначается как фаговая лизогенная конверсия. Она может происходить у многих видов микроорганизмов и сопровождается изменением их различных свойств: культуральных, биохимических, антигенных, токсигенных, чувствительности к антибиотикам. Причиной ее может быть наряду с переносом генов других бактерий с помощью фага, также активация молчащих генов бактерий, когда гены профага выступают в роли промоторов.

Явление переноса генов бактерий умеренными фагами называют трансдукцией.

Эти фаги обычно неспособны образовывать фаговое потомство, если в их нуклеиновую кислоту встроилась часть нуклеиновой кислоты бактериальной клетки. Трансдуцирующие фаги используют в качестве векторов (переносчиков) в генной инженерии.

С их помощью в бактерии переносят гены человеческих клеток, синтезирующие гормоны, цитокины и др.

Получение фагов. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат исходного материала (вода, фильтрованная суспензия фекалий и др.), пропуская его через бактериальные фильтры.

Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 370С в течение 18-24 часов. Фаги размножаются, и после лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр.

Титрование бактериофагов проводят в жидкой (метод Аппельмана) или твердой (метод Грациа) питательной среде.

В пробирках с МПБ готовят десятикратные разведения бактериофага. В каждую пробирку вносят соответствующую бактериальную культуру по 0,1 мл. Через сутки инкубации в термостате при 370С оценивают результаты. Наибольшее разведение фага, в котором отсутствует рост бактерий, принимаются за титр фага.

По методу Грациа на чашки с МПА наносят смесь фагов и бактерий. Для этого к расплавленному и остуженному до 55 С агару добавляют деситикратные разведения бактериофага и соответствующую тест культуру. Смесь быстро выливают на поверхность МПА. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37 С. Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара.

Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и освобождает потомство фага, состоящие из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток фагом на сплошном бактериальном газоне появляются стерильные пятна. Число этих пятен соответствуют количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Титр фага – максимальное разведение фага, при котором еще отмечаются стерильные пятна лизиса.

Практическое использование фагов. Применение фагов основано на строгой специфичности их действия. Фаги используют в диагностике инфекционных болезней: проводят идентификацию выделенных культур микроорганизмов – фаготипирование, т.е. устанавливают с помощью фага принадлежность неизвестной выделенной культуры бактерии к определенному виду или типу. Фаготипирование имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет установить источник и пути распространения инфекций; с помощью тест-культуры можно определить неизвестный фаг в исследуемом материале, что указывает на присутствие в нем соответствующих возбудителей.

Фаги применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней. Налажено производство брюшнотифозного, сальмонеллезного, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фагов и комбинированных фагов. Фаги выпускают в жидком виде, в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей, свечей.

Бактериофаги используют для изучения структуры генома бактерий и в генной инженерии в качестве вектора – переносчика генов человека в бактерии. В настоящее время получены культуры бактерий, синтезирующие интерферон, интерлейкины, гормоны человека.

–  –  –

Генетика – это наука о наследственности и наследуемой и ненаследуемой изменчивости.

В настоящее время генетика является подлинным фундаментом для молекулярной и клеточной биологии. В свою очередь, результаты исследований в области генетики микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов и простейших) оказались весьма важными для выяснения всех основных генетических закономерностей и принципов.

Это связано с тем, что изучение структуры и функции генетического материала, который может самовоспроизводиться, подвергаться изменениям и проявляться самыми разными способами, является чрезвычайно сложной задачей. Поэтому более простой по устройству организм является и наиболее удобной моделью для изучения этих процессов. Впоследствии было выявлено, что механизмы наследования признаков у высших организмов и бактерий имеют очень много общего. Бактерии и вирусы (в том числе вирусы бактерий – бактериофаги) оказались наиболее подходящими объектами для изучения природы генетического материала, его организации и функционирования.

Это было обусловлено следующими преимуществами работы с микроорганизмами:

1. Гаплоидное строение генома, т.е. у бактерий имеется лишь одна хромосомануклеоид, что позволяет оценить генетические изменения уже в первом поколении бактериальных клеток.

2. Высокая скорость размножения.

3. Относительно простое строение (особенно у вирусов).

4. Удобство культивирования с возможностью быстрого изменения внешних условий.

5. Высокая разрешающая способность генетического анализа микроорганизмов с обнаружением мутаций, возникающих с частотой 10-9 и менее.

6. Способность к комбинативной и мутационной изменчивости.

Наиболее интенсивно изучаемый вид в генетике микроорганизмов – это нормальный обитатель кишечника человека Escherchia coli. Данная бактерия легко культивируется в жидкой питательной среде, содержащей некоторые соли и простой источник углерода, например глюкозу. Из этих соединений Е.coli способна синтезировать все сложные органические молекулы, образующие клетку. За сутки культивирования популяция, возникшая из одной-единственной клетки Е.coli, может достигнуть 2-3*109 бактерий на 1 мл среды.

Полученную культуру засевают на чашку Петри с питательной средой. После инкубации бактерии начинают быстро делиться и дают на агаре колонии, которые являются потомками единственной микробной клетки. Отсюда можно получить чистую культуру любой мутантной бактерии, присутствовавшей в исходной бактериальной взвеси.

Помимо экспериментов на бактериях, существенный вклад в генетику внесли исследования с помощью бактериофагов – вирусов бактерий. Заражая фагом (в том числе – и с измененным геномом) чувствительную культуру микроорганизмов, можно получить большую популяцию фаговых частиц. После инкубации бактерии, размножаясь, образуют на агаре сплошной газон клеток. В местах, инфицированных бактериофагом, образуются негативные колонии или бляшки. При определенных условиях каждая негативная колония на бактериальном газоне содержит потомство одной индивидуальной частицы фага. Тем самым осуществляется накопление генетического материала фага для его последующего изучения.

Использование микробиологических систем привело к выдающимся открытиям в генетике.

На бактериях впервые была установлена химическая природа наследственного материала и заложен фундамент молекулярной генетики (О. Эвери, К. Мак-Леод, М.

Мак-Карти, 1944) На бактериях и фагах решена проблема генетического кода (Дж. Уотсон, Ф.

Крик, 1953) Доказан полуконсервативный способ репликации ДНК (М. Мезелсон, Ф. Сталь, 1958).

Изучена тонкая структура гена (С. Бензер, 1955) Установлен механизм мутаций и рекомбинаций.

Разработана концепция оперона как модели организации генов в хромосоме (Ф.

Жакоб, Ж. Моно, 1961) Выявлено наличие информационной (матричной) РНК. Она впервые была обнаружена в 1961 г. Ф.Жакобом и Ж.Моно у бактерий, зараженных фагом, а позднее у высших организмов.

Исследования в области генетики микроорганизмов привели к созданию важнейшей прикладной отрасли современной генетики – генной инженерии.

5.2. Организация генетического аппарата микроорганизмов

Генетический материал бактериальных клеток представлен двойной спиралью ДНК, состоящей из 2-х комплементарных полинуклеотидных цепочек, в каждой из которых пуриновые и пиримидиновые основания распределены вдоль остова, построенного из меняющихся фосфатных групп и дезоксирибозы; 2 цепочки удерживаются друг с другом посредством водородных связей между соответствующими основаниями.

У вирусов генетический материал представлен лишь одним типом нуклеиновой кислоты – либо ДНК, либо РНК. Подробно химическая структура нуклеиновых кислот, являющихся основой наследственности, изложена в курсе биохимии.

Клетки бактерий могут содержать несколько генетических элементов, способных к репликации. По предложению Ф.Жакоба, С.Бреннера и Ф.Кузина структура бактериальной клетки, способная к самовоспроизведению, получила название «репликон».

Репликоны бактерий представлены бактериальной хромосомой (нуклеоидом), плазмидами и эписомами. Плазмиды представляют собой репликон, находящийся в автономном состоянии в цитоплазме бактериальной клетки, эписомы могут находиться как в свободном состоянии, так и быть интегрированными в нуклеоид, составляя с ним общий репликон.

Нуклеоид представляет собой замкнутую кольцевидную хромосому бактерий, свободно располагающуюся в цитоплазме, и содержит несколько тысяч отдельных генов. В зависимости от стадии жизненного цикла в бактериальной клетке обычно присутствуют от одного до четырех копий нуклеоида. Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии составляет приблизительно 1 мм.

Существуют два основных способа репликации ДНК нуклеоида. По первому типу репликация кольцевидной молекулы ДНК начинается от начальной точки ori (origin – начало) в определенном месте ее кольца. Сначала идет раскручивание (деспирализация) двойной цепи ДНК, в результате чего образуется репликативная вилка. Одна из цепей, достраиваясь, связывает нуклеотиды от 5`- к 3`-концу, другая достраивается посегментно.

Данный способ репликации ДНК проходит через промежуточную структуру, напоминающую греческую букву тэта. Тэта-тип репликации приводит к образованию двух дочерних кольцевых хромосом. В них сохраняется одна из цепей исходной молекулы ДНК, а вторая цепь синтезируется из нуклеотидов ДНК-полимеразами.

Превращение кольцевой бактериальной хромосомы в линейную происходит при другом типе репликации нуклеоида – по так называемому «сигма-типу» или иначе – по механизму «катящегося кольца». Этот механизм осуществляется через промежуточную структуру, напоминающую греческую букву «сигма». Он реализуется во время конъюгации бактерий, а также у некоторых фагов. В этом случае первоначально образуется разрыв в одной из цепей ДНК кольцевой молекулы, и разорвавшаяся цепь ДНК начинает сдвигаться с комплементарной кольцевой цепи. При этом происходит одновременное достраивание до двухцепочечной ДНК как сдвигающейся линейной цепи, так и остающейся кольцевой.

Третий известный тип репликации ДНК характерен для линейных молекул ДНК.

Он присущ всем эукариотическим организмам, а также некоторым вирусам. В этом случае в ДНК появляется вздутие – точка инициации. Далее вздутие распространяется в обоих направлениях с одновременным удвоением родительской ДНК.

Единицей наследственности у всех живых организмов являются гены. Они в ДНК лежат дискретно и линейно (колинеарно). Гены способны создавать собственную копию, т.е. способны к саморепликации. Последовательность аминокислот в синтезируемом белке определяется последовательностью нуклеотидов в гене.

Генотип микроорганизма – это полная совокупность генов данной особи. Однако реализуется генотип только через его взаимодействие с окружающей средой.

Условия среды способствуют проявлению (экспрессии) генов или подавляют их функциональную активность. Тем самым создается фенотип микроорганизма – набор его свойств и признаков (морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и т.д.) Гены, ответственные за синтез определенного соединения у бактерий, обозначают строчными буквами латинского алфавита со знаком «+». Например, gal+ – ген, ответственный за потребление сахара галактозы, bio+ – за синтез витамина Н (биотина) и т.д. Гены, контролирующие устойчивость к лекарственным средствам, химическим соединениям, обозначают буквой r (resistent – устойчивый). Например, резистентность к стрептомицину обозначается как strr, а чувствительность strs. Фенотип бактерий обозначают так же, как и генотип, но с прописной буквы.

Согласно схеме, предложенной Жакобом и Моно, гены можно подразделить следующим образом:

Структурные гены – они обусловливают синтез определенных белковферментов, участвующих в биохимических реакциях.

Гены-регуляторы – определяют синтез белковых веществ (часто это репрессоры), имеющих высокое сродство к ДНК в области гена-оператора и изменяющих деятельность структурных генов.

3. Гены-промоторы (или промоторная область) – участок ДНК распознаваемый ДНК-зависимой РНК-полимеразой, необходимый для начала транскрипции



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |


Похожие работы:

«Биокарта Hyla arborea ОБЫКНОВЕННАЯ КВАКША Hyla arborea European Tree Frog Составили: Нуникян Е.Ф. Дата последнего обновления: 29.10.11 1. Биология и полевые данные 1.1 Таксономия Отряд Бесхвостые Anura Семейство Квакши Hylidae Род Квакши Hyla Русское название (...»

«Единый государственный экзамен по БИОЛОГИИ Демонстрационный вариант контрольных измерительных материалов единого государственного экзамена 2010 года по биологии подготовлен Федеральным государственным научным учреждением «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ ПЕДАГОГИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ» Демонстрационный вариант ЕГЭ 2010 г. БИОЛОГИЯ, 11 класс. (...»

«Научно-исследовательская работа Тема работы ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАГРЯЗНЕННОСТИ СНЕЖНОГО ПОКРОВА СЕЛА КУТАНА Выполнил(а): Самсонова Сандаара Николаевна, Васильева Нарыйана Владимировна учащий(ая)ся 6 класса МБОУ «Кутанинского СОШ им. А.А. Иванова-Кюндя” Руководитель: Третьякова Туйара Михайловна учитель биологии МБОУ «Кутанинского СОШ...»

«В.А. СИТАРОВ, В.В. ПУСТОВОЙТОВ СОЦИАЛЬНАЯ ЭКОЛОГИЯ Рекомендовано Министерством образования Российской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших педагогических учебных заведений Москва ACADEMA УДК 37.013.42(075.8) ББК 60.56 Ситаров В. А., Пустовойтов В. В. С 41 Социальная эколог...»

«Journal of Siberian Federal University. Biology 1 (2012 5) 4-12 ~~~ УДК 630*561.24 Дендрохронологическая оценка динамики продуктивности лесов Северо-Западного Кавказа Г.Е. Комин* Научно-исследовательский институт горного лесоводства и экологии леса Россия 354002, Сочи, Куроротный пр., 74 1 Received 2.03.2012, receive...»

«1. Цели и задачи дисциплины 1.1.Цель преподавания дисциплины Целью учебного курса является овладение современными методами ввода, представления и анализа пространственной экологической информации с помощью ГИС.1.2. Задачи изучения дисциплины Основные задачи курса...»

«Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Экономика и экологический менеджмент» № 3, 2014 УДК 336.71 Децентрализация банковского капитала как индикатор уровня доверия на рынке межбанковского кредитования Олешева Е.Е., oleshewa@yandex.ru Вологодский институт права и экономики ФСИН России 160002, г. Вологда, ул. Щетинина...»

«Давидчик Валентина Николаевна ДЕГРАДАЦИЯ АТРАЗИНА ПО МЕХАНИЗМУ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГРИБНОЙ ЛАККАЗОЙ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполн...»

«СОВРЕМЕННЫЕ энергои ресурсосберегающие, экологически устойчивые технологии и системы сельскохозяйственного производства Сборник научных трудов (выпуск 10) Рязань, 2013 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВ...»

«Фахрутдинова Татьяна Михайловна ВНУТРЕННИЙ ТРУДОВОЙ РАСПОРЯДОК ОРГАНИЗАЦИИ (ПРАВОВЫЕ ВОПРОСЫ) Специальность 12.00.05 – трудовое право; право социального обеспечения Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Томск – 2006 Работа выполнена на кафедре природ...»

«1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический Научный Центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научн...»

«ЭЛЕМЕНТЫ НАУКОМЕТРИИ В ПОЧВОВЕДЕНИИ И ЭКОЛОГИИ (НА ПРИМЕРЕ ФАКУЛЬТЕТА ПОЧВОВЕДЕНИЯ МГУ) Глаголев М.В., Янин М.В. m_glagolev@mail.ru Что такое наукометрия и зачем она нужна? Под названием «наукометрия» оформилась область статис...»

«Бондарев Станислав Александрович ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОНИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА Sup35 НА СВОЙСТВА ПРИОНА [PSI+] ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae Специальность 03.02.07 – генетика. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., п...»

«1. Вводный курс Биология – система наук о живой природе. Место биологии среди других наук, ее значение для медицины, фармации, сельского хозяйства. Основные признаки живого. Уровни организации живой природы. Клетка как основная структурно-функциональная единица живой природы. Основные стр...»

«УЧЕБНЫЕ ПОЛЕВЫЕ ПРАКТИКИ Учебно-методические указания для студентов-бакалавров Института экологии и географии, обучающихся по направлениям подготовки «География», «Туризм», «Гостиничное дело» Казанский унив...»

«Зарегистрировано в Минюсте России 16 декабря 2013 г. N 30606 ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОМУ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМУ И АТОМНОМУ НАДЗОРУ ПРИКАЗ от 21 ноября 2013 г. N 560 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ФЕДЕРАЛЬНЫХ НОРМ И ПРАВИЛ В ОБЛАСТИ ПРОМЫШЛЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРАВИЛА БЕЗОПАСНОС...»

«И. В. Дроздова Удивительная биология Серия «О чем умолчали учебники» http://litres.ru http://www.litres.ru/pages/biblio_book/?art=165317 И.В. Дроздова «Удивительная биология», серия «О чем умолчали учебники»: Издательство «НЦ ЭНАС»; Москва; 2006 ISBN 5-93196-442-8 Аннотация Книга...»

«ИТОГИ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2012. – Т. 21, № 1. – С. 5-158. УДК 581.9(470.324) ФЛОРА ВОРОНЕЖСКОГО ГОРОДСКОГО ОКРУГА ГОРОД ВОРОНЕЖ: БИОГЕОГ...»

«АЙЗЕНШТАДТ АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО ТКАНЕВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., Самойлович М. П. Санкт-Петербург...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, 3, с. 96-100 Регуляторы роста растений УДК 633.88:631.8 ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ БИОДОБАВКИ НА ОСНОВЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ Е.Н. ДИРИНА, А.Ю. ВИНАРОВ, В.И. ОСИПОВ, В.А. БЫКОВ Изучали влияние разработанной ранее биодобавки Биогид...»

«МИНИСТЕРСТВО ФИНАНСОВ ЛУГАНСКОЙ НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ ПРИКАЗ «20» октября 2015 г. №88 Луганск Об утверждении Порядка регистрации и учета обязательств распорядителей бюджетных средств и получателей бюджетных средств в органах Государственного казначейства Луганской Народной Республики С целью упорядочения п...»

«ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ СИСТЕМЫ ДОБРОВОЛЬНОЙ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СЕРТИФИКАЦИИ ОБЪЕКТОВ НЕДВИЖИМОСТИ «ЗЕЛЁНЫЕ СТАНДАРТЫ» КРИТЕРИИ СИСТЕМЫ ДОБРОВОЛЬНОЙ ЭКОЛОГИЧЕСКО...»

«Государственное Основная образовательная бюджетное образовательное учреждение программа высшего профессионального образования направления подготовки «Волгоградский государственный медицинский 020400 «Биология»-1университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Учебно-метод...»

«1 МЕТОДИКА ОРГАНИЗАЦИИ ДЕТСКОГО ЭКСПЕРИМЕНТИРОВАНИЯ В СИСТЕМЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ Панеш Б.Х., Заплетина О.В. Адыгейский государственный университет Майкоп, Россия THE METHODS OF ORGANIZATION OF CHILDREN...»

«ПРОГРАММА вступительных испытаний в аспирантуру в 2016 году по направлению подготовки 06.00.00 Биологические науки направленность подготовки (профиль) – Физиология. Общие положения Цель вступительных испытаний...»

«Федеральное медико-биологическое агентство Федеральное государственное учреждение «Главное бюро МСЭ по Орловской области» Клинический минимум обследования при направлении больных на медико-социальную экспертизу (методические рекомендации для специалисто...»

«ЗАО «АКВИЛОН»МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Вода питьевая, природная, морская, сточная очищенная МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ МЫШЬЯКА И РТУТИ В ПРОБАХ В...»

«МДОУ № 74 ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ВОСПИТАНИЕ в г ПОДГОТОВИТЕЛЬНОЙ ГРУППЕ = Работу выполнила Прохоренкова Е.Д. г. Сочи Проблема экологического воспитания и образования одна из самых актуальных на сегодняшний день....»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.