WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

«ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ В КОНТЕКСТЕ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ ...»

На правах рукописи

ГАВРИЛОВ Алексей Александрович

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ В КОНТЕКСТЕ

РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

Специальность 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2015

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом и группе пространственной организации генома Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Разин Сергей Владимирович, член-корреспондент РАН, доктор

Научный консультант:

биологических наук, профессор.

Гвоздев Владимир Алексеевич, академик РАН, доктор

Официальные оппоненты:

биологических наук, профессор, заведующий отделом молекулярной генетики клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук;

Кочетков Сергей Николаевич, член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им.



В.А. Энгельгардта Российской академии наук;

Лагарькова Мария Андреевна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией генетических основ клеточных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Защита состоится 15 марта 2016 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу:

119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу:

http://www.genebiology.ru/dissertation/dis-12-Gavrilov/Gavrilov-diss-txt.pdf

Автореферат диссертации разослан ___ февраля 2016 года.

–  –  –

Актуальность проблемы. Активация транскрипции генов – это многоступенчатый процесс, включающий привлечение к промотору гена комплекса белков базальной транскрипции в совокупности с изменением структуры хроматина – ремоделированием нуклеосом и посттрансляционными модификациями гистонов. Энхансеры и области контроля локуса, удаленные от контролируемых ими генов, привлекают белковые комплексы, осуществляющие эти изменения, и, в ряде случаев, рекрутируют РНК-полимеразу II. Вопрос, каким образом удаленные регуляторные элементы генома взаимодействуют с подконтрольными генами, изучается достаточно давно, но и в настоящее время остается дискуссионным.





Исследования последних лет свидетельствуют о том, что активирующее действие энхансеров связано с формированием доменов модифицированных гистонов и осуществляется через посредство прямого контакта энхансеров и промоторов генов с выпетливанием разделяющего участка ДНК. Доказательства модели выпетливания получены с использованием метода фиксации конформации хромосомы 3C (chromosome conformation capture). В пионерской работе по 3С-анализу было показано, что активные бета-глобиновые гены физически взаимодействуют в ядерном пространстве с многочисленными цис-регуляторными элементами, что послужило основанием для модели активаторного хроматинового блока регуляторных элементов, иначе – хроматинового хаба (Tolhuis et al., 2002). Согласно этой модели, формирование активаторного хроматинового блока обеспечивает корректную экспрессию генов и требует присутствия белковых факторов, обладающих афинностью друг к другу и связывающихся с соответствующими участками на ДНК.

Развитие методов высокопроизводительного секвенирования сделало возможным создание панели так называемых С-методов, позволяющих проводить анализ пространственных взаимодействий удаленных последовательностей ДНК в полногеномном масштабе. С использованием метода HiC были открыты общие принципы укладки интерфазного генома. Было установлено, что хромосомы млекопитающих и дрозофилы организованы иерархически. В масштабе миллионов пар нуклеотидов хромосомы компартментализуются с образованием активного и неактивного компартментов. В более мелком масштабе хромосомы подразделяются на топологически-ассоциированные домены, которые, по всей видимости, представляют собой хроматиновые глобулы (Gibcus and Dekker, 2013). Было показано, что организация хромосом в серию топологически-ассоциированных доменов отличается эволюционной консервативностью и независимостью от типа клеток. В то же время, механизмы, ответственные за пространственную сегрегацию активных и неактивных участков генома, и принципы организации топологическиассоциированных доменов остаются неясными.

В других исследованиях с использованием С-методов были обнаружены специфичные для клеточных типов взаимодействия генов и удаленных регуляторных элементов, реализующиеся в масштабе целого генома. Было показано, что на уровне пространственной организации генома могут регулироваться различные процессы: от активации и репрессии транскрипции и геномного импринтинга (Misteli, 2007) до клеточного старения (Chandra et al., 2015) и циркадных ритмов (Aguilar-Arnal et al., 2013). Однако приходится констатировать, что большинство исследований в области пространственной организации генома носят аннотационный характер.

Получаемая статичная картина пространственной организации генома позволяет установить взаимное расположение регуляторных элементов генома, подтвердить или опровергнуть роли уже картированных регуляторных элементов, однако аспекты механики взаимодействия геномных элементов, природа этих взаимодействий, их частота и стабильность остаются не выясненными. Хотя модель активаторного хроматинового блока в научном сообществе общепринята, она остается лишь гипотезой, потому что метод 3С позволяет анализировать лишь попарные взаимодействия геномных элементов и с его помощью в принципе невозможно продемонстрировать существование многокомпонентных комплексов, включающих более двух фрагментов ДНК. Более того, метод 3С и другие методы, основанные на принципе лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в клеточном ядре, не дают возможности подсчитать долю клеток, в которых изучаемые последовательности ДНК расположены в пространственной близости. Наконец, как и любой биохимический подход, метод 3С позволяет получить лишь усредненную картину того, что происходит в различных клетках, присутствующих в популяции. Все это определяет актуальность настоящего исследования, направленного на изучение функционально-зависимой архитектуры эукариотического генома и расширение методической базы для исследований в области пространственной организации генома.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов взаимодействия удаленных регуляторных элементов генома и выяснение роли этих взаимодействий в регуляции экспрессии генов. Особое внимание в работе было уделено доработке и оптимизации существующего протокола 3С-метода, а также созданию новых методов изучения пространственной организации генома, преодолевающих внутренние ограничения метода 3С и его производных.

Для достижения этих целей в работе были поставлены следующие задачи:

1. С использованием метода 3С охарактеризовать пространственную организацию геномных доменов открытого и закрытого типов на примере доменов альфа- и бета-глобиновых генов.

Изучить молекулярные механизмы активации транскрипции глобиновых и ряда других генов удаленными энхансерными элементами. Исследовать механизмы переключения программы транскрипции глобиновых генов в ходе эмбрионального развития.

2. Провести анализ основных этапов метода 3С и изучить механизм предпочтительного лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в этой экспериментальной процедуре.

Изучить механизмы поддержания пространственной близости удаленных элементов генома в клеточном ядре.

3. Разработать технику количественного анализа абсолютных частот лигирования в процедуре 3С и оценить действительные частоты взаимодействия удаленных регуляторных элементов in vivo.

4. На основании метода молекулярных колоний разработать метод прямого анализа комплексов геномных элементов, не использующий процедуру лигирования и основывающийся на амплификации фрагментов ДНК в геле. С использованием этого метода проанализировать возможность сборки нескольких элементов в единый комплекс и проверить справедливость модели активаторного хроматинового блока. Оценить частоту сборки элементов ДНК в единый комплекс и определить стабильность взаимодействия элементов в составе комплекса.

5. Разработать метод анализа пространственной близости фрагментов ДНК, связанных с ядерным матриксом. Изучить возможную роль ядерного матрикса во взаимодействии удаленных элементов генома и пространственной организации протяженных участков ДНК.

6. С использованием метода 4С провести полногеномный анализ пространственных взаимодействий промоторов генов домашнего хозяйства. Изучить особенности организации генов домашнего хозяйства и тканеспецифичных генов в общие транскрипционные фабрики для осуществления скоординированной транскрипции.

Научная новизна работы. Использование в настоящей работе широкого спектра методов и модельных систем позволило нам уточнить механизмы пространственного взаимодействия удаленных регуляторных элементов генома, а также исследовать движущие силы позиционирования геномных элементов в клеточном ядре и выявить факторы, определяющие специфическую пространственную организацию интерфазных хромосом. В работе исследованы молекулярные механизмы, контролирующие экспрессию тканеспецифичных генов, предложены новые модели активации генов удаленными регуляторными элементами, изучена пространственная организация транскрипционного аппарата в клеточном ядре. С использованием принципиально новых подходов для изучения пространственных взаимодействий удаленных регуляторных элементов генома (INGRID и M3C) были значительно расширены и уточнены существующие представления о механизмах работы эукариотических энхансеров и принципах формирования функционально-зависимой пространственной организации генома. В работе уточнен принцип работы метода фиксации конформации хромосомы (3С). Продемонстрировано, что один из основных постулатов, положенных в основу данной экспериментальной процедуры, является неверным. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости переосмысления результатов исследований, проведенных с использованием метода 3С другими авторскими коллективами. В частности, наши результаты показывают, что простраственная организация генома в клеточном ядре является чрезвычайно динамичной: фактически постоянно происходит перебор различных вариантов, некоторые из которых временно фиксируются посредством дополнительных взаимодействий между связанными с регуляторными элементами генома белками.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Настоящая работа является существенным шагом вперед на пути к пониманию, каким образом пространственная архитектура генома связана с его функционированием. В работе показано, что пространственная организация ДНК является важным фактором регуляции экспрессии генов высших эукариот. Вместе с тем, работа представляет интерес и с практической точки зрения: новые знания о механизмах, контролирующих экспрессию генов, могут быть с успехом использованы в медицине и биотехнологии. В более узком плане работа значима еще и потому, что раскрывает ряд важных особенностей регуляции экспрессии именно глобиновых генов, нарушения в функционировании которых вызывают тяжелые заболевания человека и хозяйственно-важных домашних животных.

Положения и результаты, выносимые на защиту

1. Домен бета-глобиновых генов кур имеет сложную пространственную организацию в эритроидных клетках, предполагающую возможность сближения промоторов глобиновых генов с удаленными энхансерными элементами. Пространственная организация домена отличается в клетках различного происхождения и на разных этапах эмбрионального развития. При этом корреляция между транскрипционной активностью индивидуальных глобиновых генов и их привлечением к активаторному комплексу не является абсолютной.

Транскрипция альфа-глобиновых генов кур и эритроидспецифичного гена TMEM8, 2.

локализованного за кластером альфа-глобиновых генов, регулируется за счет сборки альтернативных активаторных комплексов, в составе которых имеются как общие, так и специфичные регуляторные элементы.

3. Для поддержания взаимного позиционирования удаленных регуляторных элементов генома важно сохранение целостности клеточного ядра. Стадия рестрикции и лигирования в экспериментальном протоколе метода 3С осуществляется внутри ядра, а не в растворе после лизиса клеток, как предполагалось ранее. Для активации транскрипции гена существенно сближение промотора и удаленных регуляторных элементов в одном функциональном компартменте, где они не обязательно объединены в единый регуляторный комплекс.

4. Разработанная нами количественная техника позволяет определять абсолютный выход продуктов лигирования в процедуре 3С-анализа. Низкие частоты лигирования фрагментов, предположительно входящих в состав одного активаторного хроматинового блока, свидетельствуют о низкой частоте прямого взаимодействия регуляторных элементов ДНК in vivo.

5. Разработанный новый подход для изучения пространственных взаимодействий удаленных регуляторных элементов генома (метод INGRID), основанный на амплификации в геле фрагментов ДНК, выделенных из фиксированных клеток, демонстрирует, что в большинстве клеток, экспрессирующих глобиновые гены, промоторы глобиновых генов и их энхансерные элементы не организованы в единый ДНК-белковый комплекс.

6. Созданная нами экспериментальная процедура (метод М3С) позволяет исследовать вопрос о пространственной сближенности прикрепленных к ядерному матриксу фрагментов ДНК.

Связанные с ядерным матриксом промоторы ряда генов домашнего хозяйства, расположенных во фланкирующих областях домена альфа-глобиновых генов кур, образуют единый комплекс на ядерном матриксе и составляют основу транскрипционной фабрики.

7. CpG-островки, ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства и участками начала репликации ДНК, взаимодействуют в пространстве ядра в масштабе всего генома, что является одним из факторов, определяющих специфическую пространственную организацию интерфазных хромосом, в том числе сегрегацию активного и неактивного хроматиновых компартментов.

Степень обоснованности и достоверности результатов и выводов работы. Работа выполнена на высоком методическом уровне; научные результаты, изложенные в диссертационной работе, основаны на экспериментальных данных, полученных с использованием новейших методических подходов. Достоверность результатов определяется использованием современного оборудования, отработанных методов обработки и анализа данных и подтверждается высокой воспроизводимостью результатов. Выводы, полученные в ходе работы, обоснованы и соответствуют целям и задачам исследования.

Личный вклад автора. Большинство экспериментальных данных получено автором лично. Ему принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Эксперименты по использованию метода молекулярных колоний для анализа частоты взаимодействия между удаленными геномными элементами проведены в сотрудничестве с А.Б Четвериным и Е.В. Четвериной. Электронно-микроскопический анализ выполнен при участии И.И. Киреева. Работы по секвенирование 4С-библиотек проведены в сотрудничестве с М.Д. Логачевой. Биоинформатический анализ 4С-данных осуществлен при участии А.В. Артемова.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на международных и отечественных научных конференциях, конгрессах и симпозиумах: Workshop «Protein-nucleic acid interactions» of the International Research Training Group 1384 (Вильнус, Литва, 2010);

International Symposium «Control of gene expression and cancer» (Москва, 2010); Symposium «Enzymes and multienzyme complexes acting on nucleic acids» (Гессен, Германия, 2010); International Symposium «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre 81 (Гессен, Германия, 2011); EMBO Conference «Nuclear Structure and Dynamics»

(Л'Иль-сюр-ла Сорг, Франция, 2011, 2013); Международной конференции «Хромосома 2012»

(Новосибирск, 2012); Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology «Genomic Instability and DNA Repair» (Банф, Канада, 2013); 38-th FEBS Congress «Mechanisms in biology» (СанктПетербург, 2013); FEBS EMBO Conference (Париж, Франция, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 52 печатные работы: 34 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ по биологии (из них 29 в изданиях Web of Science), и 18 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 385 страницах, содержит 68 рисунков, 16 таблиц и состоит из введения, 4-х глав, заключения и выводов. Список использованной литературы включает 697 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Активаторный хроматиновый блок домена бета-глобиновых генов кур Домен бета-глобиновых генов кур включает кластер из 4-х бета-глобиновых генов –, H, A и – и несколько регуляторных элементов, маркированных участками гиперчувствительности к ДНКазе (DHS), которые контролируют транскрипцию, репликацию и хроматиновый статус домена (рис.1А). Края домена маркированы CTCF-зависимыми инсуляторами. Перед геном эмбрионального бета-глобина расположена область контроля локуса (LCR). Помимо LCR, домен содержит внутренний энхансерный элемент (/-энхансер), расположенный между генами A и.

Распределение «обязанностей» между LCR и /-энхансером не вполне ясно. Недостаточно изучены и механизмы, ответственные за переключение программы экспрессии бета-глобиновых генов кур с эмбрионального на взрослый тип в ходе развития. У кур первые молекулы гемоглобина появляются в эмбриональных эритробластах через 32 часа после фертелизации и представлены белковыми продуктами генов и, которые транскрибируются со 2-го по 5-й день эмбрионального развития. После 5-го дня в кровеносном русле появляется новая популяция эритроидных клеток, экспрессирующих гены фетального и взрослого глобинов Н и А.

Целью исследования на этом этапе было изучение пространственной организации домена бета-глобиновых генов кур на стадии до и после переключения программы экспрессии с эмбрионального на взрослый тип. Были использованы циркулирующие клетки крови куриных эмбрионов 3-го и 9-го дней развития. Прежде всего мы проанализировали уровень первичных транскриптов 4-х бета-глобиновых генов в этих клетках. Полученные нами результаты (рис.1Б) хорошо согласуются с уже опубликованными данными. В эритроцитах 3-го дня развития активно транскрибируются только эмбриональные бета-глобиновые гены и, причем уровень транскрипции гена примерно в пять раз превышает уровень транскрипции гена. В эритроцитах 9-го дня развития обнаруживаются транскрипты всех 4-х бета-глобиновых генов, при этом наиболее представлен транскрипт гена А.

Анализ пространственной организации домена бета-глобиновых генов был осуществлен с использованием метода 3С (см. рис.3). Чтобы различить функционально значимые взаимодействия, в параллели с эритроидными клетками мы провели 3С-анализ домена в куриных эмбриональных фибробластах, которые не экспрессируют глобиновые гены. Сначала в качестве якорного был выбран рестрикционный фрагмент, несущий DHS2. Было установлено, что в 3дневных эритроцитах этот якорный фрагмент предпочтительно взаимодействует с фрагментами, содержащими промотор эмбрионального гена, взрослый ген А и /-энхансер (рис.1В). Кроме этого, была засвидетельствована повышенная частота взаимодействия DHS2 с 5’Рис. 1. 3C-анализ домена бета-глобиновых генов кур: (А) Схема домена. Гены обозначены синими прямоугольниками (интроны показаны белым). Зеленые прямоугольники – DHS. FOLR1 – ген фолатного рецептора;

HAS – эритроидспецифичный DHS; OR51M1 – ген обонятельного рецептора. (Б) Анализ первичных транскриптов бета-глобиновых генов в эритроидных клетках 3- и 9-дневных эмбрионов кур (ОТ-ПЦР с ампликонами, перекрывающими экзон-интронные стыки). (В-К) Относительные частоты лигирования якорного фрагмента (показан темно-серым), несущего DHS2 (В), промотор гена (Г), 5’-часть гена A (Д), /-энхансер (Е), 5’-часть гена (Ж), промотор гена (З), 5’-инсулятор (И) или 3’-инсулятор (К), с другими фрагментами домена (показаны светло-серым).

3С-анализ проведен с использованием MboI (В-Ж, И, К) или NlaIII (Ж). Наибольшая частота лигирования принята за 100%. Линии погрешностей – SEM для 2-х или более экспериментов.

и 3’-концевыми инсуляторами домена. Достоверность этих наблюдений подтверждена в экспериментах с «якорем» на промоторе гена (рис.1Г), гене А (рис.1Д), /-энхансере (рис.1Е) и гене (рис.1Ж, З). Примечательно, что мы не обнаружили взаимодействия эмбрионального гена ни с одним из исследованных функциональных элементов домена (рис.1Ж, З). Основные отличия пространственной конфигурации домена в 9-дневных эритроцитах по сравнению с 3-дневными заключаются в следующем: (i) во все взаимодействия вовлекается ген H; (ii) увеличивается частота взаимодействия LCR с /-энхансером и геном А; (iii) устанавливается взаимодействие гена А с /-энхансером; и (iv) все три участка LCR (DHS 1, 2 и 3) вовлекаются во взаимодействие с промоторами глобиновых генов. При этом для обоих типов эритроидных клеток характерно взаимодействие между 5’- и 3’-концевыми инсуляторами домена (рис.1И, К). В эмбриональных фибробластах выявлено единственное взаимодействие между промотором гена и геном А (рис.1Г, Д). Полученные нами результаты позволили построить модели пространственной организации домена бета-глобиновых генов в различных типах клеток и проследить за изменениями в структуре домена, связанными с активацией и переключением экспрессии глобиновых генов (см. «Обсуждение результатов»).

2. Объединенный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 Домен альфа-глобиновых генов кур располагается в богатой генами области хромосомы и относится к доменам открытого типа. С 5’-областью домена перекрывается ген домашнего NPRL3, хозяйства транкрибирующийся в различных типах клеток (рис.2А). Главный регуляторный элемент альфа-глобиновых генов (MRE) расположен в одном из интронов гена NPRL3. К 3’-границе домена примыкает эритроидспецифичный ген TMEM8, в «теле» которого картирован GATA1-зависимый эритроидспецифичный энхансер. В нашем предыдущем исследовании было показано, что в терминально дифференцированных эритробластах собирается активаторный хроматиновый блок, включающий промотор взрослого альфа-глобинового гена D, MRE, -9 DHS (эритроидспецифичный DHS, расположенный на расстоянии 9 т.п.н. выше кластера глобиновых генов), промотор гена NPRL3 и 3’-концевой энхансер домена (Gavrilov and Razin, 2008). Здесь мы решили выяснить, осуществляется ли активация транскрипции гена TMEM8 путем привлечения к тому же хроматиновому блоку.

Для ответа на поставленный вопрос был использован метод 3С. Как и в предыдущем исследовании, мы сравнили пространственную организацию анализируемого участка генома в лимфоидных (DT40) и эритроидных клетках (пролиферирующие эритробласты линии HD3 и те же клетки, индуцированные в терминальную эритроидную дифференцировку).

Сначала мы проанализировали взаимодействие MRE с фрагментами, расположенными ниже кластера альфаглобиновых генов. В подтверждение ранее полученных данных, было показано, что MRE взаимодействует с 3’-концевым энхансером домена в дифференцированных клетках HD3. Однако мы не обнаружили взаимодействия с промотором гена TMEM8 и энхансером, расположенным в теле этого гена (рис.2Б). Иная картина наблюдалась в экспериментах c «якорем» на -9DHS (рис.2В) и 3’-концевом энхансере (рис.2Г). Оба элемента взаимодействовали друг с другом, с промотором гена TMEM8 и расположенным в гене энхансером в дифференцированных клетках HD3. Для пролиферирующих клеткок HD3 было отмечено взаимодействие -9DHS с энхансером из «тела» гена TMEM8 и более слабое взаимодействие с промотром гена TMEM8 (рис.2В). Все Рис. 2. 3С-aнализ взаимодействия промотора гена TMEM8 с регуляторными элементами домена альфаглобиновых генов: (А) Схема домена. (Б-Е) Относительные частоты лигирования якорного фрагмента (темносерый), несущего MRE (Б), -9DHS (В), 3’-энхансер (Г), промотор ТМЕМ8 (Д) или энхансер ТМЕМ8 (Е), с другими фрагментами домена (светло-серые). Точка «0» на оси Х соответствует 3’-концу гена NPRL3. Частоты нормированы относительно частоты лигирования фрагментов контрольного локуса (гена ERCC3), принятой за 1. 3С-анализ проведен с использованием комбинации рестриктаз BamHI и BglII, продуцирующих совместимые концы. Линии погрешностей – SEM для 3-х экспериментов.

указанные взаимодействия отсутствовали в клетках DT40 (рис.2Б-Г). В совокупности, полученные данные указывают на то, что -9DHS вовлечен в регуляцию транскрипции гена TMEM8 в пролиферирующих клетках HD3, -9DHS в паре с 3’-концевым энхансером домена альфаглобиновых генов – в дифференцированных клетках HD3. Данный вывод подтверждается результатами экспериментов с «якорями» на промоторе гена TMEM8 (рис.2Д) и расположенном в гене энхансере (рис.2Е). Интересно, что ни один из этих двух элементов не взаимодействует с промоторами взрослых глобиновых генов D и А (рис.2Д, Е). Это позволяет предположить, что альфа-глобиновый домен может принимать две альтернативные хроматиновые конфигурации, при которых -9DHS и 3’-концевой энхансер активируют либо глобиновые гены, либо ген TMEM8.

3. Переосмысление процедуры 3С-метода: лигирование в ядре, а не в растворе Успехи последних лет в изучении пространственной организации генома стали возможными благодаря развитию техники фиксации конформации хромосомы (3С) и набора производных методов, позволяющих оценивать степень пространственной близости фрагментов генома в ядре. В основе всех С-методов лежит принцип предпочтительного лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК. Экспериментальный протокол включает формальдегидную фиксацию ДНК-белковых комплексов in vivo с последующей обработкой ДНК эндонуклеазами рестрикции и религированием полученных фрагментов Рис. 3. Схема метода 3С. Классическое представление основных этапов экспериментальной процедуры.

ДНК (рис.3). Согласно экспериментальной процедуре, клетки после фиксации обрабатываются детергентами и рестрикция также проводится в присутствии детергента (SDS). Авторы протокола считали, что такая обработка обеспечивает высвобождение ДНК-белковых комплексов из ядер в раствор (Tolhuis et al., 2002). Дальнейшее лигирование проводили после сильного разведения материала. Понижение концентрации ДНК должно было минимизировать лигирование фрагментов, не объединенных белковыми сшивками, в то время как вероятность лигирования фрагментов, сшитых через «белковые мостики», должна оставаться высокой независимо от концентрации ДНК (рис.3). В этой связи частоту лигирования различных фрагментов ДНК рассматривали как прямой показатель вероятности их нахождения в составе одного ДНК-белкового комплекса. Между тем известно, что солюбилизация хроматина из фиксированных формальдегидом ядер представляет собой сложную задачу. Поэтому мы решили изучить степень солюбилизации фрагментов хроматина из фиксированных формальдегидом ядер в процедуре 3С.

Для анализа были выбраны эритроидные клетки из печени эмбрионов мыши. Именно на этих клетках впервые были осуществлены эксперименты по 3С-анализу домена бета-глобиновых генов (Tolhuis et al., 2002). Мы разделили материал после рестрикции центрифугированием и выделили ДНК из растворимой (супернатант) и нерастворимой (осадок) фракций. Неожиданно выяснилось, что бльшая часть ДНК (85 и 60% в экспериментах с рестриктазой HindIII и частощепящей рестриктазой MboI, соответственно) остается в нерастворимой фракции (рис.4А).

При этом бльшая часть гистонов (75-80%) солюбилизировалась (рис.4Б). При обработке материала, полученного после фракционирования, лигазой фрагменты обеих фракций лигировались (рис.4В). Мы провели ПЦР-анализ частот лигирования отдельно в растворимой и нерастворимой фракциях. Оказалось, что детектированные в оригинальной работе (Tolhuis et al.,

2002) продукты лигирования фрагментов, несущих промотор мажорного бета-глобинового гена Рис. 4. Распределение ДНК и гистонов между Рис. 5 Частоты лигирования фрагмента, несущего растворимой и нерастворимой частями 3С- промотор гена Hbb-b1, c несколькими выбранными материала: (А) Относительные количества фрагментами домена бета-глобиновых генов в

ДНК в растворимой (супернатант) и растворимой и нерастворимой фракциях 3С-материала:

нерастворимой (осадок) фракциях. (Б) (А) Результаты 3С-анализа, выполненного отдельно на Распределение гистона H3 между фракциями. растворимой (супернатант) и нерастворимой (осадок) Белки, представленные в равных аликвотах фракциях. (Б) То же, что (А), после нормирования частот растворимого и нерастворимого 3С-материала, лигирования на количество ДНК в образце. Якорный были разделены в ПААГ и визуализованы фрагмент показан темно-серым, тест-фрагменты – светлосерыми. Точка «0» на оси Х соответствует началу гена Hbbиммуноблотингом с антителами против гистона y. Частоты лигирования HindIII- и MboI-фрагментов H3. (В) Электрофоретическое разделение ДНК из растворимой и нерастворимой фракций до и представлены на графиках слева и справа, соответственно.

Линии погрешностей – SEM для 3-х экспериментов.

после лигирования.

–  –  –

в нерастворимой фракции (рис.8В, Г). Это свидетельствует о том, что для образования специфических продуктов лигирования существенно сохранение целостности ядра, что указывает на важную роль общей ядерной организации в поддержании пространственной близости удаленных регуляторных элементов генома.

4. Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С До настоящего времени не осуществлялось попыток измерения абсолютного выхода продуктов лигирования в процедуре 3С. В стандартном эксперименте по 3С-анализу частоты лигирования выражаются в единицах, отражающих относительные количества продуктов лигирования. Наличие пика на 3С-кривой считается показателем взаимодействия соответствующих фрагментов генома. При этом, сколько в действительности продуктов лигирования образуется из участков генома, расцениваемых как «партнеры по взаимодействию», остается не ясным.

В нашем исследовании было решено проанализировать вопрос об абсолютном выходе продуктов лигирования. В качестве модельной системы был выбран домен бета-глобиновых генов в эритроидных клетках мыши. В обычном 3С-эксперименте ПЦР-сигналы для разных пар праймеров нормируют на сигналы, полученные для контрольного образца. Этот образец готовится путем лигирования эквимолярного количества всех исследуемых рестрикционных фрагментов и содержит равное количество всех продуктов лигирования. Однако число копий каждого продукта не известно, поэтому с использованием подобного стандарта возможно определить только относительные количества продуктов лигирования в 3С-образце. Для определения абсолютного выхода продуктов лигирования мы использовали другой стандарт, приготовленный путем смешения равных и известных количеств искусственно синтезированных фрагментов ДНК, представляющих собой интересующие продукты лигирования (рис.9А). Амплификация стандарта в параллели с 3С-образцом позволяла определить точное число копий каждого продукта лигирования в 3С-образце, тогда как сопоставление этого числа с числом рестрикционных фрагментов на входе в реакцию предоставляло информацию о выходе лигирования.

Количественный анализ частот лигирования, выполненный с использованием разработанного нами подхода, подтвердил зафиксированные ранее различия в частоте лигирования фрагмента, несущего промотор гена Hbbb1, с различными фрагментами домена бета-глобиновых генов (рис.9Б, В).

Между тем, абсолютная частота лигирования была достаточно низкой во Рис. 9. Анализ абсолютных частот лигирования фрагмента, всех случаях. Так, в экспериментах с несущего промотор гена Hbb-b1, с различными фрагментами домена бета-глобиновых генов: (А) Приготовление стандарта с HindIII фрагмент, несущий DHS-62/-60, известным числом копий каждого продукта лигирования.

Бакмиду, содержащую анализируемый локус, переваривали 3Слигировался к фрагменту, несущему рестриктазой и религировали фрагменты. Полученную эквимолярную смесь продуктов лигирования амплифицировали промотор Hbb-b1, с частотой 0.4-0.5%, с использовнием 3С-праймеров и смешивали ПЦР-продукты в эквимолярных количествах. (Б, В) Выход продуктов тогда как участки, считающиеся лигирования в эскпериментах с HindIII (Б) и MboI (В). Тестфрагменты обозначены латинскими буквами, якорный фрагмент выпетленными за пределы активаторного («е») отмечен значком якоря. Линии погрешностей – SEM для хроматинового блока, такие как ген 3-х экспериментов. Остальные обозначения как на рис.5.

обонятельного рецептора Olfr69 и участок «-42», показали частоту лигирования ~0.05 и 0.15%, соответственно (рис.9Б). Наибольшая частота лигирования (~1.5%) была зафиксирована для фрагмента, расположенного непосредственно перед якорным фрагментом. Используя описанный подход, мы также определили частоту циркуляризации якорного фрагмента, она составила около 9% (рис.9Б). В экспериментах с MboI общий уровень лигирования был примерно втрое ниже, за исключением частоты циркуляризации якорного рестриктного фрагмента (рис.9В).

Принимая во внимание относительно низкие частоты лигирования, обнаруженные в наших экспериментах, мы проверили полноту эндонуклеазного расщепления ДНК. Эффективность расщепления по всем исследованным сайтам составила 85% для HindIII и 70% для MboI. Мы также показали, что эффективность работы лигазы не снижена в условиях, используемых в 3С-анализе (рис.10). Хотя ясно, что низкий выход продуктов лигирования может быть объяснен и другими причинами, такими как Рис. 10. Кинетика реакции лигирования в конкуренция концов ДНК за лигирование, мы присутствии и отсутствии SDS.

Электрофоретическое разделение продуктов, предполагаем, что низкие частоты лигирования могут полученных в ходе лигирования HindIIIфрагментов плазмиды pUC18 в течение отражать также низкую частоту прямого указанного времени в присутствии и взаимодействия регуляторных элементов ДНК in vivo. отсутствии SDS и Triton X-100.

–  –  –

Печень эмбрионов мыши была использована в качестве источника эритроидных клеток.

Клетки были фиксированы формальдегидом и дополнительно отсортированы с использованием магнитных шариков, несущих антитела к Ter119 – рецептору на поверхности эритроидных клеток (рис.15А). Гомогенность популяции эритроидных Ter119+-клеток была проверена окрашиванием на гемоглобин (рис.15Б) и на Ter119 (рис.15В). Кроме того, препараты клеток были проанализировали на содержание первичных транскриптов бета-глобиновых генов Hbb-b1 и Hbbb2 (рис.15Г). Для солюбилизации и одновременной фрагментации хроматина Ter119+-клетки были обработаны ультразвуком в SDS-содержащем буфере с последующим удалением нерастворимого материала центрифугированием. Условия ультразвуковой обработки были подобраны таким образом, чтобы обеспечить солюбилизацию большей части ДНК (~90%) при минимальном повреждении тест-ампликонов (уровень разрывов 10%) (рис.15Д). После подходящего разведения супернатант был подвержен амплификации в геле (рис.16А). Для учета уровня случайного перекрывания двух и более молекулярных колоний часть фиксированных фрагментов хроматина была подверждена стандартной процедуре расшивки и очистки ДНК до нанесения материала на гель. Подсчет колоний показал, что частоты встречаемости смешанных колоний низки и примерно одинаковы в экспериментах со сшитыми и расшитыми фрагментами хроматина (рис.16Б, В).

–  –  –

Рис. 20. Сравнение результатов 3С- и M3C- анализов: (А) Рис. 21. Частоты лигирования различных Схема изучаемого участка куриного генома. Гены показаны якорных фрагментов в экспериментах по M3Cанализу. Представлены относительные частоты стрелками. (Б) Результаты 3С-эксперимента с «якорем» на лигирования якорного фрагмента, несущего CpGCpG-островке гена NPRL3. (В) Результаты M3С-эксперимента островок гена MPRL28 (А), CpG-островок гена с тем же «якорем». Анализ проведен с использованием AXIN1 (Б) или промотор гена D (В, Г), с другими комбинации рестриктаз BamHI и BglII. Якорный фрагмент фрагментами анализируемой области. Линии показан темно-серым, тест-фрагменты – светло-серыми.

погрешностей – SEM для 2-х или более Точка «0» на оси Х соответствует 3’-концу гена NPRL3.

экспериментов. Все обозначения как на рис.20.

Линии погрешностей – SEM для 3-х экспериментов.

В эритроидных клетках якорный фрагмент демонстрировал также повышенную частоту взаимодействия с главным регуляторным элементом альфа-глобиновых генов MRE. Иной характер взаимодействий был обнаружен в M3C-экспериментах (рис.20В). В этих экспериментах мы выявили взаимодействия между якорным фрагментом и CpG-островками генов MPRL28 и AXIN1 в клетках DT40 и клетках HD3 как до, так и после индукции терминальной эритроидной дифференцировки, однако взаимодействие с MRE и промотором гена D зарегистрировано не было. Таким образом, СpG-островки, ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства NPRL3, MPRL28 и AXIN1, взаимодействуют друг с другом на ядерном матриксе, тогда как эритроидспецифичные элементы не принимают участия во взаимодействии. Этот вывод подтверждается результатами M3C-экспериментов с «якорем» на промоторе гена MPRL28 (рис.21А), промоторе гена AXIN1 (рис.21Б) и промоторе гена D (рис.21В, Г).

7. Полногеномный анализ пространственных взаимодействий СpG-островков, содержащих промоторы генов домашнего хозяйства Анализ пространственной организации участка куриной хромосомы-14, включающего ряд генов домашнего хозяйства, показал, что CpG-островки, ассоциированные с промоторами изученных генов, взаимодействуют друг с другом в ядерном пространстве (предыдущий раздел).

На настоящем этапе работы мы провели полногеномный анализ пространственных взаимодействий нескольких CpG-островков с хромосомы-14, ассоциированных с промоторами генов домашнего хозяйства, с использованием метода 4С (Simonis et al., 2006).

В первой серии экспериментов в качестве якорного был использован HindIIIфрагмент, содержащий CpG-островок гена NPRL3 (см. рис.20А). На рис. 22А представлено распределение 4С-сигнала вдоль хромосомы-14 для эритроидных Рис. 22.

Распределение 4С-сигнала, CpG-островков и участков связывания CTCF вдоль хромосомы-14 кур:

(HD3) и лимфоидных (DT40) клеток. Это (А) 4С-сигнал для якорного фрагмента «NPRL3». (Б) Дендрограммы, показывающие степень сходства распределение показывает частоту биологических реплик и величину различия между взаимодействия якорного фрагмента со клетками HD3 и DT40. (В) Распределение участков связывания белка CTCF по данным ChIP-seq.

всеми фрагментами хромосомы. Профили (Г) Распределение аннотированных CpG-островков.

распределения схожи для двух биологических реплик и различаются между клеточными линиями (рис.22Б), однако для обеих линий заметно, что области повышенного 4С-сигнала приходятся на участки хромосомы, обогащенные CpGостровками (рис.22В) и сайтами связывания белка CTCF, которые были определены нами с помощью метода ChIP-seq (рис.22Г). В соответствии с этим наблюдением для обеих клеточных линий была выявлена корреляция частоты взаимодействия якорного фрагмента с удаленными областями генома и плотностью CpG-островков в этих областях (рис.23А, Б). Эта корреляция была видна как для своей (рис.23А), так и для других хромосом, взятых в совокупности (рис.23Б). Таким образом, существует тенденция к кластеризации CpG-островков, расположенных как на одной, так и на разных хромосомах. Мы также обнаружили положительную корреляцию интенсивности 4С-сигнала с присутствием мотивов связывания общего транскрипционного фактора Sp1 (рис.23В), участков связывания CTCF (рис.23Г) и мотивов G-квадруплексов (рис.23Д), которые являются важными Рис. 23. Корреляция между 4С-сигналом и плотностью различных функционально значимых мотивов генома для элементами участков начала репликации в якорного фрагмента «NPRL3». Представлены диаграммы рассеяния (скаттер-плоты) и диаграммы размаха (бокс-плоты), клетках эукариот (Cayrou et al., 2011). показывающие зависимость между 4С-сигналом и плотностью CpG-островков (А,Б), мотивов связывания Sp1 Ген NPRL3 расположен близко к (В), участков связывания CTCF (Г), мотивов G4квадруплексов (Д), мотивов связывания NF-E2 (Е) и мотивов кластеру глобиновых генов (см. рис.20А) и, связывания GATA1 (Ж). Приведены линии линейной регрессии и доверительные интервалы. Для построения боксболее того, пространственно взаимодействует плотов точки были разделены на 5 групп равного размера в с геном D ((Gavrilov and Razin, 2008) и соответствии со значением по оси Х.

рис.20Б). Известно, что в эритроидных клетках глобиновые гены могут устанавливать пространственные контакты с другими эритроидспецифичными генами (Schoenfelder et al., 2010), что могло бы вносить вклад в характер контактов гена NPRL3. Несмотря на это, в клетках HD3 была обнаружена отрицательная корреляция 4С-сигнала с позициями предсказанных сайтов связывания эритроидспецифичных транскрипционных факторов (NF-E2 и GATA1). В данном аспекте эритроидные клетки не отличались от лимфоидных клеток (рис.23Е, Ж).

Мы провели дополнительные эксперименты, в которых в качестве якорного были использованы фрагменты хромосомы-14, несущие CpG-островки генов домашнего хозяйства TSR3, TRAP1 и PPL. Еще один «якорь» был размещен в обедненном генами, неактивном участке хромосомы-14. Профили распределения 4С-сигнала, полученные для фрагментов TSR3, TRAP1 и PPL, оказались сравнимыми с таковым для фрагмента NPRL3 (рис.24А, коэффициенты корреляции Пирсона 0.28). Якорный фрагмент, локализованный в «генной пустыне» (GENEDes), также демонстрировал ряд удаленных взаимодействий вдоль хромосомы-14 (рис.24А), однако профиль этих взаимодействий существенно отличался от таковых, наблюдающихся для якорных фрагментов, несущих CpG-островки (коэффициент корреляции Пирсона 0). Как и в случае якорного фрагмента NPRL3, якорные фрагменты TSR3, TRAP1 и PPL продемонстрировали наличие предпочтительных удаленных взаимодействий с CpG-островками, участками связывания

–  –  –

CTСF, предсказанными участками связывания Sp1, но не NF-E2 или GATA1 (рис.24Б). Для якорного фрагмента GENE-Des таких корреляций выявлено не было (рис.24Б).

Для потверждения результатов корреляционного анализа мы построили усредненные профили 4С-сигнала в окрестностях CpG-островков и аннотированных промоторов куриного генома. Для якорного фрагмента NPRL3 профиль имеет четкий максимум на CpG-островке (рис.25А) и чуть выше точки инициации транскрипции (рис.25Б), тогда как между CpGостровками идет на спад (рис.25В). Для якорного фрагмента GENE-Des наблюдалась противоположная картина (рис.25Г-Е). Подводя итог, можно было заключить, что кластеризация CpG-островков является важным фактором, определяющим пространственную организацию интерфазных хромосом.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Пространственная организация домена бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках на разных стадиях эмбрионального развития Согласно современным представлениям, для реализации активирующего действия энхансера необходимо его сближение с подконтрольным промотором (de Laat and Grosveld, 2003;

West and Fraser, 2005; Wijgerde et al., 1995; Zhu et al., 2007). Предполагается, что промоторы и энхансеры объединяются в общий ДНК-белковый комплекс – активаторный хроматиновый блок.

Было показано, что переключение экспрессии бета-глобиновых генов мыши в ходе развития коррелирует с реконфигурацией активаторного хроматинового блока (Palstra et al., 2003). Целью настоящего исследования была проверка, сопровождается ли переключение экспрессии бетаглобиновых генов кур пространственной реконфигурацией соответствующего геномного домена.

Анализ представлялся нам интересным по двум причинам. Во-первых, домен бета-глобиновых генов кур представляет собой наиболее характерный пример так называемых доменов закрытого типа (Razin et al., 2003), поскольку фланкирующие домен инсуляторы точно ограничивают область предпочтительной чувствительности к ДНКазе I в эритроидных клетках (Kukushkin et al., 1988), что не характерно для доменов бета-глобиновых генов мыши и человека (Bulger et al., 2003;

Schubeler et al., 2000). Во-вторых, в домене бета-глобиновых генов кур присутствует внутренний энхансерный элемент в дополнение к области контроля локуса (Choi and Engel, 1986). Таким образом, были основания полагать, что регуляция экспрессии бета-глобиновых генов кур отличается от регуляции экспрессии этих генов у млекопитающих.

Результаты нашего исследования показали, что в эритроидных клетках осуществляется взаимодействие между 5’- и 3’-концевыми инсуляторами домена бета-глобиновых генов кур. В результате домен должен быть организован в замкнутую петлю хроматина. Хотя мы не исследовали механизм формирования этой петли, весьма вероятно, что в этот процесс вовлечен белок CTCF, поскольку оба инсулятора содержат CTCF-связывающие участки (Bell et al., 1999;

Saitoh et al., 2000), и ряд работ указывает на важную роль белка CTCF как медиатора взаимодействия удаленных элементов генома (Kurukuti et al., 2006; Splinter et al., 2006; Zuin et al., 2014). Подобный тип пространственной организации может объяснить тот факт, что ограниченный инсуляторами функциональный домен практически точно колокализуется с эритроидспецифичным доменом предпочтительной чувствительности к ДНКазе I и доменом гиперацетилирования гистонов (Hebbes et al., 1994). В согласии с этой моделью, мы не обнаружили взаимодействия между концевыми инсуляторами домена в неэритроидных клетках, в которых домен не обладает предпочтительной чувствительностью к ДНКазе I (Wood and Felsenfeld, 1982).

Наиболее интересной особенностью пространственной организации домена бетаглобиновых генов кур является отсутствие взаимодействия эмбрионального бета-глобинового гена с областью контроля локуса (LCR) и /-энхансером. В данной связи примечательно, что в альфа-глобина также не домене альфа-глобиновых генов кур ген эмбрионального взаимодействует ни с одним удаленным регуляторным элементом домена (Ioudinkova et al., 2011).

Таким образом, создается впечатление, что у кур раннеэмбриональные глобиновые гены и альфа-, и бета-типов обладают автономной регуляторной системой. При изучении состава активаторного хроматинового блока домена бета-глобиновых генов кур мы обнаружили и другие особенности.

Прежде всего то, что участок DHS2 области контроля локуса взаимодействует с промотором гена A уже в 3-дневных эритроцитах, для которых уровень транскрипции этого гена очень низкий. С другой стороны, мы обнаружили сильное взаимодействие между промоторами генов и A, Рис. 26. Пространственная конфигурация домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках 3- и 9дневных эмбрионов кур и эмбриональных фибробластах. Окружностями обозначены зоны контакта регуляторных элементов (активаторный хроматиновый блок). Голубые эллипсы символизируют белковые комплексы на концевых инсуляторах домена.

которое детектируется также в клетках неэритроидного происхождения. Примечательно, что уровень взаимодействия промоторов этих генов с DHS2 значительно различается в эритроидных клетках 3-го дня развития (там промотор гена предпочтительно взаимодействует с DHS2) и 9-го дня развития (здесь промотор гена A предпочтительно взаимодействует с DHS2). Мы предполагаем, что на 3-ем дне эмбрионального развития промотор гена непосредственно взаимодействует с LCR, тогда как промотор гена A пассивно привлекается к активаторному блоку через взаимодействие с геном. На 9-ом дне развития ситуация оказывается противоположной. В итоге гены и A обнаруживают специфичную по отношению к стадии развития ассоциацию с LCR, коррелирующую с экспрессионным статусом этих генов. Еще в большей степени такую специфичность демонстрирует фетальный бета-глобиновый ген H, который не взаимодействует с LCR на 3-ем дне эмбрионального развития и начинает взаимодействовать с LCR на 9-ом дне, когда программа транскрипции глобиновых генов переключается с эмбрионального на взрослый тип. Наконец, отметим, что на обеих стадиях развития наблюдается взаимодействие между промоторами генов A и H. Принимая во внимание, что якорные фрагменты, несущие DHS2 и промотор гена, не взаимодействуют с геном H, но взаимодействуют с геном A в 3-дневных эритроцитах, следует заключить, что на данной стадии развития взаимодействие промоторов двух взрослых бета-глобиновых генов осуществляется за пределами активаторного хроматинового блока. Две альтернативные хроматиновые конфигурации домена бета-глобиновых генов, характерные для эритроидных клеток 3-х дневных куриных эмбрионов, показаны на рис.26.

В эритроцитах 9-го дня эмбрионального развития уровень взаимодействия большинства регуляторных элементов домена бета-глобиновых генов повышается при сравнении с эритроцитами 3-го дня развития. Это наблюдение может отражать более компактную организацию всего бета-глобинового домена. По всей видимости, домен испытывает некоторое давление со стороны всей хромосомной территории, которая постепенно принимает более компактную конфигурацию в ходе созревания эритроидных клеток. В то же время, он остается активным и обладает некоторыми свойствами активных хроматиновых доменов (Goldsmith, 1981). Ключевую роль здесь может играть пространственная изоляция домена от окружающего хроматина посредством его размещения в отдельной хроматиновой петле, образованной посредством взаимодействия концевых инсуляторов домена.

2. Регуляция транскрипции альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 посредством сборки альтернативных активаторных хроматиновых блоков Наряду с доменами бета-глобиновых генов, домены альфа-глобиновых генов позвоночных животных в течение многих лет служат моделью для изучения регуляции транскрипции высших эукариот (Higgs et al., 2008). В нашей лаборатории было показано, что у кур домен альфаглобиновых генов включает также ген TMEM8 – эритроидспецифичный ген, индуцирующийся в ходе терминальной эритроидной дифференцировки. Вероятно, ген TMEM8 оказался в составе домена альфа-глобиновых генов в результате инверсии относительно короткого сегмента хромосомы, вследствие которой этот ген оказался поблизости с кластером альфа-глобиновых генов. В «прототипном» домене альфа-глобиновых генов позвоночных ген TMEM8 локализуется достаточно далеко от кластера и не демонстрирует эритроидной специфичности (Motohashi et al., 2000).

Мы предположили, что установление соседства с альфа-глобиновыми генами в результате хромосомной инверсии привело к тому, что ген TMEM8 попал под контроль регуляторных элементов альфа-глобиновых генов и оказался «втянутым» в сеть пространственных взаимодействий внутри домена. С использованием метода 3С мы установили, что два ранее идентифицированных регуляторных элемента домена альфа-глобиновых генов кур действительно взаимодействуют с промотором гена TMEM8 в терминально дифференцированных клетках HD3.

Это 3’-концевой энхансер домена и участок гиперчувствительности к ДНКазе I -9DHS (рис.27 справа). Примечательно, что -9DHS привлекается к промотору гена TMEM8 еще до начала Рис. 27. Альтернативные активаторные хроматиновые блоки альфа-глобиновых генов (слева) и гена TMEM8 (справа) в дифференцированных эритроидных клетках кур. Оба блока включают -9DHS и 3’-концевой энхансер, тогда как другие «игроки» различны. Схема активаторного хроматинового блока альфа-глобиновых генов представлена в соответствии с работой (Gavrilov and Razin, 2008).

терминальной эритроидной дифференцировки (рис.27 в центре). В дифференцированных клетках HD3 промотор гена TMEM8 взаимодействует также с энхансером, локализованном в «теле» гена TMEM8.

Неожиданным явилось обнаружение того, что главный регуляторный элемент домена альфа-глобиновых генов MRE, а также промотор взрослого альфа-глобинового гена D не взаимодействуют с промотором гена TMEM8. Это означает, что TMEM8 не привлекается к активаторному хроматиновому блоку альфа-глобиновых генов (рис.27 слева); для активации транскрипции гена TMEM8 собирается альтернативный активаторный хроматиновый комплекс (рис.27 справа). Активаторные хроматиновые блоки альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 делят два общих элемента (3’-концевой энхансер и -9DHS), тогда как другие элементы различаются. Это предполагает, что на каждой хромосоме -9DHS и энхансер должны перемещаться (курсировать) между двумя альтернативными хроматиновыми блоками в соответствии с предложенной ранее «флип-флоп» моделью (Gribnau et al., 1998; Wijgerde et al., 1995). Эта модель была предложена для объяснения способности LCR домена бета-глобиновых генов активировать транскрипцию нескольких генов, одновременно транскрибирующихся в одной клетке. Хотя данную модель не опровергали, она была практически забыта после предложения модели активаторного хроматинового блока (de Laat and Grosveld, 2003). На основе полученных нами данных можно предположить, что две модели не являются взаимоисключающими и что активаторные хроматиновые блоки следует рассматривать как динамичные, а не статичные структуры.

–  –  –

сшивки между расположенными рядом хроматиновыми фибриллами будут «замораживать»

пространственную конфигурацию больших хромосомальных доменов. Относительные позиции геномных элементов внутри этих доменов не изменятся после внесения ограниченного числа двухцепочных разрывов в ДНК. Между тем, концы ДНК будут обладать ограниченной подвижностью, достаточной для лигирования с другими концами, локализованными в пространственной близости. В первом приближении можно предположить, что процесс сшивки хроматиновых фибрилл формальдегидом носит случайный характер. Иногда фрагменты могут избежать пришивки к общей сети, и тогда они будут солюбилизироваться в ходе экстракции SDS.

Однако взаимные позиции различных геномных элементов не будут сохраняться в растворимой фракции, представленной обособленными фрагментами ДНК. Следовательно, мы не регистрируем ожидаемых 3С-сигналов в растворимой фракции.

Отметим, что признание того факта, что лигирование близкорасположенных фрагментов ДНК в протоколе 3С осуществляется в нелизированных ядрах, не ставит под сомнение существование и функциональную значимость петель хроматина, сближающих удаленные регуляторные элементы. Модель лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в составе хроматиновой сети (рис.28) предполагает некоторую степень пластичности активаторного хроматинового блока. Коль скоро жесткой фиксации всех составляющих элементов путем формирования общего ДНК-белкового комплекса не требуется, активаторный хроматиновый блок может быть рассмотрен как специфически уложенный хроматиновый домен или ядерный компартмент, к которому привлекаются регуляторные элементы и промоторы транскрибируемых генов. Близкие позиции всех регуляторных элементов могут поддерживаться с помощью белков, непосредственно не взаимодействующих с каждым из элементов, например, CTCF и когезином, удерживающим вместе два инсулятора (Hou et al., 2010; Mishiro et al., 2009; Sofueva and Hadjur, 2012), или SATB1/2, взаимодействующим с S/MAR-элементами (Zhou et al., 2012). Предложенная нами модель не исключает возможности реализации короткоживущих, попеременных взаимодействий регуляторных элементов с различными промоторами, представленными в активаторном хроматиновом компартменте. Наличие этих временных взаимодействий может объяснить ранее обнаруженный феномен альтернативной транскрипции бета-глобиновых генов (Gribnau et al., 1998; Wijgerde et al., 1995), предположительно привлекающихся к общему активаторному блоку (Tolhuis et al., 2002). Не следует также исключать возможности того, что энхансеры, представленные в активаторном компартменте, могут служить центрами нуклеации для привлечения РНК-полимеразы II, комплексов ремоделирования хроматина, гистонацетилтрансфераз и других белков, обеспечивающих работу транскрипционного аппарата.

4. Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С Вывод о том, что взаимодействия между энхансерами и промоторами носят динамичный, а не статичный характер, косвенно подтверждается результатами нашей работы по анализу абсолютных частот лигирования в процедуре 3C. Мы показали, что частота лигирования между фрагментами, предположительно собранными в один активаторный хроматиновый блок, составляет не более десятых долей процента, если определять ее относительно общего количества каждого из фрагментов. Данная низкая частота лигирования наблюдалась для фрагментов, содержащих промотор активного бета-глобинового гена, Hbb-b1, и его удаленные энхансеры. В то же время, частота лигирования фрагментов, использованных в качестве отрицательного контроля, была в большинстве случаев ниже 0.1%.

Низкий выход продуктов лигирования, наблюдаемый в наших экспериментах, может иметь разные объяснения. Прежде всего, необходимо рассмотреть технические особенности экспериментальной процедуры. Каждый рестрикционный фрагмент имеет два «липких» конца, которыми он может лигироваться с другими фрагментами. В предполагаемом активаторном хроматиновом блоке каждый фрагмент, вероятно, сближен со многими другими рестрикционными фрагментами. Если предположить, что различные фрагменты, локализованные в пространственной близости, лигируются с равной вероятностью, можно ожидать, что выход продуктов лигирования с каждым конкретным концом будет обратно пропорционален числу этих концов. Наши эксперименты подтверждают это предположение. Действительно, частощепящая рестриктаза MboI вносит намного больше разрывов, чем HindIII, и выход специфических продуктов лигирования в экспериментах с MboI существенно ниже такового в экспериментах с HindIII. С другой стороны, все рассмотренные выше факторы должны в равной степени затрагивать вероятность циркуляризации якорного фрагмента. Между тем мы установили, что выход циркуляризованного якорного фрагмента как минимум в 10 раз превышает выход продуктов лигирования этого фрагмента с любым из удаленных фрагментов, предположительно участвующих во взаимодействии с якорным фрагментом. Простейшее объяснение этому наблюдению состоит в том, что значительная доля якорных фрагментов не сшита ни с одним другим рестрикционным фрагментом.

Вероятность сшивки различных участков сложенной хроматиновой фибриллы может зависеть от многих факторов, включая эффективность сшивки самой по себе и действительных частот, с которыми целевые участки ДНК взаимодействуют в ядре. В данном отношении следует отметить, что большинство клеток в популяции, использованной в нашем исследовании (клетки печени эмбрионов мыши 14-го дня развития), являются предшественниками эритроидных клеток, транскрибирующих гены Hbb-b1 и Hbb-b2 (Wijgerde et al., 1995; Zhang et al., 2003); можно ожидать, что взаимодействия между глобиновыми генами и их энхансерами реализуются во всех этих клетках.

В свете этих соображений, низкая частота лигирования, наблюдающаяся в наших экспериментах, может отражать тот факт, что эти взаимодействия не являются в достаточной мере стабильными или единообразными для того, чтобы поддерживать сшивку соответствующих фрагментов хроматиновой фибриллы в большинстве клеток, представленных в популяции. Эти данные снова приводят нас к «флип-флоп» модели действия энхансера, предполагающей, что взаимодействия между промоторами и энхансерами бета-глобиновых генов короткоживущие и динамичные.

5. Выявление прямых контактов между геномными элементами методом молекулярных колоний Проведенные нами исследования домена бета-глобиновых генов мыши методом 3С позволили показать, что образование прямых «белковых мостиков» между регуляторными элементами ДНК, такими как промоторы и энхансеры активных бета-глобиновых генов, является достаточно редким событием (если вообще осуществляется). Этот вывод представляется чрезвычайно интересным в контексте понимания механизмов, опосредующих сближение регуляторных элементов генома. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что сближение промоторов и энхансеров регулируется скорее способом макроупаковки хроматиновой фибриллы (модель активаторного хроматинового компартмента, см. рис.28), нежели организацией элементов в единый ДНК-белковый комплекс, сформированный за счет взаимодействия связанных с элементами регуляторных белков (модель активаторного хроматинового хаба (de Laat and Grosveld, 2003)). Вместе с тем, необходимо учитывать, что данные 3С-анализа сложно интерпретируемы и не всегда однозначны. Для оценки частоты прямого взаимодействия регуляторных элементов генома важно иметь экспериментальный подход, позволяющий напрямую идентифицировать и подсчитывать мультикомпонентные комплексы геномных элементов, не полагаясь на принцип лигирования близкорасположенных фрагментов. С этой целью нами и был разработан и применен метод INGRID.

В методе INGRID комплексы идентифицируются тем же прямым образом, как и в методе FISH. Однако, поскольку разрешение анализа повышается на несколько порядков, метод позволяет исследовать пространственное взаимодействие намного менее удаленных участков хроматина. Подобно FISH, INGRID-анализ позволяет определить долю геномных локусов, в которых определенные участки ДНК взаимодействуют. Обнаружение определенной комбинации фрагментов в составе мультикомпонентных ДНК-колоний свидетельствует о присутствии этих фрагментов в составе недиссоциируемых (сшитых) хроматиновых комплексов, тогда как определение доли этих мультикомпонентных колоний среди всех колоний, визуализируемых данной пробой, позволяет определить долю хромосом, в которых представлен комплекс.

В нашей работе мы использовали протокол INGRID для анализа предполагаемого активаторного хроматинового блока домена бета-глобиновых генов мыши. С использованием этой классической модельной системы нам не удалось зарегистрировать комплексы, несущие промоторы мажорного и минорного бета-глобиновых генов и участок DHS5 области контроля локуса (ни попарно, ни в тройных комплексах). Принимая во внимание фоновый уровень случайной колокализации молекулярных колоний, мы подсчитали, что если такие комплексы и существуют, то они должны присутствовать не более чем в 3% хромосом, представленных в анализируемом образце. Способность метода INGRID к регистрации опосредованных белками взаимодействий в хроматине была продемонстрирована обнаружением того факта, что ампликоны из отдельных рестрикционных фрагментов образовывали около 10% бинарных молекулярных колоний, если эти фрагменты располагались в хромосоме по соседству друг с другом. В целом, результаты INGRID-анализа подтверждают выводы, сделанные на основании проведенного нами 3С-анализа, и свидетельствуют о том, что активаторные хроматиновые блоки, предложенные де Лаатом и Гросвелдом (de Laat and Grosveld, 2003), либо не существуют, либо являются нестабильными и/или короткоживущими образованиями, которые в каждый момент времени собраны лишь в небольшой доле клеток, представленных в популяции. Данное наблюдение может in situ, показаться противоречащим результатам флуоресцентной гибридизации демонстрирующим, что в некоторых случаях гены и удаленные регуляторные элементы колокализуются в значительной доле клеток популяции, которая может достигать 30% (Williamson et al., 2012) или даже 85% (Phillips-Cremins et al., 2013). Однако с помощью FISH невозможно отличить ситуации, когда элементы взаимодействуют непосредственно (модель активаторного хроматинового хаба (de Laat and Grosveld, 2003)) или лишь сближены в ядерном пространстве (модель активаторного хроматинового компартмента). Наши результаты не ставят под сомнение важность промотор-энхансерных взаимодействий, однако указывают на бльшую пластичность этих взаимодействий, чем постулируется в модели активаторного хроматинового блока.

Метод INGRID может стать важным инструментом для изучения трехмерной структуры генома. То, что для проведения эксперимента требуются небольшие количества начального материала, открывает широкие возможности для исследования индивидуальных клеток. Хотя в нашем случае мы осуществляли мониторинг лишь трех ампликонов для визуализации тройственных взаимодействий, протокол INGRID может быть легко адаптирован для анализа 4-х и более ампликонов при условии наличия устройств, позволяющих одновременно регистрировать флуоресценцию большего числа различных флуорофоров. С использованием более длинных ампликонов и/или более плотных гелей размер молекулярных колоний может быть уменьшен до 10 мкм и меньше, что создает возможности для разрешения тысяч колоний в единичном геле и значительно повышает производительность метода (Chetverin and Chetverina, 2008). Возможность определения состава и количества ассоциированных геномных элементов открывает широкую дорогу для использования метода INGRID в исследованиях по изучению разнообразия и динамики любых хроматиновых структур, доступных для исследования в растворимой форме.

6. Ядерный матрикс как платформа для взаимодействия удаленных регуляторных элементов генома Пространственная организация эукариотического генома тесно связана с функциональной компартментализацией клеточного ядра. Укладка хроматина в значительной мере определяет позиционирование внутриядерных компартментов, и наоборот – привлечение геномных локусов к различным ядерным компартментам играет определенную роль в создании специфической архитектуры интерфазных хромосом. Согласно одной из точек зрения, подобная организация поддерживается внутренней скелетной структурой – ядерным матриксом, который обеспечивает заякоривание петель хроматина и позиционирование ядерных компартментов (Berezney, 2002;

Elcock and Bridger, 2008). Нам представлялось интересным выяснить, существует ли связь между петлями ДНК, ассоциированными с ядерным матриксом, и петлями ДНК, которые могут быть картированы с помощью процедуры 3С. Разработанный нами протокол M3C опирается на операционное определение ядерного матрикса (Berezney and Coffey, 1977). Если ядерный матрикс и комплексы ДНК с ядерным матриксом устойчивы к экстракции 2M раствором NaCl, тогда частоты лигирования связанных с ядерным матриксом фрагментов ДНК можно анализировать без процедуры фиксации.

Протокол M3C был использован нами для изучения роли ядерного матрикса в пространственной организации участка хромосомы-14 кур, включающего домен альфаглобиновых генов и ряд генов домашнего хозяйства. Полученные нами данные свидетельствуют о взаимодействии нескольких CpG-островков, представленных в изучаемой области генома, на ядерном матриксе. Это СpG-островки, ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства NPRL3, MPRL28 и AXIN1. Вероятно, группа CpG-островков на ядерном матриксе представляет собой транскрипционную фабрику (или часть транскрипционной фабрики), которая может включать CpG-островки, несущие промоторы других генов, лежащих вне анализируемой области генома. Примечательно, что CpG-островок, локализованный между генами MPRL28 и AXIN1 и не ассоциированный с каким-либо геном, не привлечен к указанной группе CpGостровков. Отсюда следует, что взаимодействие CpG-островков на ядерном матриксе коррелирует с транскрипцией генов домашнего хозяйства, ассоциированных с этими CpG-островками.

Об организации транскрипционных фабрик известно сравнительно мало (Papantonis and Cook, 2013; Sutherland and Bickmore, 2009). Основным доказательством в пользу их существования является кластеризация транскрибирующих молекул РНК-полимеразы II. Сообщалось, что транскрипционные фабрики собираются на ядерном матриксе (Jackson, 1997). Наши данные согласуются с этим наблюдением. Исследования по анализу пространственной организации домена альфа-глобиновых генов мыши предполагают, что промоторы альфа-глобиновых генов привлекаются к предсуществующей транскрипционной фабрике, опосредующей транскрипцию окружающих генов домашнего хозяйства в ответ на активацию глобиновых генов (Zhou et al.

, 2006). Полученные нами результаты предполагают, что это же верно и для домена альфаглобиновых генов кур. Однако, эритроидспецифичные взаимодействия между промоторами глобиновых генов и CpG-островками фланкирующих генов домашнего хозяйства, детектируемые с использованием обычного протокола 3С, не выявляются в M3Cэкспериментах. Это наблюдение согласуется с низким содержанием эритроидспецифичных регуляторных элементов в ядерном матриксе, выделенном из эритроидных (HD3) или неэритроидных (DT40) клеток. По всей видимости, эти взаимодействия не стабилизированы ядерным матриксом и не устойчивы к высокосолевой экстракции.

В целом, полученные нами данные указывают на то, что транскрипционные фабрики смешанного типа, осуществляющие транскрипцию как тканеспецифичных генов, так и генов домашнего хозяйства, построены из «базового», или «конститутивного», компартмента, включающего промоторы генов домашнего хозяйства, которые стабильно Рис. 29. Модель связанной с ядерным матриксом интегрированы в ядерный матрикс, и «гостевого»

транскрипционной фабрики в эритроидных компартмента, куда могут временно клетках. CpG-островки, содержащие промоторы генов домашнего хозяйства NPRL3, MPRL28 и привлекаться промоторы и регуляторные AXIN1 (обозначены номерами 1, 3 и 5), составляют «конститутивный компартмент» транскрипционной элементы тканеспецифичных генов. Модель фабрики. Они перманентно прикреплены к ядерному матриксу (частично интегрированы в него).

связанной с ядерным матриксом Элементы «гостевого компартмента» (промотор гена D и эритроидспецифичный главный регуляторный транскрипционной фабрики представлена на элемент MRE) взаимодействуют с поверхностью рис.29. Функциональный смысл подразделения конститутивного компартмента, не погруженной в ядерный матрикс. Эти взаимодействия не устойчивы транскрипционной фабрики на два компартмента к экстракции 2 M NaCl и утрачиваются в результате этой экстракции.

в настоящее время не вполне ясен. Возможно, высокий уровень транскрипции не совместим с интеграцией гена в ядерный матрикс.

7. Кластеризация CрG-островков как важный фактор пространственной организации интерфазных хромосом Обнаружение пространственного взаимодействия CpG-островков, ассоциированных с промоторами генов домашнего хозяйства, в масштабе отдельно взятого геномного домена (предыдущий раздел) послужили поводом для полногеномного исследования взаимодействий CpG-островков. Результаты этих исследований показали, что CpG-островки проявляют тенденцию к пространственной кластеризации в масштабе всего генома.

На основании результатов HiC-анализа Деккер и соавт. предположили, что активный и неактивный хроматин сегрегированы в пространстве ядра и формируют два различных компартмента (Lieberman-Aiden et al., 2009; Sanyal et al., 2012). Наши результаты поддерживают гипотезу о том, что активные участки генома формируют отдельный пространственный компартмент. Действительно, как показали результаты 4С-анализа, якорные фрагменты, размещенные на CpG-островках, вовлечены в пространственные взаимодействия с участками той же и других хромосом, обогащенных CpG-островками. Напротив, якорный фрагмент, локализованный в области, обедненной генами и CpG-островками, не демонстрирует предпочтительного взаимодействия с областями, обогащенными CpG-островками. Не вполне ясно, может ли укладка хромосомы обеспечить одновременное взаимодействие всех богатых генами участков. Однако важно отметить, что 4С- и другие С-методы позволяют получить лишь усредненную картину того, что происходит в различных клетках, присутствующих в популяции.

Эта картина, вероятно, представляет собой суперпозицию ряда альтернативных хроматиновых конфигураций, существующих в индивидуальных клетках (Barbieri et al., 2013; Nagano et al., 2013).

Результаты проведенного нами исследования дают основания полагать, что пространственное взаимодействие (кластеризация) CpG-островков может служить движущей силой пространственной сегрегации активных участков генома. Функциональный смысл пространственной кластеризации CpG-островков и механизмы, поддерживающие эту кластеризацию, не вполне очевидны. Возможно, это отражает ассоциацию транскрибирующихся генов в транскрипционных фабриках. Важно отметить, что гены домашнего хозяйства составляют основную часть транскрибируемых генов даже в специализированных типах клеток и промоторы большинства генов домашнего хозяйства лежат в CpG-островках (Deaton and Bird, 2011).

Предполагая отсутствие большой специфичности в ассоциации генов в составе транскрипционных фабрик, можно ожидать, что каждая транскрипционная фабрика содержит один или несколько генов домашнего хозяйства.

В эритроидных клетках эритроидспецифичные гены демонстрируют тенденцию к транскрипции в составе общих транскрипционных фабрик (Schoenfelder et al., 2010). Однако вероятность ассоциации более двух эритроидспецифичных генов в одной транскрипционной фабрике меньше ожидаемой, рассчитанной на основании случайного распределения генов между всеми транскрипционными фабриками. Принимая во внимание, что «среднестатистическая»

транскрипционная фабрика содержит 8 (согласно другим оценкам – 30) молекул элонгирующей РНК-полимеразы II (Martin and Pombo, 2003; Iborra et al., 1996; Jackson et al., 1998), можно предположить, что в эритроидных клетках «ядро» всех транскрипционных фабрик образовано транскрибирующимися генами домашнего хозяйства. Использование нашей экспериментальной модели позволило оценить относительный вклад ассоциации тканеспецифичных генов и генов домашнего хозяйства в создание специфической пространственной организации интерфазных хромосом. В качестве якорного рестрикционного фрагмента был использован фрагмент, несущий CpG-островок, который расположен на небольшом расстоянии от кластера альфа-глобиновых генов, неактивных в лимфоидных клетках. Соответственно, ассоциация между эритроидспецифичными генами не должна была вносить вклад в спектр 4С-сигналов, наблюдаемых в этих клетках. Наоборот, такой вклад ожидался для эритроидных клеток (HD3).

Тем не менее, и в эритроидных, и в лимфоидных клетках была зарегистрирована лишь корреляция 4С-сигнала с плотностью CpG-островков и мотивов связывания универсального транскрипционного фактора Sp1, но не с плотностью предсказанных участков связывания эритроидспецифичных транскрипционных факторов. Отсюда следует, что ассоциация CpGостровков вносит больший вклад в пространственную организацию генома, чем ассоциация эритроидспецифичных генов.

При рассмотрении возможного функционального значения кластеризации CpG-островков необходимо отметить, что CpG-островки часто содержат участки начала репликации ДНК (Cayrou et al., 2011). Более того, показано, что наиболее активные участки начала репликации располагаются в CpG-островках, содержащих промоторы активных генов (Sequeira-Mendes et al., 2009). Ориджины репликации и связанные с ними белки организуются в фокусы репликации (Fujita et al., 2002), которые, по всей видимости, преобразуются в репликационные фабрики (Cseresnyes et al., 2009; Hozak and Cook, 1994) при активации ориджинов. Это предполагает, что кластеризация CpG-островков может иметь отношение к пространственной организации репликационных единиц. Наши результаты дают косвенное подтверждение этой гипотезе. Мы показали, что якорный фрагмент «NPRL3», в котором расположен CpG-островок, несущий участок начала репликации (Razin et al., 1986), устанавливает дальние взаимодействия с участками хромосом, содержащими G-тетрадные мотивы, которые часто присутствуют в CpG-островках и представляются важными элементами участков начала репликации высших эукариот (Cayrou et al., 2012). Другие якорные фрагменты, содержащие CpG-островки, также демонстрировали предпочтительные взаимодействия с G-квадруплексами.

Гипотезы о том, что кластеризация CpG-островков отражает организацию ориджинов репликации в репликационные фабрики и генов домашнего хозяйства в транскрипционные фабрики, не являются взаимоисключающими. В обоих случаях кластеризация может поддерживаться под действием сил, возникающих в условиях макромолекулярного скопления (Ellis, 2001; Hancock, 2004; Marenduzzo et al., 2006). Какие-то дополнительные взаимодействия могут также стабилизировать ассоциацию CpG-островков. CpG-островки часто содержат участки связывания белка CTCF, а роль CTCF в поддержке трехмерной организации генома неоднократно обсуждалась выше. Соответственно, в проведенном полногеномном анализе была выявлена корреляция между 4С-сигналом и участками связывания CTCF, которые были определены методом ChIP-seq. По всей видимости, связывание CTCF в транскрипционно активных областях генома содействует пространственной сегрегации этих геномных областей.

ВЫВОДЫ

1. На модели домена бета-глобиновых генов кур продемонстрировано, что корреляция между привлечением промотора к активаторному хроматиновому блоку и вовлечением гена в транскрипцию не является абсолютной. Установлено, что эмбриональный ген не взаимодействует ни с одним из удаленных регуляторных элементов.

Продемонстрировано, что транскрипция альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 2.

контролируется альтернативными активаторными хроматиновыми блоками, включающими два общих регуляторных элемента.

3. Уточнен принцип работы протокола фиксации конформации хромосомы (3С). Впервые продемонстрировано, что стадия лигирования осуществляется внутри ядра в сети сшитых хроматиновых фибрилл, а не в растворе после лизиса ядер.

4. Разработан новый метод количественного анализа взаимодействий геномных элементов на основе техники молекулярных колоний. С использованием этого метода продемонстрировано, что промоторы активных бета-глобиновых генов мыши и их удаленные энхансерные элементы не организованы в единый ДНК-белковый комплекс.

5. Обоснована новая модель позиционирования геномных элементов в ядре, постулирующая, что сближение промоторов и энхансеров регулируется способом макроупаковки хроматиновой фибриллы, обеспечивающим позиционирование промоторов и контролирующих их энхансеров в одном ядерном компартменте.

6. Разработан новый метод, позволяющий анализировать степень пространственной сближенности прикрепленных к ядерному матриксу фрагментов ДНК. С использованием этого метода показано, что промоторы ряда генов домашнего хозяйства, расположенных во фланкирующих областях домена альфа-глобиновых генов кур, взаимодействуют друг с другом на ядерном матриксе. Предложена модель транскрипционной фабрики, связанной с ядерным матриксом.

7. Продемонстрировано, что кластеризация CpG-островков, включающих промоторы генов домашнего хозяйства и участки начала репликации ДНК, является важным фактором пространственной организации интерфазного генома.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах

1. Gavrilov A., Eivazova E., Priozhkova I., Lipinski M., Razin S., Vassetzky Y. (2009).

Chromosome conformation capture (from 3C to 5C) and its ChIP-based modification. Methods Mol. Biol.

567, 171-88.

2. Eivazova E.R., Gavrilov A., Pirozhkova I., Petrov A., Iarovaia O.V., Razin S.V., Lipinski M., Vassetzky Y.S. (2009). Interaction in vivo between the Two Matrix Attachment Regions Flanking a Single Chromatin Loop J. Mol. Biol. 386, 929-37.

3. Klochkov D., Gavrilov A., Vassetzky E.S., Razin S.V. (2009). Early replication timing of the chicken alpha-globin gene domain correlates with its open chromatin state in cells of different lineages.

Genomics 93, 481-86.

4. Gavrilov A., Razin S.V. (2009). Formaldehyde fixation of cells does not greatly reduce the ability to amplify cellular DNA. Anal Biochem. 390, 94-6.

5. Филоненко Е.С., Гаврилов А.А., Разин С.В., Яровая О.В. (2009). В эритроидных клетках кур протяженный фрагмент хромосомы 14, включающий кластер альфа-глобиновых генов, организован в микропетли. Acta Naturae 1, 105–8.

6. Philonenko E.S., Klochkov D.B., Borunova V.V., Gavrilov A.A., Razin S.V., Iarovaia O.V.

(2009). TMEM8 – a non-globin gene entrapped in the globin web. Nucleic Acids Res. 7, 7394-406.

7. Gavrilov A.A., Zukher I.S., Philonenko E.S., Razin S.V., Iarovaia O.V. (2010). Mapping of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. Nucleic Acids Res. 38, 8051-60.

8. Разин С.В., Гаврилов А.А., Яровая О.В. (2010). Транскрипционные фабрики и пространственная организация эукариотического генома. Биохимия 75, 1477-88.

9. Филоненко Е.С., Гаврилов А.А., Разин С.В., Яровая О.В. (2010). Расширение функционального домена альфа-глобиновых генов кур. Генетика 46, 1164-67.

10. Razin S.V., Gavrilov A.A., Pichugin A., Lipinski M., Iarovaya O.V., Vassetzky Y.S. (2011).

Transcription factories in the context of the nuclear and genome organization. Nucleic Acids Res. 39, 9085-92.

11. Gavrilov A.A., Philonenko E.S., Iarovaya O.V., Razin S.V. (2011). Dynamic nature of active chromatin hubs. Biopolymers and Cell 27, 364-8.

12. Юдинкова Е.С., Бунина Д.А., Ульянов С.В., Гаврилов А.А., Разин С.В. (2011). Профили распределения модифицированных форм гистонов в домене альфа-глобиновых генов кур.

Молекулярная биология 45, 662-7.

13. Lorenzo P.I., Brendeford E.M., Gilfillan S., Gavrilov A.A., Leedsak M., Razin S.V., Sther T., Gabrielsen O.S. (2011). Identification of c-Myb Target Genes in K562 Cells Reveals a Role for c-Myb as a Master Regulator. Genes & Cancer 2, 805-17.

14. Yudinkova E.S., Ulyanov S.V., Bunina D.A., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2011).

The inactivation of the gene in chicken erythroblasts of adult lineage is not mediated by packaging of the embryonic part of the alpha-globin gene domain into a repressive heterochromatin-like structure.

Epigenetics 6, 1481-8.

15. Ulianov S.V., Markova E.N., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2012). Insulators in vertebrates:

regulatory mechanisms and chromatin structure. Biopolymers and Cell 28, 252-60.

16. Gavrilov A.A., Razin S.V., Iarovaia O.V. (2012). C-methods to study 3D organization of the eukaryotic genome. Biopolymers and Cell 28, 245-51.

17. Разин С.В., Ульянов С.В, Юдинкова Е.С., Гущанская Е.С., Гаврилов А.А., Яровая О.В.

(2012). Домены альфа и бета-глобиновых генов кур в контексте структурно-функциональной организации эукариотического генома. Успехи биологической химии 52, 3-36.

18. Ульянов С.В., Гаврилов А.А. (2012). Бета-глобиновые гены кур: модельная система для изучения регуляции транскрипции на уровне геномных доменов. Молекулярная биология 46, 683-98.

19. Ulianov S.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2012) Spatial organisation of the chicken -globin gene domain in erythroid cells of embryonic and adult lineages. Epigenetics and chromatin 5, 16.

20. Gavrilov A.A., Gushchanskaya E.S., Strelkova O., Zhironkina O., Kireev I.I., Iarovaia O.V., Razin S.V. (2013) Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Res 41, 3563-75.

21. Gavrilov A.A., Golov A.K., Razin S.V. (2013) Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One 8, e60403.

22. Razin S.V., Gavrilov A.A., Ioudinkova E.S., Iarovaia O.V. (2013) Communication of genome regulatory elements in a folded chromosome. FEBS Lett 587, 1840-7.

23. Gavrilov A.A., Chetverina E.V., Chermnykh E.S., Razin S.V., Chetverin A.B. (2014) Quantitative analysis of genomic element interactions by molecular colony technique. Nucleic Acids Res. 42, e36.

24. Razin S.V., Gavrilov A.A. (2014) Chromatin without the 30-nm fiber: constrained disorder instead of hierarchical folding. Epigenetics 9, 653-7.

25. Gushchanskaya E.S., Artemov A.V., Ulyanov S.V., Logacheva M.D., Penin A.A., Kotova E.S., Akopov S.B., Nikolaev L.G., Iarovaia O.V., Sverdlov E.D., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2014) The clusterization of CpG islands constitutes an important determinant of the 3D organization of interphase chromosomes. Epigenetics 9, 951-63.

26. Гущанская Е.С., Гаврилов А.А., Разин С.В. (2014) Пространственная организация интерфазных хромосом и роль динамики хроматиновой фибриллы в позиционировании элементов генома. Молекулярная биология 48, 386-94.

27. Ioudinkova E.S., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2014) Folded genome as a platform for the functional compartmentalization of the eukaryotic cell nucleus. Biopolymers and Cell 30, 83-9.

28. Гущанская Е.С., Артемов А.А., Ульянов С.В., Пенин А.А., Логачева М.Д., Разин С.В., Гаврилов А.А. (2014) Пространственная организация генов домашнего хозяйства в интерфазных ядрах. Молекулярная биология 48, 1008-18.

29. Golov A.K., Razin S.V., Gavrilov A.A. (2014) Nucleosomal Packaging of Eukaryotic DNA and the Regulation of Transcription. Biopolymers and Cell 30, 413-25.

30. Гаврилов А.А., Разин С.В. (2015) Компартментализация клеточного ядра и пространственная организация генома. Молекулярная биология 49, 26-45.

31. Разин С.В., Гаврилов А.А. (2015) Организация функциональных процессов в клеточном ядре: порядок, возникающий из беспорядка. Вестник Московского университета 3, 13-20.

32. Gavrilov A., Razin S.V., Cavalli G. (2015) In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics 14, 163-5.

33. Разин С.В., Гаврилов А.А., Ульянов С.В. (2015) Регуляторные элементы эукариотического генома, контролирующие транскрипцию. Молекулярная биология 49, 212-23.

34. Ulyanov S.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2015) Nuclear compartments, genome folding and promoter-enhancer communication. Int Rev Cell Mol Biol. 315, 183-244.

Тезисы конференций

35. Gavrilov A., Razin S.V. and Iarovaia O.V. Mapping of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C procedure reveals a complex organization of transcription factories. Workshop «Proteinnucleic acid interactions» of the International Research Training Group Gieen/Marburg-Moscow.

Lithuania, Vilnius, May 16-19, 2010,

Abstract

book, p. 30.

36. Gavrilov A., Razin S.V. and Iarovaia O.V. Mapping of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. International Symposium «Control of gene expression and cancer». Russia, Moscow, June 21-25, 2010, abstract book, p. 57.

37. Gavrilov A. M3C – a new technique to analyze the spatial proximity of nuclear matrix-bound DNA fragments. On-site evaluation of the DFG/RFBR funded International Research Training Group «Enzymes and multienzyme complexes acting on nucleic acids». Giessen, Germany, September 21, 2010, abstract book, p. 41.

38. Gavrilov A.A., Chetverina H.V., Chermnykh E.S., Chetverin A.B., Razin S.V. Active chromatin hub «zoomed-in»: visual demonstration of simultaneous interaction between promoters and distant regulatory elements. International symposium «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies»

of Transregional Collaborative Research Centre 81. Giessen, Germany, September 12-14, 2011, abstract book, p. 56.

39. E.S. Gushchanskaya, A.A. Gavrilov, S.V. Razin. Characteristic features of structural and functional organization of transcription factories in the eukaryotic nucleus. International symposium «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre 81. Giessen, Germany, September 12-14, 2011, abstract book, p. 59.

40. S.V. Ul’yanov, A.A. Gavrilov, and S.V. Razin. Сharacterization of spatial organization of the chicken beta-globin gene domain. International symposium «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre 81. Giessen, Germany, September 12-14, 2011, abstract book, p. 113.

41. Gavrilov A.A., Chetverina H.V., Chermnykh E.S., Chetverin A.B., Razin S.V. Quantitative analysis of DNA-DNA interactions in vivo by molecular colony technique. EMBO Conference Series «Nuclear Structure and Dynamics». L’Isle sur la Sorgue, France, September 28–October 2, 2011, abstract book, p. 36.

42. Гаврилов А.А., Гущанская Е.С., Киреев И.И., Яровая О.В., Разин С.В. Переосмысление метода 3С: лигирование в ядре, а не в растворе. Международная конференция «Хромосома 2012», Новосибирск, Россия, 2–7 сентября 2012, сборник тезисов, с. 73-74.

43. Gavrilov A.A., Razin S.V., Iarovaia O.V. Nuclear matrix as a platform for interaction of remote genomic elements: a new experimental approach. V International Meeting «Early events in human pathologies», 9-12 July 2012, Listvianka, Russia, abstract book, p.18.

44. Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A. Folded chromatin domain instead of an active chromatin hub: a model based on reconsidered essentials of the chromosome conformation capture procedure. XVI Gliwice Scientific Meetings; Gliwice, Poland, November 17-17, 2012, abstract book, p. 12.

45. Gavrilov A.A., Gushchanskay E.S., Kireev I.I., Iarovaia O.V., Razin S.V. Rethinking the 3C procedure: proximity ligation inside the nucleus. Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology «Genomic Instability and DNA Repair», Banff, Alberta, Canada, March 3 - 8, 2013, abstract book, p.143.

46. Gavrilov A.A., Golov A.K., Razin S.V. Low yield of 3C ligation products: technical issues or infrequent interaction between DNA regulatory elements? 38-th FEBS Congress «Mechanisms in biology», Saint Petersburg, Russia, July 6–11, 2013, FEBS Journal 280 (Suppl. 1), p.15.

47. Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Golov A.K., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A. Elusive active chromatin hubs: nuclear compartments, folded chromatin domains or rigid complexes of regulatory elements? 38th FEBS Congress «Mechanisms in biology», Saint Petersburg, Russia, July 6–11, 2013, FEBS Journal 280 (Suppl. 1), p.3-4.

48. Gushchanskaya E.S., Artemov A., Gavrilov A.A. Characterization of long range interactions of the chicken house-keeping gene ggPRX. 38-th FEBS Congress «Mechanisms in biology», Saint Petersburg, Russia, July 6–11, 2013, FEBS Journal 280 (Suppl. 1), p.18.

49. Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Golov A.K., Iarovaia O.V., Gavrolov A.A. The role of eukaryotic genome spatial organization in the regulation of transcription. 23th Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus, Debrecen, Hungary, August 19-24, 2013, abstract book, p.27.

50. Gavrilov A.A., Gushchanskaya E.S., Kireev I.I., Iarovaia O.V., Razin S.V. «In cage» 3C: revealing the principles of the proximity ligation. EMBO Conference Series «Nuclear Structure and Dynamics».

L’Isle sur la Sorgue, France, October 2–6, 2013, abstract book, p. 46.

51. Gavrilov A., Gushchanskaya E., Ulyanov S., Iarovaia O.V., Artemov A., Razin S.V. Spatial interaction of CpG islands in the interphase nucleus. FEBS EMBO Conference. Paris, France, August 30

– September 4, 2014, FEBS Journal 281 (Suppl. 1), p.311.

52. Gushchanskaya E.S., Artemov A.V., Ulyanov S.V., Logacheva M.D., Penin A.A., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. The spatial organization of eukaryotic genome. The 4-th International Conference on Science and Applied Research «Post-Genome Methods of Analysis in Biology and Laboratory and Clinical Medicine», Kazan, Russia, 29 october – 1 november, 2014, abstract book, p.45.



Похожие работы:

«Простейшие методы статистической обработки результатов экологических исследований © А.С.Боголюбов, Экосистема, 1998 В данном пособии приводятся простейшие методы статистической и математической обработки...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 27 (66). 2014. № 1. С. 112-126. УДК 578.52 + 577.216.9 + 632.951.1 + 632.951.2 СОВРЕМЕННЫЕ ИНСЕКТИЦИДЫ: ИХ П...»

«Государственная политика развивающихся стран в сфере ВИЭ: современное состояние и вызовы для России Баринова В.А., Ланьшина Т.А. РАНХиГС, Москва, Россия Баринова Вера Александровна – зам. директора Центра экономического моделирования энергетики и э...»

«ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНЫХ ИСПЫТАНИЙ В АКАДЕМИЧЕСКУЮ ГИМНАЗИЮ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА НА ПРОГРАММЫ СРЕДНЕГО ОБЩЕГО ОБРАЗОВАНИЯ ПО БИОЛОГИИ 10 класс Программа вступительных испытаний по биологии составлена на базе федерал...»

«EBRD Classification: INTERNAL Расширенное партнерство – Рамочный механизм модернизации городского транспорта Казахстан Страна: Номер проекта: 47035 Муниципальная и экологическая Хозяйственный сегмент: инфраструктура Государственный/частный Государственный сектор сектор:Экологическая категория: Дата прохождения Совет...»

«Российская Академия Наук Уфимский Научный центр Институт геологии Министерство Природных Ресурсов Российской Федерации Федеральное Агентство по недропользованию Управление по недропользованию по Республике Башкортостан Академия наук Респуб...»

«И ЗВЕСТИ Я В ЫСШИХ УЧ ЕБ НЫХ ЗАВЕДЕНИЙ №5 ЛЕ СНОЙ ЖУ РНАЛ 1998 УДК 630*453.768.24 А.К. АРТЮХОВСКИЙ Воронежская государственная лесотехническая академия Артюховский Анатолий Константинович родился в 1923 г., окончил в 1951 г. Воронежский лесохозяйственный институт, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, професс...»

««Утверждаю» Генеральный директор ОАО «ПО «Севмаш» Н.Я. Калистратов «_» 2010 г. Регистрационный № (по предприятию) № регистрации в Федеральной службе по экологическому, _ технологическому и атомному надзору ДЕК...»

«контроля. В ходе реализации программы целесообразно применение дидактической многомерной технологии и технологии тестового контроля, возможно использование фронтальных, групповых форм работы, работы в парах сменного состава. Для реализации программы используется у...»

«УДК 615.322 О. Ю. Кузнецова АУКСИНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ МЕЛАНИНОВ ГРИБА Inonotus obliquus (Pers.) Pil. Ключевые слова: ауксиноподобная активность, экстракты, меланины, гриб Inonotus obliquus (Pers.) Pil. Предложен новый способ оценк...»

«Бысыина Мария Федотовна ФЛОРА АЛАСНОЙ ЧАСТИ ЛЕНО-АМГИНСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ (ЦЕНТРАЛЬНАЯ ЯКУТИЯ) 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2009 Работа выполнена на кафедре ботаники ГО...»

«Полякова Галина Юрьевна НЕЗАВИСИМЫЕ КОМПОНЕНТЫ КОГНИТИВНЫХ ВЫЗВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ ПРИ ДЕПРЕССИВНОМ РАССТРОЙСТВЕ 03.03.01 Физиология 14.01.06 Психиатрия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук,...»

«Раздел первый Пол как биологическое явление ГЛАВА 1 Биологические аспекты половой дифференциации 1.1. Целесообразность и биологическое предназначение наличия в природе двух полов Биологическое предназна...»

«О ФИЗИКО-ИНФОРМАЦИОННОЙ МОДЕЛИ БИОСИСТЕМЫ В.И.Моисеев, 2015 Резюме. В статье исследуется вопрос биологической активности с точки зрения процессов сопряжения – параллельного протекания двух проце...»

«ГЛАСНИК СРПСКОГ ГЕОГРАФСKОГ ДРУШТВА BULLETIN OF THE SERBIAN GEOGRAPHICAL SOCIETY ГОДИНА 2014. СВЕСКА XCIVБр. 1 TOME XCIV Nо 1 YEAR 2014 Оriginal Scientific papers UDC: 913(4)(5) DOI: 10.2298/GSGD1401001A ЕВРАЗИЙСТВО: ИСТОКИ И СОВРЕМЕННОСТЬ А. А. АНОХИН1, Д. В. ЖИТИН1, А. И. КРАСНОВ1, С. С. ЛАЧИНИНСКИЙ1 * Санкт-Петербургски...»

«Клименко Ольга Евгеньевна НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ОПТИМИЗАЦИИ САДОВЫХ АГРОЦЕНОЗОВ СТЕПНОГО КРЫМА 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сот...»

«Пояснительная записка Статус документа Рабочая программа по биологии составлена на основе федерального компонента государственного стандарта основного общего образования, примерной программы основного общего образования и с учётом программы «Программы общеобразов...»

«ДОМНИНА Алиса Павловна ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ ЭНДОМЕТРИЯ КРЫС 03.03.04. – Клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., академик, Никольский Николай Николаеви...»

«ТРОФИМОВА АНАСТАСИЯ СЕРГЕЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЯ И УТИЛИЗАЦИИ ТБО В Г.ПАВЛОДАРЕ Специальность 6N0731 Безопасность жизнедеятельности и защита окружающей среды Диссертация на соискание академической степени магистра безопасности жизнедеятельности и защиты окруж...»

«Из решения Коллегии Счетной палаты Российской Федерации от 27 ноября 2009 года № 57К (694) «О результатах контрольного мероприятия «Проверка использования минерально-сырьевых ресурсов и средств, направленных на их воспроизводство, открытым акционерным обществом «Южно-Уральский никелевый...»

«РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПО БИОЛОГИИ Уровень общего образования (класс): среднее общее образование (10-11 кл) Количество часов: 85 Учебный год: 2015 2016 Программа разработана на основе авторской программы по биологии В.В.Пасечника СОДЕРЖАНИЕ Раздел 1. Поя...»

«37 14. Domnguez D., Montserrat-Sents B., Virgs-Soler A., Guaita S., Grueso J., Porta M., Puig I., Baulida J., Franc C., Garca de Herreros A. Phosphorylation regulates the subcellular location and activity of the snail transcriptional repressor. Mol. Cell Biol., 2003...»

«Некоммерческое партнерство «Негосударственная образовательная организация Высшего профессионального образования «ГУМАНИТАРНО-ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ» УТВЕРЖДЕНО Решением Ученого совета от 12 января...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.